Menyesuaikan Gangguan Morfomekanis Sel Melalui Nanopartikel Oksida Logam
Abstrak
Penggunaan nanopartikel (NP) yang berkembang saat ini dalam produk komersial tidak sesuai dengan pemahaman yang komprehensif tentang potensi bahayanya. Investigasi in vitro lebih lanjut diperlukan untuk membahas bagaimana sifat fisikokimia NP memandu penyerapannya di dalam sel dan perdagangan intraseluler, nasib, dan toksisitasnya. Interaksi nano-bio ini belum dibahas secara luas, terutama dari sudut pandang mekanis. Mekanik sel adalah indikator penting kesehatan sel karena mengatur proses seperti migrasi sel, integritas jaringan, dan diferensiasi melalui penataan ulang sitoskeleton. Di sini, kami menyelidiki in vitro gangguan elastisitas garis sel Caco-2 dan A549, dalam hal modifikasi modulus Young yang diinduksi oleh SiO2 NPS dan TiO2 NPS . TiO2 NP menunjukkan efek yang lebih kuat pada elastisitas sel dibandingkan dengan SiO2 NP, karena mereka menginduksi perubahan morfologis dan morfometrik yang signifikan dalam jaringan aktin. TiO2 NPS meningkatkan elastisitas dalam sel Caco-2, sementara efek sebaliknya telah diamati pada sel A549. Hasil ini menunjukkan adanya korelasi antara perubahan elastisitas sel dan toksisitas NP yang bergantung, pada gilirannya, pada sifat fisikokimia NP dan sel spesifik yang diuji.
Latar Belakang
Penggunaan besar nanopartikel rekayasa (ENPs) dalam produk komersial meningkatkan kesadaran tentang potensi toksisitasnya terhadap manusia dan lingkungan [1]. Banyak investigasi in vitro dan in vivo telah dilakukan sejauh ini dengan tujuan untuk menjelaskan mekanisme molekuler toksisitas [2, 3]. Namun, memahami interaksi antara nanopartikel (NP) dan organisme hidup agak sulit karena kurangnya prosedur operasi standar, yang mengakibatkan data literatur kontroversial saat ini tersedia [4, 5]. Ditetapkan bahwa efek samping NP sangat bergantung pada sifat fisikokimianya dan pada sel atau organisme tertentu yang diuji [6]. Untuk alasan ini, karakterisasi NP sangat penting untuk mencapai data yang andal [7]. NP oksida logam sebagian besar tersebar luas dalam produk komersial [8]. Di antaranya, SiO amorf2 NP dan kristal TiO2 NP digunakan dalam berbagai bidang industri sebagai aditif untuk obat-obatan dan kosmetik dan produk perawatan kesehatan, toner printer, cat, kemasan makanan, dan aditif makanan [9, 10]. Oleh karena itu, kemungkinan NP ini dapat mengakses organisme hidup melalui rute yang berbeda (penelanan, inhalasi, dan penetrasi dermal) [11]. Contohnya adalah, namun tidak terbatas pada, produk makanan berdasarkan TiO2 NP (berlabel E171 dalam label komersial) dan SiO2 NP (E551, E554, E556 dalam label komersial), yang memiliki pertumbuhan besar [12,13,14]. Studi saat ini tentang SiO2 NP dan TiO2 NP menunjukkan bahwa mereka secara aktif mengganggu mekanisme sel penting. Misalnya, mereka telah terbukti merangsang pelepasan sitokin (sehingga memicu peradangan) [15,16,17] merusak mikrovili usus [18, 19], menginduksi produksi ROS [20], menghambat sintesis ATP [21], dan menginduksi genotoksisitas [22,23,24,25,26]. Namun, sangat sedikit penelitian yang mengeksplorasi apakah NP ini berinteraksi dengan mekanika sel [27], topik yang memerlukan penyelidikan lebih lanjut. Adhesi sel dan penyusunan ulang sitoskeleton sangat penting untuk mempertahankan homeostasis sel [28]. Setiap perubahan dalam arsitektur sitoskeleton dapat mengganggu mekanika seluler dan mempengaruhi elastisitas sel dan dinamika migrasi [29]. Dalam penelitian ini, kami dengan hati-hati menilai efek biomekanik dari 20 nm SiO2 NP dan TiO2 NP pada sel Caco-2 dan A549, yang merupakan model terbaik yang menyerupai jaringan yang terpapar NP. Kami sebelumnya mengeksplorasi mekanisme masuknya, serta menilai viabilitas sel, kerusakan membran, dan produksi ROS bersama dengan aktivasi superoksida dismutase (SOD) dan malondialdehid (MDA). Kemudian, kami fokus pada karakterisasi perubahan elastisitas sel (modulus Young) pada inkubasi NP dengan mikroskop kekuatan atom (AFM). Hasil kami menunjukkan bahwa NP dapat menginduksi reorganisasi aktin kortikal yang signifikan, sebagaimana dikonfirmasi oleh perubahan modulus Young. Secara khusus, biokompatibilitas utama SiO2 NP terhadap toksisitas kronis TiO2 NP telah diamati. Pendekatan kami menggabungkan investigasi sitotoksisitas dengan karakterisasi biomekanik mewakili metode potensial baru untuk standarisasi protokol dalam penilaian toksisitas NP.
Metode
Sintesis SiO Amorf2 NP
Mikroemulsi W/O terner dibuat pada suhu kamar dengan mencampur air, pelarut organik (Cyclohexane, J.T. Baker), surfaktan (Triton X-100, Sigma-Aldrich) mengikuti metode Malvindi et al. [25]. Secara singkat, 880 μL Triton X-100, 3,75 mL sikloheksana, 170 mL air, dan 50 μL TEOS (98%, Sigma-Aldrich) dicampur dan diaduk selama 30 min. Kemudian, 30 μL NH4 OH (28,0-30,0%, Sigma-Aldrich) ditambahkan ke mikroemulsi. Setelah 24 h, suspensi dipisahkan dengan sentrifugasi (4500 rpm) diikuti dengan lima kali pencucian dalam etanol (98%, Sigma-Aldrich), dan miliQ air. Nanopartikel kemudian didispersikan dalam air.
