Pengiriman obat anti-kanker yang ditargetkan ke organel subselular adalah strategi yang menjanjikan untuk memaksimalkan efek anti-kanker dan meminimalkan efek samping. Di sini, kami siapkan platform pengiriman obat berbasis nanosheet disulfida titanium (TiS₂) dan iodida IR780 (IR780) yang ditargetkan ke mitokondri. Karena luas permukaan spesifik yang besar dari nanosheet TiS₂, platform dapat memuat tinggi obat anti-kanker resveratrol (RV). Nanokomposit yang disiapkan (IR780-TiS₂/RV) digunakan untuk kemoterapi tumor yang memicu fototermal yang efektif. IR780-TiS₂/RV menunjukkan stabilitas dan biokompatibilitas yang memuaskan, dan rasio pemuatan RV dan IR780 sekitar 112% dan 56%, masing-masing. Pada iradiasi infra merah dekat (NIR), panas yang dihasilkan oleh IR780-TiS₂/RV dapat memicu pelepasan RV. Karena dikonjugasi dengan IR780 spesifik mitokondri, IR780-TiS₂/RV dapat menarget dan mengakumulasi di mitokondri dan melepaskan RV ketika dipicu oleh NIR untuk menurunkan potensial membran mitokondri, dengan cepat menginduksi pengregulasi naik faktor apoptosis intrinsik kunci seperti sitokrom c, dan memulai kaskade kaspase, sehingga mencapai efek kemoterapi. Nanokomposit IR780-TiS₂/RV terbukti memiliki efek anti-tumor yang tinggi in vitro dan in vivo serta tidak ada kekacauan jaringan yang signifikan. Kami yakin studi kami menunjukkan bahwa platform IR780-TiS₂/RV yang dipicu NIR dapat menjadi agen kemoterapi yang menjanjikan dalam praktik klinis.
Pendahuluan
Kanker tetap menjadi penyakit yang mengancam jiwa dan berkontribusi pada tingkat kematian tinggi di seluruh dunia [1]. Bedah, kemoterapi, radiasi, dan terapi hormonal masih merupakan metode terapi utama yang digunakan dalam praktik klinis [2, 3]. Di antara metode ini, kemoterapi adalah opsi terapi yang luas diterima oleh dokter dan pasien karena efektivitasnya yang relatif tinggi [4, 5]. Kemoterapi terkait dengan beberapa masalah serius, misalnya, resistensi obat, rekuren tumor, dan spesifikitas yang tidak spesifik [5,6,7]. Oleh karena itu, mengembangkan agen kemoterapi dan strategi baru untuk mengatasi hambatan ini sangat mendesak [8]. Dalam beberapa tahun terakhir, memuat obat anti-kanker pada penguat yang difungsikan yang dapat secara bersamaan mencapai pengiriman tertarget dan pelepasan terkontrol obat telah menjadi pendekatan populer untuk memaksimalkan efek terapi dan menurunkan sampingan [9,10,11]. Luas permukaan besar yang dapat memberikan rasio pemuatan obat yang lebih baik esensial untuk penguat obat yang unggul [12].
Selain itu, untuk meningkatkan spesifikitas obat, penguat biasanya dimodifikasi dengan molekul targeting sel, seperti asam folat yang target reseptor permukaan sel dan glutation [13,14,15,16,17]. Karena banyak obat kemoterapi bekerja pada organel subselular spesifik, merancang sistem pengiriman organel-spesifik dapat secara luar biasa meningkatkan efek terapi dan mengurangi efek samping [18,19,20]. Oleh karena itu, pemilihan lokasi target di dalam sel tumor sangat penting untuk sistem pengiriman obat. Mitokondri bukan hanya “pabrik energi” sel tetapi juga target kunci obat kemoterapi yang target mitokondri untuk memulai jalur apoptosis intrinsik [21,22,23]. Oleh karena itu, mengembangkan sistem pengiriman obat anti-kanker yang target mitokondri dapat menjadi penting untuk kemoterapi kanker yang lebih efektif. Hingga saat ini, berbagai jenis sistem pengiriman obat telah dirancang, seperti silika mesopor, material berbasis karbon, dan protein [17, 24,25,26]. Meskipun penguat ini telah dilaporkan efisien untuk pengiriman obat dan terapi tumor, sistem pengiriman obat baru yang efisien tinggi masih sangat diinginkan.
