Mitochondria-Targeted and Resveratrol-Loaded Dual-Function Titanium Disulfide Nanosheets untuk Kemoterapi Tumor yang Dipicu Fototermal
Abstrak
Pengiriman obat anti-kanker yang ditargetkan ke organel subseluler adalah strategi yang menjanjikan untuk memaksimalkan efek anti-kanker dan meminimalkan efek samping. Di sini, kami menyiapkan nanoplatform pengiriman obat bertarget mitokondria berdasarkan IR780 iodida (IR780) dan titanium disulfida (TiS2 ) nanosheet. Karena luas permukaan spesifik TiS yang besar2 nanosheets, nanoplatform bisa sangat memuat resveratrol obat anti kanker (RV). Nanokomposit yang telah disiapkan (IR780-TiS2 /RV) digunakan untuk kemoterapi tumor yang dipicu oleh fototermal. IR780-TiS2 /RV menunjukkan stabilitas dan biokompatibilitas yang memuaskan, dan rasio pemuatan RV dan IR780 masing-masing sekitar 112% dan 56%. Pada penyinaran inframerah-dekat (NIR), panas yang dihasilkan oleh IR780-TiS2 /RV bisa memicu rilis RV. Karena konjugasi dengan IR780, IR780-TiS khusus mitokondria2 /RV dapat menargetkan dan terakumulasi dalam mitokondria dan melepaskan RV ketika dipicu oleh NIR untuk mengurangi potensi membran mitokondria, dengan cepat menginduksi upregulasi faktor-faktor apoptosis intrinsik kunci seperti sitokrom c, dan memulai kaskade kaspase, sehingga mencapai efek kemoterapi. IR780-TiS2 /RV nanokomposit ditunjukkan memiliki kemanjuran anti-tumor yang tinggi secara in vitro dan in vivo serta tidak ada toksisitas jaringan yang luar biasa. Kami yakin penelitian kami menunjukkan bahwa IR780-TiS yang dipicu NIR2 /RV nanoplatform bisa menjadi agen kemoterapi yang menjanjikan dalam praktik klinis.
Pengantar
Kanker tetap menjadi penyakit yang mengancam jiwa dan menyumbang angka kematian yang tinggi di seluruh dunia [1]. Pembedahan, kemoterapi, radiasi, dan terapi hormonal masih merupakan metode terapi utama yang digunakan dalam praktik klinis [2, 3]. Dari metode ini, kemoterapi adalah pilihan pengobatan yang diterima secara luas oleh dokter dan pasien karena kemanjurannya yang relatif tinggi [4, 5]. Kemoterapi dikaitkan dengan beberapa masalah serius, misalnya, resistensi obat, kekambuhan tumor, dan non-spesifisitas [5,6,7]. Oleh karena itu, pengembangan agen kemoterapi baru dan strategi untuk mengatasi hambatan tersebut sangat mendesak [8]. Dalam beberapa tahun terakhir, memuat obat anti-kanker pada pembawa fungsional yang secara bersamaan dapat mencapai pengiriman yang ditargetkan dan pelepasan obat yang terkontrol telah menjadi pendekatan populer untuk memaksimalkan efek terapeutik dan mengurangi efek samping [9,10,11] . Area spesifik yang luas yang dapat memberikan rasio pemuatan obat yang lebih baik sangat penting untuk pembawa obat yang sangat baik [12].
Selain itu, untuk meningkatkan spesifisitas obat, pembawa biasanya dimodifikasi dengan molekul penargetan sel, seperti asam folat penargetan reseptor permukaan sel dan glutathione [13,14,15,16,17]. Karena banyak obat kemoterapi bekerja pada organel subselular tertentu, merancang sistem penghantaran spesifik organel dapat sangat meningkatkan efek terapeutik dan mengurangi efek samping [18,19,20]. Akibatnya, pemilihan lokasi yang ditargetkan di dalam sel tumor sangat penting untuk sistem penghantaran obat. Mitokondria tidak hanya "pabrik energi" sel tetapi juga target utama obat kemoterapi yang menargetkan mitokondria untuk memulai jalur apoptosis intrinsik [21,22,23]. Oleh karena itu, mengembangkan sistem penghantaran obat anti-kanker yang menargetkan mitokondria bisa menjadi vital untuk kemoterapi kanker yang lebih efektif. Sampai saat ini, berbagai macam sistem penghantaran obat telah dirancang, seperti silika mesopori, bahan berbasis karbon, dan protein [17, 24,25,26]. Meskipun pembawa ini telah dilaporkan efisien untuk penghantaran obat dan terapi tumor, sistem penghantaran obat baru yang lebih efisien masih sangat diinginkan.