Sintesis TiO2 NP
TiO2 NP disiapkan mengikuti metode sol-gel yang dijelaskan oleh Leena et al. [30] dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, titanium (IV) isopropoksida (TTIP; 99,9% Sigma-Aldrich) diteteskan dalam larutan etanol dan miliQ air (5:1:1) sambil diaduk dalam kondisi asam (pH 3). NP diinkubasi selama 5 jam pada suhu 30 °C terlebih dahulu dan kemudian pada 430 °C selama 3 jam untuk mendapatkan bubuk nano berwarna putih.
Karakterisasi TEM
Karakterisasi mikroskop elektron transmisi (TEM) dilakukan dengan mikroskop JEOL Jem 1011, yang beroperasi pada tegangan percepatan 100 Kv (JEOL USA, Inc.). Sampel TEM disiapkan dengan menjatuhkan larutan encer NP dalam air pada jaringan tembaga berlapis karbon (Formvar/Carbon 300 Mesh Cu).
Pengukuran DLS dan -Potensial
Rata-rata ukuran hidrodinamik dan potensial zeta SiO2 NP dan TiO2 NP ditentukan oleh hamburan cahaya dinamis (DLS) dan pengukuran potensial yang dilakukan pada Zetasizer Nano-ZS yang dilengkapi dengan laser HeNe 4,0 mW yang beroperasi pada 633 nm dan detektor fotodioda longsoran (Model ZEN3600, Malvern Instruments Ltd., Malvern, Inggris). Pengukuran dilakukan pada 25 °C dalam larutan berair dan dalam media kultur sel (DMEM, glukosa tinggi, Sigma-Aldrich) yang dilengkapi dengan FBS (Sigma-Aldrich) pada 10% dan 20% pH 7). Setiap sampel dijalankan tiga kali, menggunakan dua ulangan teknis independen, untuk mendapatkan nilai rata-rata pengukuran DLS dan -potensial.
Karakterisasi XRD
Difraksi sinar-X serbuk (XRD) untuk analisis fase kristal TiO2 NP dilakukan pada Rigaku, difraktometer dalam geometri refleksi Bragg-Brentano menggunakan radiasi Cu-Ka yang disaring. Pola XRD direkam dalam kisaran 2Q 20–80 dengan pemindaian bertahap, menggunakan peningkatan 2Q 0,02 dan waktu penghitungan tetap 2 s/langkah.
Budaya Sel
Caco-2 (ATCC® HTB-37™) dan A549 (ATCC® CCL-185™) dipertahankan dalam DMEM dengan glutamin 50 μM, dilengkapi dengan penisilin 100 U/mL dan streptomisin 100 mg/mL. Persentase FBS adalah 10% untuk A549 dan 20% untuk sel Caco-2. Sel diinkubasi dalam atmosfer terkontrol yang dilembabkan dengan rasio 95 hingga 5% udara/CO2 , pada 37 °C.
Penentuan Serapan Intraseluler SiO2 NPS dan TiO2 NP
10
5
Sel Caco-2 dan A549 diunggulkan dalam 1 mL medium di piring enam sumur. Setelah inkubasi 24 jam pada suhu 37°C, media diganti dengan media segar yang mengandung SiO2 NP dan TiO2 NP, pada konsentrasi 15 μg/ml dan 45 μg/ml. Setelah 48 h, 72 h, dan 96h inkubasi pada 37 °C, DMEM dihilangkan, dan sel dicuci empat kali dengan PBS (pH 7.4), untuk menghilangkan NP yang dapat terikat pada membran seluler. Sel ditripsinisasi dan dihitung menggunakan ruang hitung sel otomatis. Tiga ratus enam puluh ribu sel disuspensikan dalam 200 μL miliQ dan diperlakukan dengan HCl/HNO3 3:1 (v /v ) dan diencerkan menjadi 5 mL:larutan yang dihasilkan dianalisis untuk mengevaluasi kandungan Si dan Ti. Analisis unsur dilakukan dengan spektroskopi emisi atom plasma (ICP-AES) yang digabungkan secara induktif dengan spektrometer Varian Vista AX.
Pengujian WST-8
Sel Caco-2 dan A549 diunggulkan dalam lempeng mikro 96 sumur pada konsentrasi 5 × 10
3
sel / baik setelah 24 jam stabilisasi. Larutan stok NP (SiO2 NP dan TiO2 NPs) ditambahkan ke media sel pada 15 μg/ml dan 45 μg/ml. Sel diinkubasi selama 24 h, 48h, 72h, dan 96h. Pada titik akhir, viabilitas sel ditentukan menggunakan uji standar WST-8 (Sigma-Aldrich). Pengujian dilakukan mengikuti prosedur yang dijelaskan sebelumnya dalam De Matteis et al. [31]. Data dinyatakan sebagai mean ± SD.
Pengujian LDH
Sel Caco-2 dan A549 diperlakukan dengan SiO2 NP dan TiO2 NP mengikuti prosedur yang dilaporkan untuk uji WST-8. Uji laktat dehidrogenase (LDH) dilakukan pada pelat mikro dengan menerapkan reagen Uji Integritas Membran Homogen CytoTox-ONE (Promega), mengikuti instruksi pabrik. Media kultur dikumpulkan, dan kadar LDH diukur dengan membaca absorbansi pada 490 nm menggunakan spektrofotometer lempeng mikro Bio-Rad. Data dinyatakan sebagai mean ± SD.