Dalam studi ini, kami membangun platform pengiriman obat berbasis nanosheet disulfida titanium (TiS₂) dua dimensi yang target mitokondri dan dipicu NIR untuk kemoterapi tumor yang terkontrol dan tertarget. TiS₂ adalah anggota disalkogenida logam transisi, yang memiliki luas permukaan besar [27,28,29]. Setelah ekfoliasi dengan bantuan ultrasonikasi protein, permukaan nanosheet TiS₂ dapat dimodifikasi oleh molekul fungsional lainnya melalui interaksi kovalen atau non-kovalen. Selain itu, molekul spesifik mitokondri tumor IR780 (iodida IR-780) dipilih untuk memodifikasi nanosheet TiS₂. IR780 memberinya nanosheet kemampuan targeting mitokondri, yang melalui transport aktif yang diedarkan oleh polypeptide anion organik dan fitur kation lipofil [30, 31]. Dilaporkan bahwa IR780 sebagai kation lipofil, menunjukkan lebih banyak akumulasi dalam mitokondri sel tumor dikarenakan magnitudo potensial membran mitokondri yang lebih tinggi pada sel tumor dibandingkan sel normal [32, 33]. Selain itu, IR780 juga agen fototermal responsif infra merah dekat. Nanoplatform yang disiapkan, disebut IR780-TiS₂, dikonfirmasi biokompatibel dan dapat memuat secara efektif obat anti-kanker resveratrol (RV) (IR780-TiS₂/RV) [24]. IR780-TiS₂/RV memiliki kemampuan targeting mitokondri dan efek fototermal. NIR digunakan sebagai rangsangan eksternal untuk memicu pelepasan obat lokal pada iradiasi NIR. Eksperimen in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa IR780-TiS₂/RV memiliki efek kemoterapi yang sangat efisien. Studi lebih lanjut tentang mekanisme mengungkapkan bahwa kematian sel yang diinduksi oleh IR780-TiS₂/RV melalui jalur apoptosis intrinsik yang dimediasi mitokondri. Sistem pengiriman obat yang target mitokondri ini (Skema 1) dapat menjadi agen kemoterapi potensial dalam aplikasi klinis di masa depan.
Skema persiapan IR780-TiS₂/RV, yang digunakan sebagai sistem pengiriman obat yang dipicu NIR untuk kemoterapi tumor yang dimediasi oleh jalur apoptosis intrinsik
Bahan dan Metode
Bahan
Sigma-Aldrich menyediakan iodida IR-780 (IR780), bubuk TiS₂, dan fluorescein isothiocyanate (FITC) (St. Louis, MO, USA). Albumin serum sapi (BSA ≥ 98,0%) dibeli dari BioSharp Co., Ltd. (Korea). Kit Sel Hitung-8 (CCK-8) diperoleh dari Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Kumamoto, Jepang). Reagen kultur sel termasuk medium DMEM dan serum fetal sapi (FBS) disediakan oleh Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kimia diperoleh dari Sigma-Aldrich (Shanghai, China).
Sintesis IR780-TiS₂/RV
Langkah pertama adalah persiapan nanosheet TiS₂ yang larut air sesuai laporan sebelumnya [34]. Secara detail, 5 mg bulk TiS₂ dicampur dengan 5 mL air dan diaduk selama 20 menit. Suspensi air TiS₂ kemudian ditambahkan ke dalam 5 mg BSA dan diproses dengan ultrasonikasi tip pengocok 500 W dan 20 kHz (Sonics, VCX130, USA) dalam mandi es selama 6 jam. Kemudian, campuran yang disiapkan difugasikan pada 12.000 rpm selama 10 menit, menghasilkan nanosheet TiS₂ dalam surnatan.
Kedua, nanosheet TiS₂ dikonjugasi dengan IR780. Trietilamina (TEA) digunakan sebagai agen penahan asam. 5 mg IR780 dilarutkan dalam 2 mL DMSO dan diaduk pada 60 °C selama 8 jam dengan penambahan TEA. Suspensi campuran difusikan dalam air distilasi selama 2 hari dan kemudian difugasikan pada 9000 rpm selama 8 menit untuk menghilangkan produk yang mengumpulkan. Surnatan dikoleksi, menghasilkan IR780-TiS₂.