Dalam penelitian ini, kami membuat nanoplatform pengiriman obat yang menargetkan mitokondria dan dipicu NIR berdasarkan titanium disulfida dua dimensi (TiS2 ) nanosheet untuk kemoterapi tumor yang dikendalikan dan ditargetkan. TiS2 adalah anggota dichalcogenides logam transisi, yang memiliki luas spesifik yang besar [27,28,29]. Setelah pengelupasan kulit dengan ultrasonikasi berbantuan protein, permukaan TiS2 nanosheets dapat dimodifikasi oleh molekul fungsional lainnya melalui interaksi kovalen atau non-kovalen. Selain itu, molekul spesifik mitokondria tumor IR780 (IR-780 iodida) dipilih untuk memodifikasi TiS2 nanosheet. IR780 memberi nanosheet kemampuan penargetan mitokondria, yang melalui transpor aktif yang dimediasi polipeptida yang mengangkut anion organik dan fitur kation lipofilik [30, 31]. Dilaporkan bahwa IR780 sebagai kation lipofilik, menunjukkan lebih banyak akumulasi dalam mitokondria sel tumor karena besarnya potensi membran mitokondria dalam sel tumor daripada sel normal [32, 33]. Selain itu, IR780 juga merupakan agen fototermal responsif inframerah-dekat. Nanoplatform yang telah disiapkan, disebut IR780-TiS2 , dipastikan biokompatibel dan dapat secara efektif memuat resveratrol obat anti kanker (RV) (IR780-TiS2 /RV) [24]. IR780-TiS2 /RV memiliki kemampuan penargetan mitokondria dan efek fototermal. NIR diterapkan sebagai stimulus eksternal untuk memicu pelepasan obat lokal pada iradiasi NIR. Eksperimen in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa IR780-TiS2 /RV memiliki efek kemoterapi yang sangat efisien. Studi lebih lanjut tentang mekanisme tersebut mengungkapkan bahwa kematian sel yang disebabkan oleh IR780-TiS2 / RV adalah melalui jalur apoptosis intrinsik yang dimediasi mitokondria. Sistem penghantaran obat bertarget mitokondria (Skema 1) ini dapat menjadi agen kemoterapi potensial dalam aplikasi klinis di masa mendatang.
Skema persiapan IR780-TiS2 /RV, yang digunakan sebagai sistem pengiriman obat yang dipicu NIR untuk kemoterapi tumor yang dimediasi oleh jalur apoptosis intrinsik
Bahan dan Metode
Materi
Sigma-Aldrich menyediakan IR-780 iodida (IR780), TiS2 bubuk, fluorescein isothiocyanate (FITC) (St. Louis, MO, USA). Albumin serum sapi (BSA 98,0%) dibeli dari BioSharp Co., Ltd. (Korea). Cell Counting Kit-8 (CCK-8) diperoleh dari Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Kumamoto, Jepang). Reagen kultur sel termasuk medium DMEM dan serum janin sapi (FBS) disediakan oleh Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Bahan kimia diperoleh dari Sigma-Aldrich (Shanghai, Cina).
Sintesis IR780-TiS2 /RV
Langkah pertama adalah preparasi TiS yang larut dalam air2 nanosheets menurut laporan sebelumnya [34]. Secara rinci, 5 mg TiS massal2 dicampur dengan 5 mL air dan diaduk selama 20 min. TiS2 suspensi air kemudian ditambahkan ke dalam 5 mg BSA dan diproses di bawah penangas es ultrasonik yang dipisahkan menggunakan sonication ujung 500 W dan 20 kHz (Sonics, VCX130, USA) selama 6 h. Setelah itu, campuran yang telah disiapkan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 min, menghasilkan TiS2 nanosheet di supernatan.
Kedua, TiS2 nanosheet terkonjugasi dengan IR780. Trietilamina (TEA) diaplikasikan sebagai agen pengikat asam. Lima miligram IR780 dilarutkan dalam 2 mL DMSO dan diaduk pada 60 °C selama 8 jam dengan penambahan TEA. Suspensi campuran didialisis dalam air suling selama 2 hari dan kemudian disentrifugasi pada 9000 rpm selama 8min untuk menghilangkan produk agregat. Supernatan dikumpulkan, menghasilkan IR780-TiS2 .