Pengujian DCF-DA
Sel Caco-2 dan A549 diunggulkan dalam pelat mikro 96-sumur dan diperlakukan dengan SiO2 NP dan TiO2 NP pada konsentrasi akhir 15 μg/ml dan 45 μg/ml. Setelah 24 h, 48h, 72h, dan 96h interaksi sel-NP, uji DCF-DA (Sigma) dilakukan ke pelat mikro mengikuti prosedur yang dilaporkan oleh De Matteis et al. [32] Data dinyatakan sebagai mean ± SD.
Pengujian SOD
Caco-2 dan A549 (diinkubasi dengan 15 μg/ml, 45 μg/ml selama 24 h, 48h, 72 h, dan 96 h) ekstrak sel disiapkan sesuai dengan protokol yang dijelaskan dalam [33]. Pengujian dilakukan pada pelat mikro dengan menerapkan uji SOD (Cayman Chemical Company, Michigan, OH, USA) yang mengukur ketiga jenis SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD, dan FeSOD). Pengujian menggunakan garam tetrazolium untuk mendeteksi radikal superoksida yang dihasilkan oleh xantin oksidase dan hipoksantin. Satu unit SOD didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menunjukkan 50% dismutasi radikal superoksida. Aktivitas SOD diukur dengan membaca absorbansi pada 440–460 nm menggunakan spektrofotometer lempeng mikro Bio-Rad.
Pengujian MDA
Caco-2 dan A549 (diinkubasi dengan 15 μg/ml, 45 μg/ml selama 24 h, 48 h, 72 h, dan 96 h) ekstrak sel disiapkan sesuai dengan prosedur yang dijelaskan sebelumnya [33]. Pengujian dilakukan pada pelat mikro dengan menerapkan Lipid Peroxidation (MDA) Assay kit (Abcam):MDA dalam sampel direaksikan dengan asam tiobarbiturat (TBA) untuk menghasilkan adukan MDA-TBA. Rute ini melibatkan pengukuran spektrofotometri warna merah yang dihasilkan selama pembentukan aduk MDA-TBA, yang dapat diukur (dalam hal nmol/mg protein) dengan membaca absorbansi pada 532 nm menggunakan spektrofotometer lempeng mikro Bio-Rad.
Analisis CLSM
Sel diunggulkan di piring 24-sumur pada konsentrasi 10
5
sel/sumur dan diinkubasi berturut-turut dengan SiO2 NP dan TiO2 NP pada konsentrasi 15 μg/ml dan 45 μg/ml selama 24 h, 48h, 72h, dan 96h. Setelah perawatan, untuk setiap titik waktu, media yang mengandung nanopartikel dihilangkan dan sel dicuci tiga kali dengan PBS, difiksasi dengan glutaraldehid 0,25% (v /v di PBS, Sigma-Aldrich) selama 20 menit, dan akhirnya ditembus dengan 0,1% Triton (v /v dalam PBS, Sigma-Aldrich) selama 5 menit Untuk pewarnaan aktin, Phalloidin-ATTO 488 (Sigma-Aldrich) digunakan pada konsentrasi 1 g/ml selama 30 menit. Inti ditandai dengan menggunakan DAPI (Sigma-Aldrich) pada konsentrasi 1 μg/ml selama 7 min. Mikroskop confocal pemindaian laser dilakukan pada mikroskop confocal Zeiss LSM700 (Zeiss) yang dilengkapi dengan mikroskop terbalik Axio Observer Z1 (Zeiss) menggunakan × 100, lensa perendaman minyak aperture numerik 1,46 untuk pencitraan. File data confocal diproses menggunakan perangkat lunak ZEN2010 (Zeiss), dan kuantifikasi morfometrik (koherensi dan kepadatan terintegrasi F-aktin) dilakukan pada 15 sel, menggunakan perangkat lunak analisis ImageJ 1.47. Plugin OrientationJ digunakan untuk mengukur parameter koherensi dengan memilih urutan ROI tertentu dalam akuisisi confocal, berdasarkan ukuran tensor struktur di lingkungan lokal. Pada saat yang sama, perangkat lunak menghitung nilai orientasi dan koherensi yang mewakili sejauh mana serat aktin berorientasi:serat yang lebih tidak teratur memiliki nilai mendekati 0, sedangkan yang selaras sempurna menunjukkan nilai koherensi sekitar 1 [34]. Kepadatan terintegrasi juga dihitung dengan jumlah nilai piksel dalam ROI pada akuisisi confocal untuk mengukur jumlah serat aktin dalam sel.
Analisis AFM
Sel Caco-2 dan A549 diunggulkan dalam cawan Petri plastik (Corning) dengan konsentrasi 10
5
sel / sumur dan tumbuh sampai 70-80% pertemuan. Sel kemudian diperlakukan dengan 45 μg/ml TiO2 NPS dan SiO2 NP dalam DMEM selama 72 h. Berturut-turut, NP dihilangkan dan sel-sel dicuci dengan PBS. Sel difiksasi menggunakan glutaraldehid 0,25% selama 20 menit, diikuti dengan pencucian dengan PBS. Pengukuran dilakukan dengan mikroskop probe pemindaian canggih (Bioscope Catalyst, Bruker Inc., USA) yang dipasang pada mikroskop optik terbalik (Zeiss Observer Z1, Zeiss GERMANY). Seluruh sistem ditempatkan pada dasar yang bertindak sebagai isolator sehubungan dengan getaran mekanis lingkungan. Eksperimen AFM dilakukan dalam mode gaya-volume dengan menggunakan Bruker's Sharp Microlever (MSNL, tip C) berbentuk V:kantilever silikon nitrida sensitivitas tinggi dengan konstanta pegas nominal 0,01 N/m. Nilai ini diperkirakan secara akurat dengan metode thermal tune [35] sebelum melakukan akuisisi AFM. Parameter yang digunakan adalah sebagai berikut:scan area 50 μm, ramp rate 3 Hz, FV scan rate 0.03 Hz, trigger threshold 100 nm, jumlah sampel 128, sampel per baris 64, dan baris 64. Modulus Young (E) ditentukan pada 20 sel, dari mana 25 kurva gaya-jarak diekstraksi dalam korespondensi area nuklir dan 25 kurva di wilayah sitoplasma. Data pendekatan (dari titik kontak ke nilai gaya maksimum) yang diturunkan dari kurva yang diekstraksi dilengkapi dengan model Sneddon yang dimodifikasi:
dimana z dan c adalah data pembebanan eksperimental (tinggi dan defleksi kantilever, masing-masing), α adalah setengah sudut ujung, kc adalah nilai konstanta elastis kantilever, dan ν adalah rasio Poisson (diasumsikan 0,5 untuk sampel biologis). Dalam algoritma fit, titik kontak diperlakukan sebagai variabel fit dan gaya adhesi diperhitungkan diperoleh pada 20 sel.