Terakhir, RV dimuat pada IR780-TiS₂. IR780-TiS₂ (1 mg/ml) dicampur dengan RV (2 mg/ml, dilarutkan dalam DMSO), yang sedikit diaduk selama semalam pada suhu ruangan. Kemudian, DMSO dan RV bebas dihilangkan melalui difusi dalam air distilasi selama semalam untuk menghasilkan IR780-TiS₂/RV. Berdasarkan literatur, rasio pemuatan RV yang terdeteksi oleh spektrofotometer UV-vis (UV-2550, Shimadzu, Jepang) dan dihitung sesuai dengan persamaan berikut:
di mana Aa (mg), Ab (mg), dan Ac (mg) mewakili RV awal, RV yang tidak terikat, dan IR780-TiS₂, masing-masing.
Spektrometer inframerah transformasi Fourier (FTIR) Bruker TENSOR 27 (Bruker Optics Ltd., Coventry, Inggris) digunakan untuk mendeteksi struktur kimia TiS₂, IR780-TiS₂, dan R780-TiS₂/RV. Analisis Brunauer-Emmett-Teller (BET) dilakukan untuk menentukan luas permukaan spesifik sampel, dihitung dari hasil penyerapan N₂ melalui analyzer luas permukaan (Quantachrome ChemBET-3000) berdasarkan persamaan BET.
Baris Sel dan Kultur Sel
Sel kanker usus besar tikus CT26 diperoleh dari Bank Sel Tipe Koleksi Kultur Akademi Ilmu Pengetahuan China (Shanghai, China). Sel dikultur dalam medium DMEM lengkap (10% FBS + 90% DMEM) dalam inkubator lembap dengan 5% CO₂ pada 37 °C.
Lokasi In Vitro IR780-TiS₂/RV
FITC digunakan untuk melabel IR780-TiS₂/RV atau TiS₂/RV. Secara singkat, FITC dilarutkan dalam larutan etanol (2,0 mg/mL) dan dicampur dengan larutan air IR780-TiS₂/RV atau TiS₂/RV (1,0 mg/mL) di bawah pengadukan 4 jam dalam lingkungan gelap pada suhu ruangan. Campuran difusikan dalam air distilasi selama semalam untuk menghilangkan FITC dan etanol yang berlebih, menghasilkan larutan IR780-TiS₂/RV atau TiS₂/RV yang dilabel FITC. Untuk mengonfirmasi ko-lokasi mitokondri nanopartikel in vitro, sel yang diobati dengan IR780-TiS₂/RV atau TiS₂/RV yang dilabel FITC selama 5 jam dan diwarnai oleh pewarna spesifik mitokondri MitoTracker. Kemudian, internalisasi seluler IR780-TiS₂/RV atau TiS₂/RV diamati menggunakan CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.). Secara singkat, sel CT26 diinkubasi dengan TiS₂/RV dan IR780-TiS₂/RV yang dilabel FITC (dengan konsentrasi FITC yang sama) selama 5 jam. Kemudian, sel diobati dengan larutan MitoTracker Red FM (100 nM) pada 37 °C selama 30 menit. Setelah dicuci dengan PBS tiga kali, sel diamati oleh CLSM. Perangkat lunak ImageJ digunakan untuk menganalisis intensitas fluoresensi sel.