Akhirnya, RV dimuat ke IR780-TiS2 . IR780-TiS2 (1 mg/ml) dicampur dengan RV (2 mg/ml, dilarutkan dalam DMSO), yang sedikit diaduk semalaman pada suhu kamar. Setelah itu, DMSO dan RV bebas dihilangkan melalui dialisis dalam air suling semalaman untuk memberikan IR780-TiS2 /RV. Berdasarkan literatur, rasio pembebanan RV dideteksi oleh spektrofotometer UV-vis (UV-2550, Shimadzu, Jepang) dan dihitung menurut persamaan berikut:
dimana Aa (mg), Ab (mg), dan Ac (mg) mewakili RV awal, tidak terikat, dan IR780-TiS2 , masing-masing.
Bruker TENSOR 27 Spektrometer spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) (Bruker Optics Ltd., Coventry, UK) digunakan untuk mendeteksi struktur kimia TiS2 , IR780-TiS2 , dan R780-TiS2 /RV. Analisis Brunauer-Emmett-Teller (BET) dilakukan untuk menentukan luas permukaan spesifik sampel, dihitung dari N2 hasil adsorpsi melalui penganalisis luas permukaan (Quantachrome ChemBET-3000) berdasarkan persamaan BET.
Garis Sel dan Kultur Sel
Sel kanker usus besar tikus CT26 diperoleh dari Chinese Academy of Sciences Cell Bank of Type Culture Collection (Shanghai, Cina). Sel-sel dikultur dalam media DMEM lengkap (10% FBS + 90% DMEM) dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5% CO2 pada 37 °C.
Lokalisasi In Vitro IR780-TiS2 /RV
FITC digunakan untuk memberi label IR780-TiS2 /RV atau TiS2 /RV. Singkatnya, FITC dilarutkan dalam larutan etanol (2,0 mg/mL) dan dicampur dengan IR780-TiS2 /RV atau TiS2 /RV larutan berair (1,0 mg/mL) di bawah pengadukan 4 jam di lingkungan gelap pada suhu kamar. Campuran didialisis dalam air suling semalaman untuk menghilangkan FITC dan etanol yang berlebihan, menghasilkan IR780-TiS berlabel FITC2 /RV atau TiS2 /RV solusi. Untuk mengkonfirmasi ko-lokalisasi mitokondria nanopartikel in vitro, sel-sel yang diobati dengan IR780-TiS berlabel FITC2 /RV atau TiS2 /RV selama 5 h dan diwarnai oleh pewarna khusus mitokondria MitoTracker. Setelah itu, internalisasi seluler IR780-TiS2 /RV atau TiS2 /RV diamati menggunakan CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.). Singkatnya, sel CT26 diinkubasi dengan TiS berlabel FITC2 /RV dan IR780-TiS2 /RV (dengan konsentrasi FITC yang sama) selama 5 h. Dan kemudian, sel diperlakukan dengan solusi MitoTracker Red FM (100 nM) pada 37 °C selama 30 min. Setelah dicuci dengan PBS selama tiga kali, sel diamati dengan CLSM. Perangkat lunak ImageJ digunakan untuk menganalisis intensitas fluoresensi sel.