Analisis Statistik
Data dinyatakan sebagai nilai rata-rata dan standar deviasi terkait. Perbedaan antara nilai rata-rata yang berbeda dianggap signifikan secara statistik dalam melakukan t . Siswa uji dengan p nilai 0,05 (< 0,05*, < 0,01**, dan < 0,005***).
Hasil
Karakterisasi SiO2 NP dan TiO2 NP
SiO2 NP dan TiO2 NP telah disintesis dengan rute sintetis yang berbeda dan dapat direproduksi untuk mendapatkan NP yang memiliki distribusi ukuran yang sempit dan terkontrol (lihat bagian "Metode"). Kemudian, NP dikarakterisasi secara mendalam dengan menggunakan TEM, DLS, -potensial, dan XRD, baik dalam air maupun dalam media kultur sel (DMEM) dengan konsentrasi sumber protein (FBS) yang berbeda. Ini sangat penting, karena protein media dapat menutupi permukaan NP, sehingga mengubah sifat fisikokimia dan, karenanya, efek biologisnya [36]. Analisis TEM menunjukkan bahwa SiO2 NP berbentuk bola, dengan diameter rata-rata 20 ± 2 nm (Gbr. 1a). TiO2 NP memiliki ukuran yang sama (25 ± 5 nm), tetapi morfologinya berbeda (Gbr. 1). Pengukuran DLS yang dilakukan dalam air pada 96 h mengonfirmasi radius hidrodinamika 21 ± 7 nm dan 27 ± 12 nm untuk SiO2 NP dan TiO2 NP, masing-masing (Gbr. 1b dan Gbr. 1e). Seperti yang diharapkan, data ini sesuai dengan pengamatan TEM. Analisis -Potensial juga mengkonfirmasi nilai muatan permukaan dalam air sebesar 45 ± 3 mV untuk SiO2 NP dan 50 ± 3 mV untuk TiO2 NP (Gbr. 1c, f). Seperti yang diharapkan, sifat fisikokimia NP berubah setelah inokulasi dalam media kultur sel. DLS mengkonfirmasi peningkatan yang signifikan dalam ukuran NP terutama dengan adanya DMEM yang dilengkapi dengan 20% FBS (Tabel 1). Secara khusus, SiO2 NP menunjukkan ukuran 29 ± 9 nm, sedangkan TiO2 NP meningkat hingga 41 ± 14 nm setelah 96 h. Pembesaran puncak DLS yang diamati dalam pengukuran DMEM (dengan atau tanpa FBS) adalah tanda aglomerasi NP, yang dapat dipromosikan oleh kekuatan ionik medium (data tidak ditampilkan). Selain itu, pengukuran -potensial menunjukkan bahwa muatan permukaan kedua NP bergeser ke nilai yang lebih negatif. Fenomena bergantung waktu yang besar ini disebabkan oleh pembentukan korona protein yang cukup stabil [37, 38] yang diinduksi oleh adanya protein serum dalam media kultur sel yang diadsorpsi pada permukaan NP:ukuran dan muatan NP berubah sebagai fungsi konsentrasi FBS.
Karakterisasi SiO2 NP dan TiO2 NP dalam air. a –d Gambar TEM representatif. b –e Hamburan cahaya dinamis (DLS) dan c –f pengukuran -potensial. g Analisis difraksi sinar-X (XRD) pola TiO2 NP
Pola XRD TiO2 NPS , dikalsinasi pada 430 °C, menunjukkan campuran fase kristal anatase dan rutil (Gbr. 1g) . Puncak dominan pada 2θ = 25,4° (101), 48,1° (200), 54,1° (211), 62,4° (204), dan 68,8° (116) berbeda dari fase anatase yang cocok dengan data JCPDS standar ( nomor kartu:21–1272). Fase rutil direpresentasikan dengan puncak difraksi pada 27,5° (110), 36,2° (101), dan 41,2° (111).
Serapan NP di Sel Caco-2 dan A549
Untuk menghitung jumlah SiO2 NP dan TiO2 NPS diambil oleh sel, kami melakukan analisis unsur ICP-AES atas sel yang lisis sebagai penyelidikan awal. Sel diperlakukan dengan 15 μg/ml dan 45 μg/ml NP. Data eksperimen mengkonfirmasi keberadaan SiO2 NP dan TiO2 NP di kedua garis sel, dengan efisiensi internalisasi yang bergantung pada waktu (Gbr. 2a). TiO2 NP menunjukkan penyerapan yang lebih besar sehubungan dengan SiO2 NP. Hal ini terutama terlihat pada Caco-2, di mana kandungan Ti mencapai konsentrasi intraseluler masing-masing sebesar 8,2 ± 0,4 μg dan 9,7 ± 0,031 μg setelah 72 jam dan 96 .. Jumlah Ti yang terdeteksi di A549 lebih rendah, karena kami menemukan 5 ± 0,599 μg setelah 72 jam dan 7,12 ± 0,11 μg setelah 96 jam waktu inkubasi. SiO2 NP lebih sedikit diambil oleh sel dibandingkan dengan TiO2 NP, bahkan jika internalisasi lebih menonjol di Caco-2. Juga dalam hal ini, sebenarnya, jumlah SiO yang terinternalisasi2 NP dalam sel Caco-2 adalah 4,69 ± 0,031 μg setelah 72 h dan 5,78 ± 0,045 g setelah 96 h inkubasi. Nilai menurun di A549, di mana kami menghitung 2,58 ± 0,045 μg setelah 72 jam dan 4,7 ± 0,04 g setelah 96j.
