Studi tentang Terapi Ultrasound Berfokus Intensitas Tinggi yang Ditingkatkan oleh Sonodynamic N2O Microbubbles

Bahan dan Metode

Materi

1,2-Dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine (DPPC) dan 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N -[metoksi(polietilen glikol)-2000] (DSPE-mPEG2000) dibeli dari Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA). Gliserin dan agarosa diperoleh dari Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). N₂ O dan C₃ F₈ dibeli dari Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (Cina). 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI), 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) , 3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate (DAF-FM DA) dan CCK-8 dibeli dari Beyotime Biotechnology (Chongqing, China). Calcein-AM (CAM) dan propidium iodide (PI) diperoleh dari Santa Cruz Biotechnology (TX, USA). Annexin V-FITC/PI diperoleh dari Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, China). Singlet oxygen sensor green (SOSG) dibeli dari Invitrogen (NY, USA).

Persiapan N₂ O-mbs dan C₃ F₈ -mbs

N₂ O-mbs disiapkan oleh film berputar yang dikombinasikan dengan metode osilasi mekanis. Kami mengambil DPPC dan DSPE-PEG2000 sebagai bahan cangkang dan N₂ O sebagai inti. Secara singkat, 5 mg DPPC, 2 mg DSPE-PEG2000 dan 10 mL kloroform secara bersamaan dituangkan ke dalam labu alas bulat, dicampur dan dilarutkan sepenuhnya dengan gelombang ultrasonik. Kemudian, film lipid dibentuk dengan rotary evaporator (60 menit, 55 °C, 100 putaran/menit). Selanjutnya, 2 mL gliserol 10% ditambahkan untuk menghidrasi film lipid dan menyiapkan suspensi. 500 L yang ditambahkan ke tabung kapsul. Tabung kapsul ditutup dengan tutup karet. Udara dalam tabung diganti dengan N₂ O dan C₃ F₈ oleh perangkat perpindahan gas. Kemudian, suspensi diayunkan secara mekanis oleh mixer kapsul perak-merkuri (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., China) selama 150 detik. Akhirnya, suspensi yang dihasilkan menjadi sasaran sentrifugasi diferensial untuk mendapatkan target N₂ O-mbs, dan disentrifugasi pada 300 rpm selama 5 menit, dan kemudian disentrifugasi pada 800 rpm selama 5 menit. N₂ O-mb disuspensikan kembali dalam PBS dan kemudian disimpan pada suhu 4 °C untuk penggunaan lebih lanjut.

C₃ F₈ -mbs dibuat menggunakan metode osilasi mekanis yang sama, seperti yang dijelaskan sebelumnya [25]. DiI berlabel N₂ O-mbs dapat dibuat dengan menambahkan DiI selama pembentukan film spin. Perlu disebutkan bahwa N₂ O memiliki berat molekul rendah dan tidak stabil. N₂ O di microbubble mudah meluap. Oleh karena itu, waktu paruh gelembung mikro berkurang. C₃ F₈ adalah gas inert makromolekul yang banyak digunakan dalam studi agen kontras microbubble ultrasonik. C₃ F₈ dapat meningkatkan stabilitas gelembung mikro. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, N₂ O dan C₃ F₈ (2:1) dicampur sebagai N₂ O-mbs core untuk meningkatkan stabilitasnya.

Fabrikasi dan Deteksi Performa N₂ O-mbs

Morfologi dan distribusi ukuran N₂ O-mbs diamati di bawah mikroskop optik medan terang. Konsentrasi N₂ O-mbs dan C₃ F₈ -mbs dihitung dengan globulimeter sesuai dengan pedoman perhitungan. Ukuran partikel rata-rata dan potensi zeta dari N₂ O-mbs ditentukan oleh sistem hamburan sinar laser dinamis (Malvern Instruments, Malvern, UK). Struktur dan morfologi N₂ O-mbs dicirikan oleh mikroskop elektron transmisi (TEM, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokyo, Jepang). N₂ . yang disiapkan O-mbs disimpan pada suhu 4 °C. Untuk mengamati stabilitas N₂ O-mbs, morfologi dan konsentrasi dicatat pada hari pertama, kedua dan ketiga. Pada saat yang sama, ukuran partikel rata-rata dan potensi zeta dari gelembung mikro ditentukan.