Studi Kemoterapi dan Apoptosis Tumor yang Dipicu NIR In Vitro
4 × 10
3
sel/sumur Sel CT26 dalam pelat kultur 96-sumur dirawat dengan RV gratis, IR780-TiS2 , IR780-TiS2 /RV, dan TiS2 /RV dengan konsentrasi RV yang berbeda selama 5 h dan kemudian diiradiasi dengan atau tanpa NIR selama 3 min (808 nm, 0.3 W/cm
2
). Setelah inkubasi 24 jam lebih lanjut, kelangsungan hidup sel yang dirawat dianalisis dengan uji CCK-8. Sel-sel yang dirawat juga diwarnai oleh Rhodamine123 (Sigma) dan dianalisis dengan FCM (FC 500 MCL; Beckman Coulter, USA). Deteksi apoptosis sel juga dilakukan dengan analisis FCM menggunakan kit deteksi apoptosis Annexin V-FITC/PI (Bender MedSystems, Wina, Austria) seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Western Blot
Sel CT26 diobati dengan PBS (kontrol), RV, TiS2 /RV, IR780-TiS2 /RV, dan IR780-TiS2 /RV + NIR (RV setara, 30 μg/mL; setara IR780, 0,5 μg/mL) untuk inkubasi 5 jam. Setelah inkubasi 24 jam lebih lanjut, sel-sel dikumpulkan masing-masing dari Western blot, yang didasarkan pada protokol yang dilaporkan sebelumnya [23]. Secara singkat, sel-sel dilisiskan dan dihambat oleh protease dan Triton X-100. Elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida digunakan untuk memulihkan dan memisahkan protein yang kemudian dipindahkan ke membran PVDF dan diblokir menggunakan susu bebas lemak 5%. Setelah itu, antibodi primer yang diencerkan diinkubasi pada suhu 4 °C selama 12 jam, termasuk sitokrom c (1/1000, Boster, Wuhan, Cina), cleaved caspase-3 (1/1000, CST), cleaved caspase-9 (1/1000, CST), cleaved caspase-9 (1/1000, CST). 1000, CST), dan actin (1/1000, Mouse, Boster, Wuhan, China) kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder. Akhirnya, reagen ECL digunakan untuk mendeteksi protein.
Model Hewan
Untuk menetapkan model tumor subkutan CT26, 1 × 10
7
Sel CT26 (100 μL, dalam PBS) disuntikkan secara subkutan ke bagian belakang tikus telanjang Balb/c. Volume tumor = panjang × lebar
2
/2. Semua prosedur hewan dilakukan sesuai dengan Pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari Institut Kesehatan Nasional dan disetujui oleh Komite Etika Hewan dari rumah sakit pusat Zhumadian (Henan, Cina).
In Vivo Biodistribution
Biodistribusi IR780-TiS2 /RV pada tikus telanjang yang mengandung tumor terdeteksi pada 24 jam pasca injeksi intravena dengan IR780-TiS2 /RV (150 μL, 6 mg/kg). Organ utama termasuk jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, dan tumor ditimbang dan dicerna dengan larutan aqua regia. Kandungan elemen Ti dalam jaringan ini diukur dengan ICP-OES.
Kemoterapi Tumor yang Dipicu NIR di Vivo
Tikus pembawa tumor CT26 dipisahkan secara acak menjadi enam kelompok (n = 6), termasuk saline, saline +NIR, RV, IR780-TiS2 /RV, TiS2 /RV, dan IR780-TiS2 /RV + NIR (RV setara, 1 mg/kg; setara IR780, 0,5 mg/kg). Kondisi penyinaran NIR adalah 808 nm, 0.3 W/cm
2
, dan 3 menit. Selama 30 hari pengobatan, volume tumor dan berat tikus dicatat setiap 3 hari. Setelah perawatan, organ-organ termasuk jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal dalam berbagai kelompok difiksasi dan diwarnai oleh H&E.
Analisis Statistik
Hasilnya disajikan sebagai mean ± standar deviasi. t Student siswa tes digunakan untuk menguji perbedaan yang signifikan antara dua kelompok. P < 0,05 dianggap signifikan dan P < 0.01 dianggap sangat signifikan.