TiO2 NP dan SiO2 Akumulasi NP dalam garis sel Caco-2 dan A549 yang terpapar 15 μg/ml dan 45 μg/ml TiO2 NP dan SiO2 NP untuk 24 h, 48h, 72h, dan 96h. Sel kemudian dipanen, sel hidup dihitung, dan kandungan Ti dan Si diukur dalam 360.000 sel (μg Ti dan g Si). Data dilaporkan sebagai mean ± SD dari tiga percobaan independen; signifikansi statistik sel yang terpapar vs. sel kontrol untuk p nilai < 0,05 (< 0,05*, < 0,01**, dan < 0,005***)
Efek NP pada CaCo-2 dan A549:Viabilitas Sel, Kerusakan Membran, dan Produksi ROS
Viabilitas sel Caco-2 dan A549 dievaluasi dengan uji WST-8. Perlakuan dengan SiO2 NP dan TiO2 NP menginduksi sedikit pengurangan viabilitas yang bergantung pada dosis pada kedua garis sel yang diuji (Gbr. 3). TiO2 NP menginduksi sitotoksisitas yang ditingkatkan sehubungan dengan SiO2 NP, dan viabilitas sel CaCo-2 lebih terpengaruh daripada A549, setelah pengobatan dengan TiO2 NP. Secara khusus, kami mengamati penurunan viabilitas sekitar 40% pada Caco-2 yang diobati dengan 45 μg/ml TiO2 NP untuk 72 h. Pengurangan ini selanjutnya turun hingga 50% setelah 96 h, sedangkan, pada garis sel A549, TiO2 NP menginduksi pengurangan 30% viabilitas hanya setelah 96 jam pengobatan. Pelepasan LDH dan produksi ROS dievaluasi dalam sel Caco-2 dan A549 setelah terpapar TiO2 NP dan SiO2 NP. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, b, NP menginduksi pori membran sel (dan memang pelepasan LDH) sesuai dengan hasil viabilitas. Efeknya lebih jelas pada Caco-2 sehubungan dengan A549 terutama pada TiO2 Perawatan NP, pada titik waktu tertinggi (72 dan 96 h). Persentase pelepasan LDH mencapai peningkatan sekitar 160% sehubungan dengan sel (kontrol) yang tidak diobati, setelah 96 jam paparan. Generasi ROS telah dipelajari secara liar karena merupakan salah satu efek utama yang diinduksi oleh NP [39]. Fenomena ini mengganggu respon pertahanan antioksidan biologis [40], meskipun penting disebutkan bahwa mekanisme aksi nyata masih dalam penyelidikan. Potensi stres oksidatif yang diinduksi NP diperkirakan dengan uji DCFH-DA. Seperti yang diharapkan, interaksi antara NP dan sel merangsang pembentukan ROS, dengan cara yang bergantung pada dosis dengan efek kuat pada Caco-2 pada TiO2 Perawatan NP (Gbr. 4c, d). Persentase pelepasan mencapai nilai 165% sehubungan dengan sel kontrol, pada konsentrasi tertinggi yang diuji.
Uji viabilitas (WST-8) dari Caco-2 (a ) dan A549 (b ) sel setelah 24 h, 48h, 72 h, dan 96h paparan dua dosis (15 μg/ml dan 45 μg/ml) TiO2 NP dan SiO2 NP. Viabilitas sel yang diobati dengan NP dinormalisasi menjadi sel kontrol yang tidak diobati. Sebagai kontrol positif (P), sel diinkubasi dengan 5% DMSO (data tidak ditampilkan). Data yang dilaporkan sebagai mean ± SD dari tiga eksperimen independen dianggap signifikan secara statistik dibandingkan dengan kontrol (n = 8) untuk p nilai < 0,05 (< 0,05*, < 0,01**, dan < 0,005***)
LDH (a –b ) dan ROS (c –d ) pengujian pada sel Caco-2 dan A549. Sel diinkubasi dengan 15 μg/ml dan 45 μg/ml TiO2 NP dan SiO2 NP untuk 24 h, 48h, 72h, dan 96h. Persentase kebocoran LDH dari sel yang diobati dengan nanopartikel diekspresikan relatif terhadap sel kontrol yang tidak diobati. Kontrol positif (P) terdiri dalam pengobatan sel dengan 0,9% Triton X-100 menunjukkan ca. Peningkatan LDH 500% (data tidak ditampilkan). Tingkat ROS tercatat mengekspos sel Caco-2 dan A549 dengan 15 μg/ml dan 45 μg/ml TiO2 NP dan SiO2 NP selama 24 h, 48h, 72 h, dan 96 h diinkubasi dengan 100 μM DCFH-DA. Fluoresensi sel diukur. Sebagai kontrol positif (P), sel diinkubasi dengan 500 μM H2 O2 menunjukkan ca. 300% peningkatan DCFH-DA (tidak ditampilkan). Data yang dilaporkan sebagai mean ± SD dari tiga eksperimen independen dianggap signifikan secara statistik dibandingkan dengan kontrol (n = 8) untuk p nilai < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, dan < .005***)
Efek yang Diinduksi oleh NP pada Aktivitas Antioksidan dan Peroksidasi Lipid pada Sel Caco-2 dan A549
Enzim SOD terlibat dalam sistem pertahanan antioksidan setelah induksi stres oksidatif. Enzim ini mengkatalisis dismutasi superoksida yang sangat reaktif (O2
•−
) anion menjadi peroksida H2 O2 [41]. Kami mengamati penurunan aktivitas enzim SOD yang bergantung pada dosis pada Caco-2 dan A549 setelah inkubasi dengan SiO2 NP dan TiO2 NP (15 μg/ml, 45 μg/ml) pada titik waktu yang berbeda (dari 24 hingga 96 h) (Gbr. 5a, b). Sesuai dengan penilaian sitotoksisitas, efeknya lebih jelas pada Caco-2 pada TiO2 paparan NP. Misalnya, tingkat aktivitas SOD berkurang dari 4,1 ± 0.2 U/ml pada kontrol menjadi 1,03 ± 0,325 U/ml dalam sel Caco-2 yang terpapar 45 μg/ml TiO2 NP, setelah 96 h. Paparan konsentrasi yang sama dari SiO2 NP mengurangi aktivitas SOD menjadi 1,45 ± 0,12 U/ml. Uji berbasis MDA digunakan untuk memeriksa potensi peroksidasi lipid yang dimediasi ROS, yang pada gilirannya merupakan cara lain untuk memeriksa stres oksidatif sel. [42] Tingkat seluler MDA tumbuh setelah terpapar dua jenis NP untuk Caco-2 dan A549 (Gbr. 5c, d). Seperti yang diharapkan, peningkatan level MDA sebanding dengan konsentrasi dan waktu pemaparan.