Studi Kemoterapi Tumor yang Dipicu NIR In Vitro dan Apoptosis
4 × 10³ sel/lubang CT26 dalam plates kultur 96-lubang diobati dengan RV bebas, IR780-TiS₂, IR780-TiS₂/RV, dan TiS₂/RV dengan berbagai konsentrasi RV selama 5 jam dan kemudian diiradiasi dengan atau tanpa NIR selama 3 menit (808 nm, 0,3 W/cm²). Setelah inkubasi lebih lanjut 24 jam, keberadaan sel yang diobati dianalisis dengan ensay CCK-8. Sel yang diobati juga diwarnai oleh Rhodamin123 (Sigma) dan dianalisis oleh FCM (FC 500 MCL; Beckman Coulter, USA). Deteksi apoptosis sel juga dilakukan dengan analisis FCM menggunakan kit deteksi apoptosis Annexin V-FITC/PI (Bender MedSystems, Vienna, Austria) seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Western Blot
Sel CT26 diobati dengan PBS (kontrol), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, dan IR780-TiS₂/RV + NIR (RV setara, 30 µg/mL; IR780 setara, 0,5 µg/mL) untuk inkubasi 5 jam. Setelah inkubasi lebih lanjut 24 jam, sel dikumpulkan masing-masing untuk Western blot, yang berdasarkan pada protokol yang dilaporkan sebelumnya [23]. Secara singkat, sel dilisis dan dihindari oleh protease dan Triton X-100. Elektroforesis gel poliakrilamida natrium dodeksil sulfat digunakan untuk memulihkan dan memisahkan protein yang kemudian dipindahkan ke membran PVDF dan diblokir menggunakan susu lemak 5%. Kemudian, antibodi primer yang telah dicairkan diinkubasi pada 4 °C selama 12 jam, termasuk sitokrom c (1/1000, Boster, Wuhan, China), kaspase-3 terbelah (1/1000, CST), kaspase-9 terbelah (1/1000, CST), dan aktin (1/1000, Tikus, Boster, Wuhan, China) dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder. Akhirnya, reagen ECL digunakan untuk mendeteksi protein.
Model Hewan
Untuk membentuk model tumor subkutan CT26, 1 × 10⁷ sel CT26 (100 µL, dalam PBS) disuntik secara subkutan ke punggung tikus nude Balb/c. Volume tumor = panjang × lebar²/2. Semua prosedur hewan dilakukan sesuai dengan Pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium Nasional Institutes of Health dan disetujui oleh Komite Etik Hewan Rumah Sakit Pusat Zhumadian (Henan, China).
Distribusi In Vivo
Distribusi IR780-TiS₂/RV pada tikus nude yang membawa tumor terdeteksi pada 24 jam setelah injeksi intravenek ekor dengan IR780-TiS₂/RV (150 µL, 6 mg/kg). Organ utama termasuk jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, dan tumor ditimbang dan dicerna oleh larutan akua regia. Kandungan elemen Ti dalam jaringan ini diukur oleh ICP-OES.
Kemoterapi Tumor yang Dipicu NIR In Vivo
Tikus yang membawa tumor CT26 secara acak dipisah menjadi enam kelompok (n = 6), termasuk salin, salin + NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV, dan IR780-TiS₂/RV + NIR (RV setara, 1 mg/kg; IR780 setara, 0,5 mg/kg). Kondisi iradiasi NIR adalah 808 nm, 0,3 W/cm², dan 3 menit. Selama 30 hari perawatan, volume tumor dan bobot tikus dicatat setiap 3 hari. Setelah perawatan, organ termasuk jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal dalam berbagai kelompok dijamin dan diwarnai oleh H&E.
Analisis Statistik
Hasil disajikan sebagai rata-rata ± deviasi standar. Uji t Student digunakan untuk memeriksa perbedaan signifikan antara dua kelompok. P < 0,05 dianggap signifikan dan P < 0,01 dianggap sangat signifikan.
Hasil dan Pembahasan
Persiapan dan Karakterisasi IR780-TiS₂/RV