Hasil dan Diskusi
Persiapan dan Karakterisasi IR780-TiS2 /RV
Untuk menyiapkan IR780-TiS2 /RV, pertama, TiS biokompatibel2 nanosheet disiapkan melalui bovine serum albumin (BSA) dan metode pengelupasan dengan bantuan ultrasonikasi seperti yang dilaporkan sebelumnya [34, 35]. Selanjutnya, IR780-TiS2 disintesis dalam reaksi substitusi antara atom klorin IR780 dan gugus amino BSA yang diserap pada TiS2 nanosheets menggunakan zat pengikat asam TEA. Akhirnya, IR780-TiS2 nanoplatform memuat obat anti kanker RV melalui penyerapan fisik. Diagram skematik IR780-TiS2 /RV ditunjukkan dalam Skema 1. File tambahan 1:Gambar S1 menunjukkan gambar TEM dari TiS terkelupas yang dibantu protein2 , yang merupakan struktur nanosheet yang ditampilkan. Pola XRD dari TiS2 nanosheet juga terdeteksi, yang menunjukkan kristalinitas yang baik dari TiS2 . yang disiapkan nanosheet, konsisten dengan pengamatan dari TEM (File tambahan 1:Gambar S2). Setelah fungsionalisasi, IR780-TiS2 /RV nanokomposit memiliki morfologi seperti serpihan dengan jarak kisi 0,25 nm seperti yang ditunjukkan oleh mikroskop elektron transmisi (Gbr. 1a, b) dan diameter rata-rata sekitar 123,6 nm dan potensi zeta 37.2 mV seperti yang dideteksi oleh Nanosizer (Malvern Instrumen) (Gbr. 1c, d). Setelah penyimpanan 2 minggu dalam air, FBS, atau salin, ukuran rata-rata IR780-TiS2 /RV tetap konstan pada sekitar 123 nm (Gbr. 1e) yang menunjukkan stabilitas IR780-TiS2 /RV, kemungkinan karena adhesi BSA pada permukaan TiS2 nanosheet. Gambar 1f menunjukkan spektrum absorbansi IR780, RV gratis, TiS2 nanosheet, dan IR780-TiS2 /RV. Spektrum serapan IR780-TiS2 /RV menunjukkan puncak IR780 bebas dan RV bebas, menunjukkan bahwa IR780 dan RV berhasil terkonjugasi dengan TiS2 nanosheet. Rasio pemuatan RV IR780-TiS2 adalah sekitar 112% (A /A ), yang dicapai melalui interaksi non-kovalen (mis., π –π susun dan interaksi hidrofobik). Selanjutnya, menurut hasil BET, luas permukaan dihitung menjadi 15,2 m
2
/g dan 122,1 m
2
/g untuk TiS massal2 dan TiS2 nanosheet, masing-masing. TiS yang terkelupas2 nanosheet menunjukkan luas permukaan BET yang jauh lebih tinggi daripada TiS massal2 , yang menyediakan area aktif yang besar untuk pemuatan obat. Pembebanan kemungkinan besar terjadi karena luas permukaan spesifik yang besar dan adhesi BSA ke IR780-TiS2 nanosheet [23]. Untuk konfirmasi lebih lanjut RV dan IR780 dimuat di TiS2 nanosheets, spektrum FTIR TiS2 nanosheet, IR780-TiS2 , dan IR780-TiS2 /RV diukur. Dalam file tambahan 1:Gambar S6, semua puncak karakteristik TiS2 nanosheet muncul dalam spektrum FTIR IR780-TiS2 /RV. Selain itu, tiga puncak baru muncul (~ 3191 cm
−1
, ~ 1510 cm
−1
, 1230 cm
−1
) dalam spektrum IR780-TiS2 /RV, menunjukkan bahwa keberadaan RV dan IR780 [36, 37].
a Gambar TEM IR780-TiS2 /RV. b Gambar TEM resolusi tinggi dari IR780-TiS2 /RV. c Distribusi ukuran dan d zeta potensi distribusi IR780-TiS2 /RV. e Perubahan ukuran partikel hidrodinamik IR780-TiS2 /RV dalam air, FBS, dan salin selama 2 minggu. f Spektrum serapan RV, IR780, TiS2 nanosheet, dan IR780-TiS2 /RV
Setelah penyinaran NIR berdaya rendah selama 3 menit (808 nm, 0,3 W/cm
2
), IR780-TiS2 /Suhu larutan RV meningkat sebanding dengan konsentrasi IR780-TiS2 /RV (0, 5, 10 μg/ml), dan 10 μg/ml IR780-TiS2 /RV solusi mencapai suhu tertinggi 47,6 °C (Gbr. 2a). Selain itu, IR780-TiS2 /RV telah mempertahankan efek fototermal awalnya bahkan setelah lima siklus penyinaran NIR, sementara IR780 gratis menunjukkan penurunan efek fototermal (Gbr. 2b). Hasil ini menunjukkan IR780-TiS2 /RV nanokomposit memiliki stabilitas foto yang luar biasa.