a –d Uji SOD dan MDA pada sel Caco-2 dan A549. Sel diinkubasi dengan 15 μg/ml dan 45 μg/ml TiO2 NP dan SiO2 NP untuk 24 h, 48h, 72h, 96h. Uji SOD menggunakan garam tetrazolium untuk mendeteksi radikal superoksida yang dihasilkan oleh xantin oksidase dan hipoksantin. Kurva standar digunakan sebagai kontrol positif (data tidak ditampilkan). Tingkat MDA dideteksi dengan kuantifikasi adukan MDA-TBA (OD =532 nm). Data yang dilaporkan sebagai mean ± SD dari tiga eksperimen independen dianggap signifikan secara statistik dibandingkan dengan kontrol (n = 8) untuk p nilai < 0,05 (< 0,05*, < 0,01**, dan < 0,005***)
Efek Morfomekanis yang Diinduksi oleh NP
Analisis mikroskop confocal Caco-2 dan A549 diinkubasi dengan 15 μg/ml dan 45 μg/ml SiO2 NP dan TiO2 NP untuk 24 h, 48h, 72h, dan 96h dilaporkan pada Gambar. 6 dan 7. Kontrol Sel Caco-2 menunjukkan morfologi yang mirip dengan enterosit usus dengan tight junction dan brush border di sisi apikal [43]. Setelah perawatan dengan NP, sambungan ketat sel runtuh dan pola sel diisolasi, dengan bentuk memanjang. Efek ini lebih jelas ketika sel diperlakukan dengan TiO2 NP pada 45 μg/ml selama 72 jam waktu inkubasi, menunjukkan perubahan pola aktin yang relevan, serta perubahan morfologi sel. Sel A549 yang tidak diobati menampilkan bentuk seperti kerikil dan adhesi sel-sel fungsional [44], sedangkan pengobatan dengan NP menurunkan kontak sel-sel dan memodifikasi morfologi sel ke arah bentuk yang lebih memanjang. Gambar 8 menunjukkan gambar confocal yang diperbesar, yang memungkinkan pendeteksian perubahan dalam distribusi aktin. Perubahan organisasi jaringan aktin setelah paparan NP (72 h dari 45 μg/ml SiO2 NP dan TiO2 NP) dianalisis secara kuantitatif dengan kepadatan fluoresensi dan koherensi menggunakan perangkat lunak ImageJ (Gbr. 9). Kami secara khusus memilih dua parameter ini karena kepadatan terintegrasi memungkinkan kami untuk mengukur jumlah aktin, sementara koherensi memberi kami informasi tentang tingkat orientasi serat dibandingkan dengan lingkungan [45]. Sel Caco-2 yang tidak diobati memiliki nilai kepadatan 129,4 ± 16, dan ini tetap tidak terpengaruh pada perawatan NP; nilainya adalah 127,7 ± 20 dan 128,5 ± 18 setelah terpapar SiO2 NP dan TiO2 NP, masing-masing, Gambar. 9a). Demikian pula, kepadatan jaringan yang diwarnai aktin tetap sama pada A549 sebelum dan sesudah perlakuan (68,4 ± 14, 67,9 ± 15, dan 67,7 ± 18 untuk kontrol negatif, SiO2 NP, dan TiO2 NP, masing-masing, Gambar. 9b). Meskipun perawatan NP tidak menginduksi perubahan jumlah aktin, analisis koherensi menyarankan reorganisasi spasial aktin yang berbeda. Dalam Caco-2, nilai koherensi sel yang dirawat untuk SiO2 NP (0,16 ± 0,04) dan untuk TiO2 NP (0.09 ± 0.02) treatment decreased with respect to that of the control (0.26 ± 0.03) (Fig. 9c). Even the A549 cells underwent a decrease of coherency after interacting with SiO2 NPs and TiO2 NPs (0.2 ± 0.07 and 0.158 ± 0.04) compared to the control cells (0.4 ± 0.03) (Fig. 9d). Hence, NPs induced a significant reorganization of actin network, which showed an actin isotropic orientation, but they did not change the overall quantity of actin expressed. In addition to cytoskeletal rearrangements, we also analyzed the area described by the nucleus/cytoplasm ratio. Values of N/C ratio were calculated as the ratio between nuclear area and the whole cellular area (measured performed on 15 cells). We observed opposite values following the treatment with 45 μg/ml of NPs for 72 h with significant statistical validity. In particular, the ratio was (0.40 ± 1.7) in untreated Caco-2 cells, and this increased up to 0.554 ± 0.09 and 0.62 ± 0.12 after SiO2 NP and TiO2 NP exposure (Fig. 9e). The trend was different in A549. The nuclear/cytoplasm ratio dropped down upon exposure to NPs from values of 0.550 ± 0.04 for control cells to 0.334 ± 0.06 for SiO2 NPs and 0.225 ± 0.09 for TiO2 NP. After the morphological investigations, we analyzed the elastic properties of cells after exposing them to 45 μg/ml of SiO2 NPs and TiO2 NPs for 72 h by AFM, in force–volume mode. We measured the different elasticity expressed by Young’s modulus values in the nuclear and cytoplasmic region. Caco-2 cells displayed Young’s modulus value of 105 ± 25 kPa for nuclear region and 47 ± 21 kPa for the cytoplasm. After SiO2 NP treatment, we observed a reduction of value to 42 ± 8 kPa for the nucleus and 19.59 ± 2 kPa for the cytoplasm. The effects were more evident after treatment with TiO2 NPs:the Young modulus for the nucleus was 27 ± 4 kPa and 18 ± 4 kPa for the cytoplasm (Fig. 10a). We found an opposite outcome concerning the elastic properties of A549 cells. In this case, Young’s modulus was 129 ± 24 kPa for the nuclear region and 147 ± 26 kPa for the cytoplasmic area. After SiO2 NP treatment, the values of elasticity increased to 152 ± 23 kPa for nucleus and 152 ± 25 kPa for cytoplasm. When cells were doped with TiO2 NPs, Young’s modulus values drastically increased to 372 ± 60 kPa for nucleus region and 549 ± 40 kPa for cytoplasmic region (Fig. 10b).