Untuk menyiapkan IR780-TiS₂/RV, pertama-tama, nanosheet TiS₂ yang biokompatibel disiapkan melalui metode ekfoliasi yang dibantu oleh albumin serum sapi (BSA) dan ultrasonikasi seperti yang dilaporkan sebelumnya [34, 35]. Kemudian, IR780-TiS₂ disintesis dalam reaksi substitusi antara atom klorin IR780 dan kelompok amino BSA yang terserap pada nanosheet TiS₂ menggunakan agen penahan asam TEA. Akhirnya, platform IR780-TiS₂ memuat obat anti-kanker RV melalui penyerapan fisik. Diagram skematik IR780-TiS₂/RV ditunjukkan dalam Skema 1. Berkas Tambahan 1: Gambar S1 menunjukkan citra TEM TiS₂ yang diekfoliasi dengan bantuan protein, yang menunjukkan struktur nanosheet. Pola XRD nanosheet TiS₂ juga dideteksi, yang menunjukkan kristalin yang baik dari nanosheet TiS₂ yang disiapkan, konsisten dengan observasi dari TEM (Berkas Tambahan 1: Gambar S2). Setelah difungsikan, nanokomposit IR780-TiS₂/RV memiliki morfologi seperti lembaran dengan jarak jaringan 0,25 nm seperti ditunjukkan oleh mikroskop elektron transmisi (Gambar 1a, b) dan diameter rata-rata sekitar 123,6 nm dan potensial zeta −37,2 mV seperti dideteksi oleh Nanosizer (Malvern Instruments) (Gambar 1c, d). Setelah penyimpanan selama 2 minggu dalam air, FBS, atau larutan garam, ukuran rata-rata IR780-TiS₂/RV tetap konstan sekitar 123 nm (Gambar 1e) yang menunjukkan stabilitas IR780-TiS₂/RV, mungkin karena adesi BSA pada permukaan nanosheet TiS₂. Gambar 1f menunjukkan spektrum penyerapan IR780 bebas, RV bebas, nanosheet TiS₂, dan IR780-TiS₂/RV. Spektrum penyerapan IR780-TiS₂/RV menunjukkan puncak IR780 bebas dan RV bebas, yang menunjukkan bahwa IR780 dan RV berhasil dikonjugasi dengan nanosheet TiS₂. Rasio pemuatan RV IR780-TiS₂ sekitar 112% (W/W), yang tercapai melalui interaksi non-kovalen (misalnya, tumpukan π–π dan interaksi hidrofobik). Selain itu, sesuai dengan hasil BET, luas permukaan dihitung sebesar 15,2 m²/g dan 122,1 m²/g untuk bulk TiS₂ dan nanosheet TiS₂, masing-masing. Nanosheet TiS₂ yang diekfoliasi menunjukkan luas permukaan BET yang jauh lebih tinggi dibandingkan bulk TiS₂, yang menyediakan area aktif yang besar untuk pemuatan obat. Pemuatan yang tinggi mungkin disebabkan oleh luas permukaan spesifik yang besar dan adesi BSA pada nanosheet IR780-TiS₂ [23]. Untuk mengonfirmasi lebih lanjut bahwa RV dan IR780 dimuat dalam nanosheet TiS₂, spektrum FTIR nanosheet TiS₂, IR780-TiS₂, dan IR780-TiS₂/RV diukur. Dalam Berkas Tambahan 1: Gambar S6, semua puncak karakteristik nanosheet TiS₂ muncul dalam spektrum FTIR IR780-TiS₂/RV. Selain itu, tiga puncak baru muncul (~3191 cm⁻¹, ~1510 cm⁻¹, 1230 cm⁻¹) dalam spektrum IR780-TiS₂/RV, yang menunjukkan kehadiran RV dan IR780 [36, 37].
a Citra TEM IR780-TiS₂/RV. b Citra TEM resolusi tinggi IR780-TiS₂/RV. c Distribusi ukuran dan d distribusi potensial zeta IR780-TiS₂/RV. e Perubahan ukuran partikel hidrodinamik IR780-TiS₂/RV dalam air, FBS, dan larutan garam selama 2 minggu. f Spektrum penyerapan RV, IR780, nanosheet TiS₂, dan IR780-TiS₂/RV
Setelah iradiasi NIR daya rendah selama 3 menit (808 nm, 0,3 W/cm²), suhu larutan IR780-TiS₂/RV meningkat sebanding dengan konsentrasi IR780-TiS₂/RV (0, 5, 10 µg/ml), dan larutan IR780-TiS₂/RV 10 µg/ml mencapai suhu tertinggi 47,6 °C (Gambar 2a). Selain itu, IR780-TiS₂/RV telah mempertahankan efek fototermal awalnya bahkan setelah lima siklus iradiasi NIR, sementara IR780 bebas menunjukkan efek fototermal yang menurun (Gambar 2b). Hasil ini menunjukkan bahwa nanokomposit IR780-TiS₂/RV memiliki fotostabilitas yang baik.