Kultur Sel dan Model Hewan

Sel kanker payudara manusia (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, China) dikeluarkan di laboratorium selama kurang dari 3 bulan setelah resusitasi. Sel-sel dipelihara dalam inkubator 37 °C dengan 5% CO₂ , menggunakan DMEM yang mengandung 10% serum janin sapi, 50 g/L streptomisin dan 50 g/L penisilin. Ketika sel mencapai pertemuan 80%, mereka digunakan untuk percobaan.

Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan pedoman Komite Etika Hewan Universitas Kedokteran Chongqing. Sejumlah tertentu tikus telanjang betina (4-6 minggu; berat 15-20 g) dibeli dari Pusat Percobaan Hewan Universitas Kedokteran Chongqing (Chongqing, Cina). Untuk pembentukan tumor padat, sel MDA-MB-231 (1 × 10 ⁶ sel/mL) tersuspensi dalam salin normal (100 L) disuntikkan secara subkutan ke sayap belakang kanan setiap tikus. Semua tikus yang mengandung tumor digunakan untuk eksperimen terapeutik ketika volume tumor mencapai sekitar 150 mm ³ .

Evaluasi Serapan Intraseluler dan Biokompatibilitas N₂ O-mb

Sel MDA-MB-231 dalam fase pertumbuhan diunggulkan dengan kepadatan sekitar 1 × 10 ⁵ sel per labu mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) selama 24 jam. Selanjutnya, 100 L (1 × 10 ⁵ gelembung/mL) dari DiI berlabel N₂ Larutan pengenceran medium lengkap O-mbs ditambahkan untuk mengisi cawan confocal dengan medium. Cawan tersebut disegel dengan sealer microplate dan disimpan terbalik dalam inkubator, menjaga N₂ O-mbs bersentuhan dengan sel. Setelah 2 jam dan 4 jam inkubasi bersama, sel-sel dicuci dengan lembut 3 kali dengan PBS, difiksasi dengan paraformaldehyde (PFA) 4% selama 20 menit dan diwarnai dengan DAPI selama 20 menit. Terakhir, perilaku penargetan sel N₂ O-mbs diamati oleh CLSM (Nikon A1, Jepang).

Sitotoksisitas N₂ O-mbs dievaluasi dengan uji CCK-8 standar. Sel MDA-MB-231 diunggulkan dalam pelat 96-sumur (5 × 10 ⁴ sel/sumur) selama 24 jam. Selanjutnya, 100 L konsentrasi berbeda (1 × 10 ⁴ /mL, 1 × 10 ⁵ /mL, dan 1 × 10 ⁶ /mL) dari N₂ O-mb ditambahkan. Setelah 24 jam inkubasi, larutan CCK-8 (10 L) ditambahkan ke setiap sumur. Kemudian, sel MDA-MB-231 dikultur pada 37 ° C selama 2 jam lagi. Terakhir, absorbansi setiap sumur diukur pada 450 nm dengan pembaca pelat mikro Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, USA).

Sepuluh mencit telanjang betina sehat dengan berat kurang lebih 20 g dibagi menjadi dua kelompok secara acak. N₂ O-mbs (n =5) kelompok disuntik secara intravena dengan N₂ O-mbs (200 L, 1 × 10 ⁵ /mL) dan grup kontrol (n =5) disuntik dengan normal saline (200 L). Setelah 21 hari, organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru dan ginjal) dari semua tikus dipotong dan diwarnai dengan hematoxylin-eosin (H&E).

Efisiensi SDT In Vitro dari N₂ O-mbs

Metode untuk deteksi radikal oksigen didasarkan pada laporan sebelumnya [26]. Secara singkat, 10 L SOSG (500 M) dicampur dengan 2 mL larutan sampel. Perlakuan dikelompokkan sebagai berikut:kelompok C (kelompok kontrol kosong), PBS saja ditambahkan; N₂ Grup O-mbs, 100 L N₂ O-mbs (1 × 10 ⁵ /mL) dalam 2 mL larutan PBS ditambahkan; C₃ F₈ -mbs grup, 100 L C₃ F₈ -mbs (1 × 10 ⁵ /mL) dalam 2 mL larutan PBS ditambahkan; Kelompok LIFU, PBS disinari dengan ultrasound (2 W/cm ² ; Institute of Ultrasound Imaging of Chongqing Medical Sciences, Chongqing, China) selama 100 detik; LIFU–N₂ Grup O-mbs, PBS dengan tambahan N₂ O-mbs disinari dengan ultrasound; LIFU–C₃ F₈ -mbs grup, PBS dengan tambahan C₃ F₈ -mbs disinari ultrasonografi. Parameter perlakuan kelompok eksperimen ditetapkan sebagai 2 W/cm ² dan 100 detik melalui analisis dan perbandingan hasil eksperimen dan konsultasi literatur [27, 28]. Parameter ultrasound yang digunakan untuk tujuan pengobatan ditetapkan sebagai berikut:frekuensi, 650 kHz; panjang fokus, 12,5 mm; mode gelombang pulsa, siklus kerja 50%; dan durasi pulsa, 1 s. Generasi oksigen singlet ( ¹ O₂ ) ditentukan oleh spektrometri fluoresensi (Cary Eclipse, Agilent Technologies) dengan mengukur intensitas fluoresensi (λ eksitasi/λ emisi =504 nm/525 nm). Pemilihan intensitas dan durasi ultrasound konsisten dengan eksperimen sel in vitro.