Effects of SiO2 NPS and TiO2 NPs on actin network of Caco-2 cells. Caco2 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; cells were fixed and then stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)
Effect of SiO2 NPS and TiO2 NPs on actin network on A549 cells. A549 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; successively they were fixed and stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)
Local enlargement of confocal acquisitions acquired in Figs. 6 and 7 showed (more in details) the effect of SiO2 NPS and TiO2 NPs on actin network of Caco-2 and A549 cells after the exposure of 45 μg/ml of NPs for 72 h and 96 h
Integrated density (a , b ) and coherency (c , d ) for Caco-2 and A549 cells treated with 45 μg/ml of SiO2 NPs and TiO2 NPs after 72 h. The integrated density and coherency values were expressed as a mean value and relative SD, calculated from confocal acquisitions by ImageJ (calculation on 15 cells). The mean values and their standard deviations were reported in the histograms. Results were statistically significant for p < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***). e Analyses of nucleus/cytoplasm ratio on Caco-2 and A549 after exposure to 45 μg/ml of SiO2 NPs and TiO2 NPs for 72 h. The ratio was calculated on 15 cells by ImageJ. The mean values and the SD were reported in the histogram. Results were statistically significant for p < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***)
Young’s modulus values expressed in kPa, calculated from the nuclear region and the cytoskeletal area of Caco-2 (a ) and A549 (b ) cell lines after a treatment to 45 μg/ml of SiO2 NPs and TiO2 NPs for 72 h
Discussion
The spread of different kind of ENPs in several fields raises awareness about the importance to assess their potential toxicity in living organisms and the environments as well, taking into account their potential application in biomedical field [46,47,48]. In vitro and in vivo investigations are crucial to enrich the scientific knowledge and to release reliable clinical and epidemiological data [49]. The toxicity tests performed on different cells are considered the golden standard to assess the safety of NPs. However, few studies have investigated the interactions between NPs and cells from a biomechanical point of view. Cell mechanic is an important factor that influences many cellular pathways, including apoptosis, differentiation, migration, cancer metastasis, and wound healing [50]. In our work, we have addressed this point and related cell viability with the changes in mechanical properties of cells treated with different NPs. Firstly, we synthetized amorphous SiO2 NPs and crystalline TiO2 NPs with a size of c.a. 20 nm. NPs were stable in water and DMEM up to 96 h, even upon incubation with 10% and 20% of FBS. This was found to induce an increase in NPs size due to the formation of protein corona, in perfect agreement with the literature data. [51]. Since the entry route of NPs often occurs through inhalation and ingestion, we opted to investigate the potential effects on Caco-2 and A549 cells, which are representative models for the intestinal tract and airways mimicking oral and inhalation uptake [52]. As primary investigation, we quantified the cellular internalization of SiO2 NPs and TiO2 NPs by elemental analysis. The most effective uptake was observed in Caco-2 cells, especially upon treatment with TiO2 NPs in a time-dependent manner. It has been reported that amorphous SiO2 NPs, with a small size range of 15–20 nm, can bind the plasma membrane and then passively pass across the lipid bilayer to get access into the cells [53]. As demonstrated in A549 [54] and Caco-2 [55], in fact, small SiO2 NPs can translocate in the cytoplasm with no apparent membrane encapsulation. The anatase crystalline form of TiO2 NPs is the more chemically reactive [56] showing a faster absorption with respect to rutile, as previously reported [32]. However, the uptake mechanisms of Caco2 are still unclear, despite that some hypothesis have been formulated, some of these include metal ion release upon NPs degradation in the intestinal barrier lumen or/and direct uptake by endocytosis. [57]. In A549 cells, TiO2 NPs were localized in cytoplasm and close the nucleus region [58]. We used WST-8 assay to assess the influence of different concentrations of SiO2 NPs and TiO2NPs on cell viability. We have observed a general decrease of viability, especially in Caco-2, with TiO2 NPs displaying the strongest toxicity. After assessing the viability, we monitored the extracellular release of the cytoplasmic enzyme LDH. We confirmed that the NPs induced an extensive membrane damage, which relates also to the increase of intracellular ROS levels, resulting in oxidative stress. In this context SOD, which acts as strong antioxidant against ROS [59], was significantly reduced most probably because of the unbalance of the redox repair systems. In addition, the oxidative stress increased the lipid peroxidation [60], as demonstrated by MDA measurements after NPs incubation. This is particularly evident in Caco-2 cells after TiO2 NP exposure. It is worth mentioning that this effect can decrease membrane fluidity, which can further explain the observed higher entry levels of the TiO2 NPs [61]. This was in significant accordance with the intracellular oxidative stress levels measured by SOD inhibition, as well as with the reactive oxygen species generation. After these assessments, we investigated the modulation of the cell cytoskeleton, as an increase of intracellular ROS could affect the F-actin organization [62]. The cytoskeleton is characterized by a set of filaments (actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments) organized in a network that affects the mechanical properties of cells, as well as their behavior [29]. In particular, actin filaments are crucial for cell mechanics, and any alterations may induce aberrations in cell morphology under sub-toxic conditions [63]. It has been demonstrated that actin was one of the most commonly bound protein by SiO2 NPs and TiO2 