a Efek fototermal IR780-TiS₂/RV pada iradiasi NIR (808 nm, 0,3 W/cm²) selama 3 menit. b Perubahan suhu IR780 dan R780-TiS₂/RV setelah lima siklus iradiasi NIR (808 nm, 0,3 W/cm², 3 menit). c Skema pelepasan RV yang dipicu fototermal. d Kinetika pelepasan RV dari IR780-TiS₂/RV dalam buffer PBS (pH = 7,4 dan 6,5) dengan atau tanpa iradiasi NIR (808 nm, 0,3 W/cm²). **P < 0,01, dibandingkan dengan grup pH = 7,4 dan pH = 6,5
Selanjutnya, rasio pelepasan RV diukur dalam berbagai kondisi pH dan iradiasi NIR (Gambar 2c, d). Setelah 24 jam, rasio pelepasan RV adalah 8,56% dalam kondisi fisiologis (pH 7,4), tetapi meningkat secara signifikan menjadi 16,2% pada pH 6,5, yang menunjukkan bahwa dapat ditingkatkan oleh kondisi asam lemah. Selain itu, rasio pelepasan RV lagi meningkat secara signifikan menjadi 44,8% pada pH 6,5 dan iradiasi NIR 3 menit (808 nm, 0,3 W/cm²). Hasil ini menunjukkan bahwa iradiasi NIR dapat menjadi rangsangan eksternal yang dapat dikontrol untuk memicu pelepasan RV dari IR780-TiS₂/RV. Efek ini kemungkinan disebabkan oleh panas yang dihasilkan oleh IR780-TiS₂ pada iradiasi NIR yang melemahkan interaksi adsorpsi non-kovalen antara RV dan permukaan IR780-TiS₂ [35]. Selain itu, pada lingkungan asam, H+ dapat mengubah muatan permukaan TiS₂ yang mengubah keseimbangan hidrofilik/hidrofobik nanopartikel [38, 39].
Lokasi In Vitro IR780-TiS₂/RV
Untuk menyelidiki penyerapan sel dan distribusi intrakelular IR780-TiS₂/RV, nanopartikel IR780-TiS₂/RV dilabel dengan FITC, dan CLSM digunakan untuk memvisualisasikan fluoresensi intrakelular. Setelah inkubasi 5 jam, TiS₂/RV dan IR780-TiS₂/RV menunjukkan intensitas fluoresensi yang serupa dalam sitoplasma (Gambar 3a, b), yang menunjukkan bahwa kedua nanokomposit dapat masuk ke sel, kemungkinan melalui endositosis. Namun, nanokomposit IR780-TiS₂/RV menunjukkan intensitas yang lebih besar dari fluoresensi kuning dan hijau ketika sinyal FITC digabungkan dengan label MitoTracker (Gambar 3a, c). Hasil ini menunjukkan bahwa IR780-TiS₂/RV dapat menarget mitokondri dengan efisiensi tinggi. Selain itu, distribusi IR780-TiS₂/RV dalam sitoplasma lebih dikonfirmasi menggunakan TEM, yang menunjukkan nanopartikel yang tersisa dalam beberapa mitokondri (Gambar 3d). Bersama-sama, hasil ini dengan kuat mengonfirmasi bahwa IR780-TiS₂/RV mencapai targeting mitokondri yang baik, yang lebih mempromosikan akumulasi obat mitokondri, menyebabkan toksisitas sel yang segera. Targeting mitokondri kemungkinan dimediasi oleh baik transport aktif yang diedarkan oleh polypeptide anion organik dan fitur kation lipofil, yang membuat nanopartikel sangat mengakumulasi dalam mitokondri sel tumor [30,31,32,33].
