Modulasi Mekanik Sel yang Diinduksi Nanopartikel: Analisis Komparatif Efek SiO₂ dan TiO₂ pada Sel Caco-2 dan A549

Abstrak

Peningkatan penggunaan nanopartikel (NP) dalam produk konsumen telah melampaui evaluasi keamanan yang komprehensif. Studi ini menyelidiki bagaimana atribut fisikokimia SiO₂ dan TiO₂ NP mempengaruhi penyerapan sel, pengiriman intracelular, dan gangguan mekanik pada dua model in vitro yang klinis relevan—Caco-2 (epitel usus) dan A549 (epitel alveoler). Kami mengukur internalisasi NP melalui ICP-AES, menilai sitotoksisitas dengan uji WST-8 dan LDH, mengukur stres oksidatif (ROS, SOD, MDA), dan mengevaluasi remodeling skema aktin melalui mikroskopi konfokal. Mikroskopi gaya atom (AFM) menentukan perubahan modulus Young di kompartemen nukleus dan sitoplasma. TiO₂ NP menunjukkan penyerapan sel yang lebih tinggi, generasi ROS yang terpronis, dan reorganisasi aktin yang signifikan, yang mengarah pada peningkatan kekakuan dalam sel A549 dan penurunan kekakuan dalam sel Caco-2. Perubahan biomekanik ini berkorelasi dengan sitotoksisitas yang diinduksi NP dan menyoroti pentingnya mengintegrasikan titik akhir mekanik dalam protokol nanotoxikologi.

Latar Belakang

Nanopartikel terdesain (ENP) ada di mana-mana dalam farmasi, kosmetika, aditif makanan, dan formulasi industri, yang mengangkat kekhawatiran tentang jalur paparan manusia dan lingkungan (ingestasi, inhalasi, dermis). Toksisitas ENP sangat dipengaruhi oleh ukuran, bentuk, kimia permukaan, dan status kristal, namun metode penilaian standar masih terbatas, yang berkontribusi pada literatur yang bertentangan [1–5]. Nanopartikel oksida logam, terutama SiO₂ amorf dan TiO₂ kristal, banyak digunakan karena stabilitas optik dan kimia, namun bukti menunjukkan bahwa mereka dapat mengganggu fungsi sel, termasuk rilis sitokin, integritas mikrovilus usus, produksi ROS, inhibisi sintesis ATP, dan genotoksisitas [15–26]. Namun, dampaknya pada mekanik sel—penentu kunci dari migrasi, diferensiasi, dan homeostasis jaringan—telah mendapat perhatian terbatas [27, 28]. Studi ini menjembatani kesenjangan itu dengan mengevaluasi secara sistematis efek biomekanik dari NP SiO₂ dan TiO₂ 20-nm pada sel Caco-2 dan A549.

Metode

Sintesis Nanopartikel SiO₂ dan TiO₂

SiO₂ NP disiapkan melalui mikroemulsi W/O menggunakan TEOS, Triton X-100, sikloheksana, dan NH₄OH, menghasilkan partikel sferis 20 ± 2 nm. TiO₂ NP disintesis melalui rute sol-gel modifikasi dari TTIP dalam kondisi asam, dikalsinasi pada 430 °C untuk menghasilkan fasa anatase-rutile campuran dengan diameter rata-rata 25 ± 5 nm. Kedua jenis NP dikarakterisikan oleh TEM, DLS, ζ-potensial, dan XRD untuk mengonfirmasi morfologi, ukuran hidrodinamis, muatan permukaan, dan struktur kristal (Gambar 1).

Kultur Sel dan Paparan

Sel Caco-2 dan A549 dipertahankan dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10–20 % FBS, 100 U/mL penisin, dan 100 µg/mL streptomisin. Untuk studi penyerapan, sel diekspos pada 15 atau 45 µg/mL NP selama 48–96 jam. Setelah paparan, sel dicuci, ditripsin, dihitung, dan dilumerasi dalam HCl/HNO₃ untuk analisis kandungan Si dan Ti melalui ICP-AES.