Setelah generasi spesies oksigen reaktif ekstraseluler (ROS) terdeteksi menggunakan uji SOSG, produksi ROS intraseluler dideteksi oleh kit uji ROS berbasis DCFH-DA. Sel MDA-MB-231 diunggulkan dengan kepadatan sekitar 1 × 10 ⁵ sel per labu CLSM. Kemudian, mereka secara acak dibagi menjadi enam kelompok:kelompok kontrol (tanpa perlakuan), kelompok N₂ Grup khusus O-mbs (100 L, 1 × 10 ⁵ gelembung/mL), C₃ F₈ -mbs hanya grup (100 L, 1 × 10 ⁵ gelembung/mL), grup LIFU saja (2 W/cm ² selama 100 detik), LIFU–C₃ F₈ -mbs grup, LIFU–N₂ grup O-mbs. Setelah inkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan perlekatan sel, masing-masing kelompok menjadi sasaran intervensi eksperimental yang sesuai yang dijelaskan di atas. Kemudian, jumlah DCFH-DA yang sama (30 M) ditambahkan ke cawan yang sesuai di setiap kelompok, dan cawan diinkubasi selama 20 menit dalam gelap. Sel-sel kemudian dibilas dengan lembut 3 kali dengan PBS untuk menghilangkan probe DCFH yang tidak masuk ke dalam sel. Akhirnya, generasi ROS intraseluler ditentukan oleh CLSM. Untuk memverifikasi lebih lanjut efisiensi SDT dari N₂ O-mbs, sel-sel diunggulkan dalam piring 6-sumur, dikultur selama 24 jam dan didistribusikan secara acak ke dalam enam kelompok, seperti dijelaskan di atas. Kemudian, perlakuan yang sesuai dilakukan pada masing-masing kelompok. Sel-sel di setiap kelompok dicerna dan disiapkan menjadi suspensi sel pada konsentrasi yang sesuai dan ditempatkan ke dalam cawan CLSM. Akhirnya, sel-sel dipindai oleh CLSM setelah pewarnaan bersama dengan pewarna CAM dan PI untuk membedakan sel mati (merah) dan hidup (hijau). Apoptosis dideteksi dengan flow cytometry dan pewarnaan Annexin V-FITC/PI. Setelah 1 jam pengobatan, setiap kelompok sel disentrifugasi, dan sel dikumpulkan. Setelah pewarnaan bersama Annexin V-FITC/PI, deteksi flow cytometry (Becton–Dickinson, Franklin Lakes, NJ) dilakukan.

Efek Sonodinamik In Vitro dari N₂ O-mbs Meningkatkan Kemanjuran Pengobatan HIFU

Sebuah sistem HIFU (JC200, HIFU Technology Co, Ltd, Chongqing, Cina) terdiri dari unit ultrasound diagnostik, unit ultrasound terapeutik dan sistem pemrosesan pusat digunakan seperti yang dijelaskan sebelumnya [29]. Parameter HIFU yang digunakan untuk tujuan perawatan ditetapkan sebagai berikut:frekuensi kerja, 0,94 MHz; panjang fokus, 140 mm; diameter, 220 mm; dan frekuensi transduser diagnostik real-time, 3,5 MH. Transduser terintegrasi direndam dalam air tanpa gas. Untuk mengevaluasi efek peningkatan N₂ O-mbs pada pengobatan HIFU, sel MDA-MB-231 disentrifugasi, 5 × 10 ⁵ /mL, dan didistribusikan ke dalam empat kelompok:kelompok kontrol (tanpa pengobatan), Kelompok HIFU saja (125 W, 5 detik), HIFU–N₂ Hanya grup O-mbs, HIFU–C₃ F₈ -mbs hanya grup. Selanjutnya dilakukan perlakuan yang berbeda untuk masing-masing kelompok. Sel-sel yang dirawat disentrifugasi dan dicuci dengan PBS, diwarnai ganda dengan Annexin V-FITC/PI dan dipanen untuk flow cytometry. Probe oksida nitrat (NO) DAF-FM digunakan untuk mendeteksi NO dalam supernatan dari setiap kelompok perlakuan. Semua percobaan dilakukan 3 kali. TEM digunakan untuk mengidentifikasi morfologi ultrastruktur dari sel yang dirawat. Setelah setiap perlakuan, sel-sel yang dirawat segera difiksasi dengan 2% OsO₄ , didehidrasi dalam serangkaian alkohol bergradasi, dan tertanam rata di Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Bagian ultra tipis (100 nm) disiapkan, diwarnai dengan uranil asetat dan timbal sitrat, dan diperiksa di bawah mikroskop elektron.