a Efek fototermal IR780-TiS2 /RV di bawah penyinaran NIR (808 nm, 0.3 W/cm
2
) selama 3 mnt. b Perubahan suhu IR780 dan R780-TiS2 /RV setelah lima siklus penyinaran NIR (808 nm, 0.3 W/cm
2
, 3 menit). c Skema pelepasan RV yang dipicu oleh fototermal. d Kinetika pelepasan RV dari IR780-TiS2 /RV dalam buffer PBS (pH = 7.4 dan 6.5) dengan atau tanpa penyinaran NIR (808 nm, 0.3 W/cm
2
). **P < 0,01, dibandingkan dengan kelompok pH = 7,4 dan pH = 6,5
Selanjutnya, rasio pelepasan RV diukur pada berbagai kondisi pH dan penyinaran NIR (Gbr. 2c, d). Setelah 24 jam, rasio pelepasan RV adalah 8,56% dalam kondisi fisiologis (pH-7,4), tetapi meningkat secara signifikan menjadi 16,2% pada pH-6,5, yang menunjukkan bahwa rasio tersebut dapat ditingkatkan dengan kondisi asam lemah. Selanjutnya, rasio pelepasan RV sekali lagi meningkat secara signifikan menjadi 44,8% pada pH 6,5 dan penyinaran NIR 3 menit (808 nm, 0,3 W/cm
2
). Hasil ini menunjukkan bahwa penyinaran NIR dapat menjadi stimulus eksternal yang dapat dikontrol untuk memicu pelepasan RV dari IR780-TiS2 /RV. Efek ini kemungkinan disebabkan oleh panas yang dihasilkan oleh IR780-TiS2 di bawah iradiasi NIR melemahkan interaksi adsorpsi non-kovalen antara RV dan IR780-TiS2 permukaan [35]. Selain itu, pada lingkungan asam, H+ dapat mengubah muatan permukaan TiS2 yang mengubah keseimbangan hidrofilik/hidrofobik nanopartikel [38, 39].
Lokalisasi In Vitro IR780-TiS2 /RV
Untuk menyelidiki serapan sel dan distribusi intraseluler IR780-TiS2/RV, IR780-TiS2 / RV nanopartikel diberi label dengan FITC, dan CLSM digunakan untuk memvisualisasikan fluoresensi intraseluler. Setelah inkubasi 5 jam, TiS2 /RV dan IR780-TiS2 /RV menunjukkan intensitas fluoresensi yang sama dalam sitoplasma (Gbr. 3a, b), menunjukkan bahwa kedua nanokomposit dapat memasuki sel, kemungkinan melalui endositosis. Namun, IR780-TiS2 /RV nanokomposit menunjukkan intensitas fluoresensi kuning dan hijau yang lebih besar ketika sinyal FITC digabungkan dengan pelabelan MitoTracker (Gbr. 3a, c). Hasil ini menunjukkan bahwa IR780-TiS2 /RV dapat menargetkan mitokondria dengan efisiensi tinggi. Selain itu, distribusi IR780-TiS2 /RV dalam sitoplasma dikonfirmasi lebih lanjut menggunakan TEM, yang menunjukkan nanopartikel yang tertahan di beberapa mitokondria (Gbr. 3d). Bersama-sama, hasil ini dengan tegas mengkonfirmasi bahwa IR780-TiS2 /RV mencapai penargetan mitokondria yang baik, yang selanjutnya mendorong akumulasi obat mitokondria, menyebabkan toksisitas sel langsung. Penargetan mitokondria kemungkinan dimediasi oleh transpor aktif yang dimediasi polipeptida yang mengangkut anion organik dan fitur kation lipofilik, yang membuat nanopartikel sangat terakumulasi dalam mitokondria sel tumor [30,31,32,33].