Sitotoksisitas, Integritas Membran, dan Stres Oksidatif

Viabilitas diukur dengan uji WST-8; pelepasan LDH mengukur kerusakan membran. Produksi ROS diukur dengan fluoresensi DCF-DA, dan respons antioksidan dievaluasi melalui aktivitas SOD dan tingkat MDA (peroksidasi lipid). Semua uji dilakukan dalam tiga kali ulang dengan kontrol yang sesuai.

Skema Aktin dan Morfometri

Sel di-fix, dipermeabil, dan diwarnai dengan Phalloidin–ATTO 488 dan DAPI. Mikroskopi laser skaning konfokal (CLSM) menangkap distribusi aktin kortikal. ImageKuantifikasi densitas terintegrasi dan kohersi (plugin OrientationJ) untuk menilai jumlah dan perataan aktin. Rasio area nukleus-ke-sitoplasma (N/C) dihitung untuk mendeteksi perubahan morfologis.

Mikroskopi Gaya Atom

AFM dalam mode volume gaya mengukur modulus Young di wilayah nukleus dan sitoplasma sel yang diobati dengan 45 µg/mL NP selama 72 jam. Kurva gaya-jarang difit ke model Sneddon yang dimodifikasi untuk mengekstrak modulus elastis (E). Data dari 20 sel per kondisi dianalisis secara statistik.

Analisis Statistik

Hasil dinyatakan sebagai mean ± SD. Uji t Student membandingkan kelompok yang diobati versus kontrol, dengan ambang signifikansi pada p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), dan p < 0,005 (***).

Hasil

Karakterisasi Nanopartikel

Citra TEM mengonfirmasi NP SiO₂ sferis monodisperse (~20 nm) dan NP TiO₂ (~25 nm) dengan fasa anatase-rutile campuran (Gambar 1). DLS menunjukkan diameter hidrodinamis 21 ± 7 nm (SiO₂) dan 27 ± 12 nm (TiO₂) dalam air; ukuran meningkat menjadi 29 ± 9 nm dan 41 ± 14 nm, masing-masing, dalam DMEM dengan 20 % FBS setelah 96 jam, yang menunjukkan pembentukan corona protein. Potensial ζ adalah −45 ± 3 mV (SiO₂) dan −50 ± 3 mV (TiO₂) dalam air, menjadi lebih negatif dalam media kultur.

Penyerapan NP

ICP-AES mengungkapkan internalisasi yang bergantung pada dosis dan waktu. TiO₂ NP terakumulasi lebih mudah, mencapai 8,2 ± 0,4 µg per 3,6 × 10⁵ sel dalam Caco-2 setelah 72 jam dan 9,7 ± 0,03 µg setelah 96 jam. Dalam A549, penyerapan adalah 5 ± 0,6 µg (72 jam) dan 7,1 ± 0,1 µg (96 jam). SiO₂ NP menunjukkan akumulasi yang lebih rendah, terutama dalam A549 (2,6 ± 0,05 µg pada 72 jam). Secara keseluruhan, TiO₂ NP menunjukkan penyerapan sel yang lebih tinggi di kedua baris sel.

Viabilitas Sel, Kerusakan Membran, dan ROS

Uji WST-8 menunjukkan penurunan viabilitas yang ringan pada kedua baris sel pada 45 µg/mL. Viabilitas Caco-2 turun sekitar 40 % setelah 72 jam dan sekitar 50 % setelah 96 jam paparan TiO₂; A549 menunjukkan penurunan sekitar 30 % hanya setelah 96 jam. Pelepasan LDH mencerminkan tren ini, mencapai puncak sekitar 160 % dari kontrol setelah 96 jam dalam Caco-2. Generasi ROS meningkat seiring dosis, dengan TiO₂ NP menginduksi hingga 165 % fluoresensi DCF-DA dalam Caco-2 (Gambar 4).

Respons Antioksidan dan Peroksidasi Lipid

Aktivitas SOD menurun secara bergantung pada dosis dan waktu. Dalam Caco-2, SOD turun dari 4,1 ± 0,2 U/mL (kontrol) menjadi 1,0 ± 0,3 U/mL setelah 96 jam paparan 45 µg/mL TiO₂. Paparan SiO₂ mengurangi SOD menjadi 1,4 ± 0,1 U/mL. Tingkat MDA meningkat seiringnya di kedua baris sel, yang menunjukkan peroksidasi lipid yang ditingkatkan.