Ex Vivo dan In Vivo Efek Sonodinamik dari N₂ O-mbs Meningkatkan Khasiat Ablasi HIFU

Jaringan hati sapi segar dibeli dari rumah potong hewan lokal dan digunakan dalam waktu 12 jam setelah penyembelihan. Hati sapi ex vivo segar dengan sedikit jaringan ikat dan lebih sedikit pembuluh darah diiris menjadi bagian 10 cm × 5 cm × 5 cm dan dihilangkan gasnya selama 1 jam pada suhu 37 °C. Hati sapi dibagi menjadi tiga kelompok:C₃ F₈ -mbs grup, N₂ Grup O-mbs dan grup PBS. Pertama, hati sapi yang baru diisolasi ditempatkan dalam wadah berisi air yang telah dideaerasi. Kemudian, 200 L (1 × 10 ⁵ bubble/mL) microbubbles di PBS langsung disuntikkan ke hati sapi dengan cara yang ditunjukkan pada Gambar. 6a. Di bawah bimbingan transduser ultrasound diagnostik, titik fokus HIFU diposisikan di tempat suntikan. Kemudian, transduser terapeutik digunakan untuk melakukan ablasi 5 detik pada daya yang berbeda (100 W, 125 W, 150 W) di tempat injeksi hati sapi. Akhirnya, volume nekrotik koagulatif dari area target di jaringan hati sapi dihitung menurut panjang, lebar, dan kedalaman maksimum yang diukur (mm) dengan persamaan berikut:V (mm ³ ) =/6 × panjang × lebar × kedalaman. Selanjutnya, nilai abu-abu dari area target sebelum dan sesudah ablasi HIFU pada setiap kelompok dicatat pada gambar ultrasound diagnostik.

Dua puluh tikus pembawa tumor secara acak dibagi menjadi empat kelompok (n =5 per kelompok), termasuk kelompok kontrol (tanpa pengobatan apa pun), kelompok HIFU–PBS, HIFU–C₃ F₈ -mbs grup, dan HIFU–N₂ grup O-mbs. HIFU (125 W, 5 s) ablasi tumor diterapkan setelah tikus menerima injeksi intravena 200 L C₃ F₈ -mbs grup, N₂ O-mbs dan PBS. Prosedur ablasi HIFU pada tumor padat mirip dengan hati sapi yang diisolasi secara ex vivo. Pertama, mencit dibius dengan pentobarbital 1% (8 mL/kg). Situs tumor tikus diinokulasi ke dalam wadah yang berisi air deaerasi. Di bawah bimbingan transduser ultrasound diagnostik, titik fokus HIFU diposisikan pada jaringan tumor. Bobot tubuh tikus dan volume tumor dicatat dengan interval 3 hari. Akhirnya, semua tikus dibunuh 21 hari setelah pengobatan dan jaringan tumor dibedah dari tikus dan kemudian dikirim untuk H&E, pewarnaan antigen inti sel (PCNA), terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL).

Analisis Statistik

Semua data disajikan dan dianalisis dengan GraphPad Prism (versi 7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Data dinyatakan sebagai mean ± SD. Setiap percobaan diulang minimal 3 kali. Analisis statistik dilakukan dengan one-Way ANOVA dengan post-test Bonferroni (membandingkan semua kelompok) atau post-test Dunnett (membandingkan semua kelompok dengan kelompok kontrol). Nilai p <0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