NPs in cellular extracts. This definitely suggests that the actin functions, as well as cell motility and organelles trafficking, can be strongly affected by the presence of these NPs [64, 65]. As a further proof, several in vivo studies have revealed the potential of NPs to induce alterations in the expression of genes related to the cytoskeleton [63]. In order to understand how NPs modulate the cytoskeleton, we performed qualitative and quantitative confocal analyses on Caco-2 and A549 cells, after SiO2 NP and TIO2 NP treatment. We focused on actin stress fibers and cortical actin because they allowed to maintain the physiological mechanical architecture of cells. As reported in Figs. 4 and 5, the treatment with NPs induced a significant reorganization of actin. This was more evident after 72 h of treatment with 45 μg/ml of NPs, and especially with the use of TiO2 NP. The adverse effects were stronger in intestinal cells, where we have observed the formation of protrusions and philopodia at the plasma membrane level, together with the disruption of tight junctions. Fluorescence coherency and fluorescence density have been used as quantitative parameters to assess alterations of actin distribution in the cytoskeleton. While coherency gives information about the organization of actin, density quantifies the levels of fluorescent actin. Caco-2 and A549 exposed to NPs showed a reduction of coherency compared to untreated cells, especially upon incubation with TiO2 NP. This was in good agreement with the qualitative confocal imaging analyses. The fluorescence density of actin was not altered by NP treatment in both the cell lines, even if untreated Caco-2 cells showed higher values with respect to untreated A549. These data could suggest a potential difference in the amount of actin, which is dependent on>the specific cell type. We also evaluated the nucleus-to-cytoplasm ratio as the relative area of the nucleus over the whole cell. We confirmed a reduction of values in A549 and an increase of the ratio in Caco-2 with respect to the control cells. This indicates changes in cell morphology after NP treatment:Caco-2 underwent an increase of nucleus area, whereas A549 became larger through cytoplasm extension. As a final point, we explored any potential change in cell elasticity upon NP treatment. Cell elasticity is commonly expressed by Young’s modulus (E), which is a ratio between the stress and the applied strain (with unit in Pascal) [66, 67]. Changes in cell elasticity due to cytoskeleton reorganization is often associated to disease progression [68], hence (E) can be a refined indicator of potential pathological states [67]. The deformability of cells was measured through indentation experiments by AFM [69]. Many studies showed the detrimental effects of NPs on the F-actin that induced an enhancement of cell elasticity. However, a clear relation between change in cell stiffness, actin rearrangement and cell viability has not been clearly established yet. Here, we have covered such topic and found that Caco-2 and A549 cells significantly change their (E) upon NP treatment, even though in two different ways. Caco-2 cells are softer as confirmed by the decreased Young’s modulus, which has been found to be a function of both the NPs type and the cell regions analyzed. In particular, TiO2 NPs induced a general enhancement of elasticity, and this effect is more evident in the nuclear regions rather than the cytoplasmic one. On the other side, A549 displayed a remarkable increase of Young’s modulus after TiO2 NP exposure in cytoplasm region, compared to control cells (594 ± 40 kPa versus 146 ± 26 kPa, respectively). These data indicated that TiO2 NPs induce dose-dependent changes in force–deformation profiles in both cell lines, whereas SiO2 NPs showed little effects. The decrease of Young’s Modulus, and consequently an increase of elasticity after NPs exposure, can potentially impact cell homeostasis and physiological pathways. The reorganization F-actin, together with a reduction of coherency, showed a strong modulation of mechanical cell properties. NPs have been demonstrated to make the nuclear region of Caco-2 cells softer than untreated cells. The increase of elasticity (corresponding to a reduction of Young’s modulus) is a critical factor in tumor progression, because it is an indicator of disruption of cell junctions, which promotes in turn cell migration and metastatization [70]. Therefore, the treatment with NPs on Caco-2 (and TiO2 NPS in particular) can potentially promote migration due to change of elastic properties and deformability of cells. Also, the larger and softer nucleus area can be associated to cancer progression [71].
Conclusion
In this paper, we careful assessed the adverse effects of SiO2 NPs and TiO2 NPs on two different cell lines (Caco-2 and A549), mimicking the typical tissue that are exposed to NPs (ingestion and inhalation). SiO2 NPs presented a low cytotoxicity in comparison with TiO2 NPS. We demonstrated how the cellular exposure to high doses of NPs induced morphostructural changes in term of actin reorganization, coherency, density and nucleus/cytoplasm ratio, which were more evident upon TiO2 NP treatment. Cell membrane deformability measurements showed different behavior in the two cells. In Caco-2, the cell elasticity increased after NP treatment, whereas A549 displayed an increase of stiffness. These results demonstrated that NPs induce modifications of cytoskeleton structures and, as consequence, a different Young’s Modulus values. Hence, the phenotype of cancer cells can turn into a more invasive profile, characterized by enhanced migration. On the other side, the increased stiffness observed in A549 might not promote the mobility of this specific cell indeed. We are sure that the analysis of cell mechanics upon NP exposure, combined with standard toxicological assays, will represent a golden standard to accurately assess the safety of NPs and to predict any potential possible diseases triggered by NPs.
Singkatan
A549:
Human adenocarcinoma alveolar basal epithelial cells