a Citra fluoresensi sel CT26 yang diinkubasi dengan TiS₂/RV atau IR780-TiS₂/RV yang dilabel FITC selama 5 jam. Fluoresensi hijau adalah sinyal FITC, dan fluoresensi merah adalah sinyal MitoTracker. b Analisis intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) yang sesuai dari TiS₂/RV atau IR780-TiS₂/RV yang dilabel FITC dalam sel dalam Gambar 3a. c Koefisien ko-lokasi yang sesuai dari TiS₂/RV atau IR780-TiS₂/RV yang dilabel FITC dan mitokondri dalam sel dalam Gambar 3a. M berarti mitokondri. **P < 0,01, dibandingkan dengan grup TiS₂/RV sendirian
Kemoterapi Tumor yang Dipicu NIR In Vitro
Pertama, efek fototermal dievaluasi in vitro. Setelah inkubasi 5 jam, IR780-TiS₂/RV menunjukkan kenaikan suhu sekitar 17 °C, sementara TiS₂/RV menunjukkan kenaikan suhu sekitar 10 °C (Gambar 4a). Efek fototermal dikaitkan dengan IR780 dan nanosheet TiS₂. Menunjukkan biokompatibilitas sebagai platform untuk pemuatan obat, IR780-TiS₂ tidak menunjukkan sitotoksisitas yang mencolok di bawah konsentrasi 300 µg/ml (Gambar 4b). Selain itu, RV dengan atau tanpa iradiasi NIR memiliki efek pembunuh sel yang bergantung pada konsentrasi yang serupa (Gambar 4c). Pada konsentrasi RV yang sama, RV mencapai efek pembunuh sel terbaik ketika dimuat oleh IR780-TiS₂ dan diiradiasi oleh NIR dibandingkan dengan semua kondisi lain, yaitu, RV bebas, IR780-TiS₂ bebas, dan RV dimuat oleh TiS₂ (Gambar 4d). Menariknya, platform IR780-TiS₂ yang tidak dimuat tidak menunjukkan efek anti-kanker yang mencolok ketika diekspose pada iradiasi NIR dibandingkan dengan tanpa iradiasi NIR (Gambar 4d), yang menunjukkan bahwa panas yang dihasilkan oleh IR780-TiS₂ pada rangsangan iradiasi NIR terutama digunakan untuk memicu pelepasan obat yang kemudian membunuh sel. Hasil ini menunjukkan bahwa IR780-TiS₂/RV dapat melepaskan RV dalam mitokondri ketika dipicu oleh iradiasi NIR dan, oleh karena itu, secara luar biasa meningkatkan konsentrasi lokal RV dalam mitokondri dan mencapai efek penahanan tumor yang lebih besar.
a Kurva perubahan suhu PBS (kontrol), sel yang diobati TiS₂/RV, atau IR780-TiS₂/RV pada iradiasi NIR 3 menit (808 nm, 0,3 W/cm²). b Sitotoksisitas in vitro terhadap sel CT26 yang diobati dengan berbagai konsentrasi IR780-TiS₂. c Keberadaan sel yang diobati dengan RV dengan atau tanpa iradiasi NIR (808 nm, 0,3 W/cm²) selama 3 menit. d Keberadaan sel yang diobati dengan IR780-TiS₂, RV, TiS₂/RV, atau IR780-TiS₂/RV dengan atau tanpa iradiasi NIR (808 nm, 0,3 W/cm²) selama 3 menit. **P < 0,01, dibandingkan dengan grup IR780-TiS₂/RV tanpa NIR sendirian
Mekanisme Kematian Sel
Untuk mengilustrasikan mekanisme di balik kemoterapi yang dipicu NIR dari IR780-TiS₂/RV, kami menganalisis jenis kematian sel, potensial membran mitokondri (Ψm), dan tingkat ekspresi protein terkait apoptosis kunci. Pertama, FCM digunakan untuk mendeteksi jenis kematian sel menggunakan pewarnaan Annexin V-FITC/PI (Gambar 5a). Pada konsentrasi RV yang sama, RV bebas, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, dan IR780-TiS₂/RV + NIR semuanya dapat menginduksi apoptosis, terutama karena kehadiran RV. Memang, RV telah dilaporkan memiliki kemampuan untuk menginduksi apoptosis. Di antara perawatan ini, IR780-TiS₂/RV + NIR menunjukkan tingkat apoptosis tertinggi sebesar 90,8%. Jalur signaling apoptosis diselidiki selanjutnya. Penurunan Ψm telah dilaporkan sebagai peristiwa kunci dalam jalur apoptosis mitokondri (intrinsik) [40]. Pada konsentrasi RV yang sama, IR780-TiS₂/RV + NIR menurunkan Ψm sekitar 85%, yang lebih signifikan dibandingkan penurunan Ψm yang diinduksi oleh IR780-TiS₂, TiS₂/RV dengan atau tanpa NIR, dan RV bebas (Gambar 5b). Eksperimen ini menunjukkan bahwa IR780-TiS₂/RV + NIR menginduksi kematian sel yang dimediasi melalui jalur apoptosis mitokondri (intrinsik) [41]. Selanjutnya, ekspresi protein yang penting untuk apoptosis, khususnya sitokrom c (cyto c), kaspase 9, dan kaspase 3, dideteksi melalui ensay Western blot. Sel yang diobati dengan IR780-TiS₂/RV + NIR mengekspresikan lebih banyak sitosol cyto c daripada yang diobati dengan RV, IR780-TiS₂/RV, atau IR780-TiS₂/RV (Gambar 5c). Translokasi cyto c adalah inisiator terpenting dari kaskade kaspase [42,43,44]. Akibatnya, ekspresi kaspase 9 terbelah dan kaspase 3 terbelah secara signifikan meningkat dalam sel yang diobati IR780-TiS₂/RV + NIR. Bersama-sama, data ini dengan jelas menunjukkan bahwa apoptosis dimediasi oleh jalur mitokondri (intrinsik).