a Gambar fluoresensi sel CT26 yang diinkubasi dengan TiS berlabel FITC2 /RV atau IR780-TiS2 /RV selama 5 h. Fluoresensi hijau adalah sinyal FITC, dan fluoresensi merah adalah sinyal MitoTracker. b Analisis intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) yang sesuai dari TiS berlabel FITC2 /RV atau IR780-TiS2 /RV dalam sel pada Gambar. 3a. c Koefisien ko-lokalisasi yang sesuai dari TiS berlabel FITC2 /RV atau IR780-TiS2 /RV dan mitokondria dalam sel pada Gambar 3a. M berarti mitokondria. **P < 0.01, dibandingkan dengan TiS2 /RV grup saja
Kemoterapi Tumor yang Dipicu NIR In Vitro
Pertama, efek fototermal dievaluasi secara in vitro. Setelah inkubasi 5 jam, IR780-TiS2 /RV menunjukkan peningkatan suhu sekitar 17 °C, sedangkan TiS2 /RV menunjukkan peningkatan suhu sekitar 10 °C (Gbr. 4a). Efek fototermal dikaitkan dengan IR780 dan TiS2 nanosheet. Mendemonstrasikan biokompatibilitas sebagai platform nano untuk pemuatan obat, IR780-TiS2 tidak menunjukkan sitotoksisitas yang jelas di bawah konsentrasi 300 μg/ml (Gbr. 4b). Lebih lanjut, RV dengan atau tanpa penyinaran NIR memiliki efek pembunuhan sel yang bergantung pada konsentrasi yang serupa (Gbr. 4c). Pada konsentrasi RV yang sama, RV mencapai efek pembunuhan sel terbaik saat dimuat oleh IR780-TiS2 dan disinari oleh NIR dibandingkan dengan semua kondisi lain, yaitu RV gratis, IR780-TiS gratis2 , dan RV dimuat oleh TiS2 (Gbr. 4d). Menariknya, IR780-TiS yang dibongkar2 platform tidak menunjukkan efek anti-kanker yang luar biasa saat terkena iradiasi NIR dibandingkan dengan tanpa iradiasi NIR (Gbr. 4d), yang menunjukkan bahwa panas yang dihasilkan oleh IR780-TiS2 pada stimulus iradiasi NIR terutama digunakan untuk memicu pelepasan obat yang kemudian membunuh sel. Hasil ini menunjukkan bahwa IR780-TiS2 /RV dapat melepaskan RV di mitokondria ketika dipicu oleh penyinaran NIR dan, dengan demikian, sangat meningkatkan konsentrasi lokal RV di dalam mitokondria dan mencapai efek penghambatan tumor yang lebih besar.
a Kurva perubahan suhu PBS (kontrol), TiS2 /RV, atau IR780-TiS2 /Sel yang dirawat dengan RV di bawah penyinaran NIR 3 menit (808 nm, 0,3 W/cm
2
). b Sitotoksisitas in vitro terhadap sel CT26 yang diobati dengan konsentrasi IR780-TiS yang berbeda2 . c Viabilitas sel dari sel yang diobati dengan RV dengan atau tanpa penyinaran NIR (808 nm, 0,3 W/cm
2
) selama 3 menit. d Viabilitas sel dari sel yang diobati dengan IR780-TiS2 , RV, TiS2 /RV, atau IR780-TiS2 /RV dengan atau tanpa penyinaran NIR (808 nm, 0.3 W/cm
2
) selama 3 menit. **P < 0.01, dibandingkan dengan IR780-TiS2 /RV tanpa grup NIR saja
Mekanisme Kematian Sel
Untuk mengilustrasikan mekanisme yang mendasari kemoterapi yang dipicu oleh NIR dari IR780-TiS2 / RV, kami menganalisis jenis kematian sel, potensi membran mitokondria (Ψm), dan tingkat ekspresi protein kunci terkait apoptosis. Pertama, FCM digunakan untuk mendeteksi jenis kematian sel menggunakan pewarnaan Annexin V-FITC/PI (Gbr. 5a). Pada konsentrasi RV yang sama, RV gratis, TiS2 /RV, IR780-TiS2 /RV, dan IR780-TiS2 /RV + NIR semuanya dapat menginduksi apoptosis, terutama karena adanya RV. Memang, RV telah dilaporkan memiliki kemampuan untuk menginduksi apoptosis. Dari perawatan ini, IR780-TiS2 /RV + NIR menunjukkan tingkat apoptosis tertinggi sebesar 90,8%. Jalur pensinyalan apoptosis diselidiki selanjutnya. Penurunan m telah dilaporkan sebagai peristiwa kunci dalam jalur apoptosis mitokondria (intrinsik) [40]. Pada konsentrasi RV yang sama, IR780-TiS2 /RV + NIR menurunkan m sekitar 85%, yang lebih signifikan daripada penurunan m yang disebabkan oleh IR780-TiS2 , TiS2 /RV dengan atau tanpa NIR, dan RV gratis (Gbr. 5b). Eksperimen ini menunjukkan bahwa IR780-TiS2 /RV + NIR menginduksi kematian sel yang dimediasi melalui jalur apoptosis mitokondria (intrinsik) [41]. Selanjutnya, ekspresi protein penting untuk apoptosis, khususnya sitokrom c (cyto c), caspase 9, dan caspase 3, dideteksi melalui uji Western blot. Sel yang diobati dengan IR780-TiS2 /RV + NIR mengekspresikan sitosolik lebih banyak daripada mereka yang diobati dengan RV, IR780-TiS2 /RV, atau IR780-TiS2 /RV (Gbr. 5c). Translokasi cyto c adalah inisiator terpenting dari kaskade kaspase [42,43,44]. Akibatnya, ekspresi cleaved caspase 9 dan cleaved caspase 3 sangat meningkat pada IR780-TiS2 /RV + sel yang diberi perlakuan NIR. Bersama-sama, data ini dengan jelas menunjukkan bahwa apoptosis dimediasi oleh jalur mitokondria (intrinsik).