Remodeling Skema Aktin

Citra konfokal mengungkapkan gangguan jepit rapat dan morfologi yang memanjang dalam Caco-2, dan kontak sel-sel yang berkurang dalam A549 saat treatment NP. Analisis kuantitatif menunjukkan tidak ada perubahan yang signifikan dalam densitas terintegrasi (jumlah aktin) tetapi penurunan yang terpronis dalam kohersi: kohersi Caco-2 turun dari 0,26 ± 0,03 (kontrol) menjadi 0,09 ± 0,02 (TiO₂). Kohersi A549 turun dari 0,40 ± 0,03 menjadi 0,16 ± 0,04. Rasio N/C meningkat dalam Caco-2 (0,40 → 0,62) dan berkurang dalam A549 (0,55 → 0,23), yang mencerminkan respons morfologis yang berbeda.

Properti Mekanik (Modulus Young)

Pengukuran AFM mengungkapkan perubahan kekakuan yang kontras. Dalam Caco-2, modulus Young turun dari 105 ± 25 kPa (nukleus) menjadi 27 ± 4 kPa setelah paparan TiO₂; modulus sitoplasma turun dari 47 ± 21 kPa menjadi 18 ± 4 kPa. Sebaliknya, kekakuan A549 meningkat secara dramatis: modulus nukleus naik dari 129 ± 24 kPa menjadi 372 ± 60 kPa, dan modulus sitoplasma dari 147 ± 26 kPa menjadi 549 ± 40 kPa pada treatment TiO₂.

Pembahasan

Temuan kami menunjukkan bahwa TiO₂ NP, karena struktur kristal dan reaktivitas permukaannya, memicu respons sel yang lebih kuat dibandingkan NP SiO₂ amorf. Penyerapan yang ditingkatkan, generasi ROS, dan reorganisasi aktin berkorelasi dengan perubahan yang signifikan dalam elastisitas sel—pemekaran sel Caco-2 dan pemekaran keras sel A549—yang menunjukkan jalur mekanisme yang berbeda dalam konteks epitel versus alveoler. Perubahan biomekanik ini dapat mempengaruhi migrasi sel, integritas rintangan, dan potensi progresi tumor. Mengintegrasikan titik akhir mekanik dengan uji sitotoksisitas konvensional menawarkan penilaian nanotoxikologi yang lebih komprehensif.

Kesimpulan

NP SiO₂ menunjukkan sitotoksisitas yang lebih rendah dibandingkan NP TiO₂. Paparan TiO₂ menginduksi remodeling aktin, perubahan rasio N/C, dan respons mekanik yang berbeda: peningkatan kekakuan dalam A549 dan penurunan kekakuan dalam Caco-2. Gangguan biomekanik ini menyoroti pentingnya mengevaluasi dinamika skema dan mekanik sel dalam studi nanotoxikologi untuk memprediksi hasil patologis potensial.

Singkatan

A549

Sel epitel basal adenokarsinoma alveolar manusia

AFM

Mikroskopi gaya atom

ATP

Adenosin trifosfat

Caco‑2

Karsinoma kolorektal epitel manusia

CLSM

Mikroskopi laser skaning konfokal

DAPI

4′,6′‑Diamidino‑2‑fenilindol

DCF‑DA

2′,7′‑Diklorofluoresin diasetat

DLS

Pencaharan cahaya dinamis

DMEM

Medium Eagle modifikasi Dulbecco

ENPs

Nanopartikel terdesain

FBS

Serum sapi janin

HCl/HNO₃

Asam klorida/nitrat

ICP‑AES

Spektroskopi emisi atom plasma terikat induktif

LDH

Laktat dehidrogenase

MDA

Malondialdehid

NH₄OH

Ammonium hidroksida

NPs

Nanopartikel

PBS

Penapis fosfat

ROIs

Wilayah minat

ROS

Spesies oksigen reaktif

SiO₂ NPs

Nanopartikel oksida siliun

SOD

Superoksida dismutase

TBA

Asam tiobarbiturat

TEM

Mikroskop transmisi elektron

TEOS

Ortosilikat tetraetil

TiO₂ NPs

Nanopartikel oksida titanium

TTIP

Titanium (IV) isopropoksida

XRD

Difraksi sinar X