a Apoptosis sel CT26 yang diobati dengan PBS (kontrol), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, dan IR780-TiS₂/RV + NIR oleh FCM. b Perubahan potensial membran mitokondri sel CT26 yang diobati dengan PBS (kontrol), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, dan IR780-TiS₂/RV dengan atau tanpa iradiasi NIR oleh FCM. c Ekspresi protein terkait apoptosis dalam sel CT26 yang diobati dengan PBS (kontrol), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, dan IR780-TiS₂/RV + NIR. Sitokrom c, kaspase-3 terbelah, dan kaspase-9 terbelah diuji oleh Western blot. **P < 0,01, dibandingkan dengan grup IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV + NIR, dan IR780-TiS₂
Kemoterapi Tumor yang Dipicu NIR In Vivo
Untuk mengevaluasi efektivitas kemoterapi yang dipicu NIR in vivo, tikus yang membawa tumor CT26 diobati dengan salin, salin + NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV + NIR, dan IR780-TiS₂/RV + NIR. Ukuran tumor dalam grup IR780-TiS₂/RV + NIR menurun secara signifikan, dan tumor hampir hilang setelah 30 hari perawatan, sementara dalam grup yang tersisa, volume tumor menunjukkan tren naik (Gambar 6a). Selama perawatan, tidak ada perbedaan signifikan dalam bobot badan antara grup (Gambar 6b). Akhirnya, citra H&E mengungkapkan tidak ada kekacauan jaringan atau kelainan yang terlihat dalam semua grup yang diuji (Gambar 6c). Hasil ini menunjukkan bahwa nanokomposit IR780-TiS₂/RV memiliki efek anti-tumor yang luar biasa yang dipicu NIR dan toksisitas sistemik yang rendah. Selain itu, distribusi IR780-TiS₂/RV dievaluasi in vivo. Seperti ditunjukkan dalam Berkas Tambahan 1: Gambar S4, nanopartikel sebagian besar masuk ke sistem hati dan mungkin dibuang metabol oleh sistem [45].
a Profil pertumbuhan tumor xenograft CT26 setelah injeksi intravenek salin (kontrol), RV, TiS₂/RV, dan IR780-TiS₂/RV dengan atau tanpa iradiasi NIR 3 menit (808 nm, 0,3 W/cm²). b Bobot badan tikus yang membawa tumor setelah berbagai perawatan. c Citra H&E organ utama dari semua tikus yang diobati setelah 30 hari perawatan. **P < 0,01, dibandingkan dengan salin, salin + NIR, RV, TiS₂/RV + NIR, dan IR780-TiS₂/RV
Kesimpulan
Ringkasnya, kami telah mengembangkan nanoplatform berbasis nanosheet TiS₂ yang target mitokondri dan dimuat RV untuk pelepasan obat yang dipicu NIR dan kemoterapi tumor yang ditingkatkan. Nanokomposit IR780-TiS₂/RV yang disiapkan dengan morfologi seperti lembaran menunjukkan stabilitas dan biokompatibilitas yang baik. Berkat kemampuan targeting mitokondri IR780, IR780-TiS₂/RV dapat secara selektif mengakumulasi dalam mitokondri sel tumor dan di mana dapat melepaskan RV ketika dipicu oleh iradiasi NIR. RV yang dilepaskan memfasilitasi penurunan potensial membran mitokondri, pelepasan cyto c, dan, selanjutnya, memulai kaskade reaksi kaspase untuk mempromosikan apoptosis sel tumor melalui jalur signaling mitokondri. Hasil in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa IR780-TiS₂/RV menunjukkan kemoterapi tumor yang efektif yang dipicu NIR tanpa toksisitas jaringan yang signifikan. Hasil ini menunjukkan bahwa IR780-TiS₂/RV dapat menjadi agen kemoterapi yang menjanjikan dalam praktik klinis.