a Apoptosis sel dari sel CT26 yang diobati dengan PBS (kontrol), RV, TiS2 /RV, IR780-TiS2 /RV, dan IR780-TiS2 /RV + NIR oleh FCM. b Perubahan potensial membran mitokondria sel CT26 yang diobati dengan PBS (kontrol), RV, TiS2 /RV, IR780-TiS2 /RV, dan IR780-TiS2 /RV dengan atau tanpa penyinaran NIR oleh FCM. c Ekspresi protein terkait apoptosis dalam sel CT26 yang diobati dengan PBS (kontrol), RV, TiS2 /RV, IR780-TiS2 /RV, dan IR780-TiS2 /RV + NIR. Sitokrom c, caspase-3 yang dibelah, dan caspase-9 yang dibelah diuji dengan Western blot. **P < 0.01, dibandingkan dengan IR780-TiS2 /RV, TiS2 /RV + NIR, dan IR780-TiS2 grup
Di Vivo Kemoterapi Tumor yang Dipicu NIR
Untuk mengevaluasi kemanjuran kemoterapi yang dipicu NIR in vivo, tikus pembawa tumor CT26 diobati dengan saline, saline + NIR, RV, IR780-TiS2 /RV, TiS2 /RV + NIR, dan IR780-TiS2 /RV + NIR. Ukuran tumor di IR780-TiS2 /RV + NIR kelompok menurun secara signifikan, dan tumor hampir menghilang setelah 30 hari pengobatan, sedangkan pada kelompok yang tersisa, volume tumor menunjukkan tren yang meningkat (Gbr. 6a). Selama perawatan, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam berat badan antara kelompok (Gbr. 6b). Akhirnya, pencitraan H&E menunjukkan tidak ada toksisitas atau kelainan jaringan yang nyata pada semua kelompok yang diuji (Gbr. 6c). Hasil ini menunjukkan bahwa IR780-TiS2 /RV nanokomposit memiliki kemanjuran antitumor terpicu NIR yang luar biasa dan toksisitas sistemik yang rendah. Selain itu, biodistribusi IR780-TiS2 /RV dievaluasi secara in vivo. Seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S4, nanopartikel sebagian besar masuk ke sistem hati dan mungkin dimetabolisme oleh sistem [45].
a Profil pertumbuhan tumor CT26 xenografted setelah injeksi intravena saline (kontrol), RV, TiS2 /RV, dan IR780-TiS2 /RV dengan atau tanpa penyinaran NIR 3 menit (808 nm, 0,3 W/cm
2
). b Berat badan tikus pembawa tumor setelah berbagai perawatan. c Gambar H&E organ utama dari semua tikus yang dirawat setelah 30 hari perawatan. **P < 0.01, dibandingkan dengan saline, saline + NIR, RV, TiS2 /RV + NIR, dan IR780-TiS2 /Grup RV
Kesimpulan
Singkatnya, kami telah mengembangkan platform nano bertarget mitokondria dan bermuatan RV berdasarkan TiS2 nanosheets for a NIR-triggered drug release and enhanced tumor chemotherapy. The as-prepared IR780-TiS2 /RV with flake-like morphology showed good stability and biocompatibility. Owing to the mitochondria-targeted ability of IR780, IR780-TiS2 /RV could selectively accumulate in tumor cell mitochondria and where it could release RV when triggered by the NIR irradiation. The released RV facilitated the mitochondrial membrane potential decrease, cyto c release, and, subsequently, initiated a cascade of caspase reactions to promote tumor cell apoptosis through the mitochondrial signaling pathway. In vitro and in vivo results demonstrated that IR780-TiS2 /RV exhibited an efficacious NIR-triggered tumor chemotherapy without a significant tissue toxicity. These results suggest that IR780-TiS2 /RV could be a promising chemotherapeutic agent in clinical practice.
Ketersediaan Data dan Materi
The conclusions made in this manuscript are based on the data which are all presented and shown in this paper.