Karakterisasi N₂ O-mbs

Persiapan N₂ O-mbs dengan metode osilasi mekanis yang dimodifikasi menghasilkan suspensi putih susu yang sangat stabil (Gbr. 1a). N₂ O-mbs tidak berubah secara signifikan dalam ukuran partikel dan morfologi setelah 72 jam penyimpanan pada suhu kamar. Di bawah mikroskop cahaya, N₂ O-mbs diamati dengan ukuran seragam, dispersi yang baik dan stabilitas tinggi (Gbr. 1b). Konsentrasi N₂ O-mbs adalah 5,12 ± 0,45 × 10 ⁸ gelembung/mL. Seperti yang ditunjukkan pada gambar TEM (Gbr. 1c), ukuran N₂ O-mbs didistribusikan secara merata, dan ukuran rata-rata adalah sekitar 450 nm. N₂ Hasil hamburan cahaya dinamis O-mb mengungkapkan diameter hidrodinamik 458,1 ± 17,26 nm (indeks polidispersitas =0,368; Gambar 1d), yang konsisten dengan hasil TEM. Potensi N₂ O-mbs adalah 16,2 ± 0,35 mV (Gbr. 1e) (File tambahan 1:Gambar S1).

a Foto-foto N₂ O-mb terdispersi dalam air deionisasi; b gambar N₂ O-mbs di bawah mikroskop optik medan terang; c gambar mikroskop elektron transmisi N₂ O-mbs; d distribusi ukuran N₂ O-mbs; e potensi zeta yang jelas dari N₂ O-mbs

Serapan Intraseluler dan Biokompatibilitas N₂ O-mbs

Sitotoksisitas N₂ O-mbs terhadap sel in vitro diselidiki dengan metode CCK-8. Kami mendefinisikan viabilitas sel dari kelompok kontrol sebagai 100%. Setelah 24 jam inkubasi, hasil viabilitas sel tidak menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan terhadap sel MDA-MB-231. Bahkan pada N₂ yang tinggi Konsentrasi O-mb, viabilitas sel tetap lebih besar dari 95% (Gbr. 2a). Sitotoksisitas N₂ O-mbs in vivo pada tikus telanjang yang sehat dianalisis. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2b, analisis histopatologi organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru dan ginjal) menunjukkan bahwa N₂ O-mbs tidak menyebabkan kerusakan toksik yang signifikan pada tikus. Hasil ini menunjukkan bahwa N₂ O-mb memiliki biokompatibilitas tinggi.

a Viabilitas sel ditentukan dengan uji CCK-8; b Pewarnaan H&E organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru dan ginjal) pada tikus telanjang betina sehat dengan atau tanpa menerima N₂ O-mbs; c gambar dari a ke d tampilkan sel dalam bidang terang, inti sel diwarnai oleh DAPI, N₂ O-mbs diwarnai oleh DiI, dan hasil gabungan dari tiga gambar fluoresensi; bilah skala =50 m [NS tidak signifikan, dibandingkan dengan kelompok kontrol (0 gelembung/mL)]

Serapan intraseluler dari N₂ O-mbs selama waktu inkubasi yang lama (2 jam dan 4 jam) divisualisasikan oleh CLSM. Inkubasi sel dengan N₂ . berlabel DiI O-mbs menghasilkan akumulasi sejumlah besar N₂ O-mbs di membran sel kanker dan sitoplasma. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2c, ada kolokalisasi yang baik dari neon merah N₂ O-mbs dengan sel fluorescent biru. Temuan ini menunjukkan bahwa N₂ O-mb secara efisien diinternalisasi ke dalam sel kanker MDA-MB-231.

Efek Sonodinamik dari N₂ O-mbs In Vitro

SOSG adalah probe deteksi oksigen singlet yang umum digunakan yang sangat sensitif dan andal untuk mendeteksi pembentukan radikal bebas oksigen. Untuk mengeksplorasi potensi N₂ O-mbs sebagai sonosensitizer, SOSG digunakan untuk mendeteksi generasi ROS secara in vitro [30, 31]. SOSG menggabungkan dengan ¹ O₂ untuk membentuk SOSG-EP, yang ditandai dengan peningkatan intensitas fluoresensi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, setelah iradiasi ultrasonik larutan SOSG yang mengandung N₂ O-mbs, nilai intensitas fluoresensi meningkat secara signifikan; dibandingkan dengan kelompok lainnya, produksi radikal bebas oksigen meningkat secara signifikan (p <0,01).

a Spektrum fluoresensi SOSG dengan N₂ O-mbs disinari oleh LIFU; b viabilitas sel ditentukan dengan uji CCK8; c gambar confocal dari generasi ROS intraseluler (fluoresensi hijau menunjukkan pewarnaan positif untuk ROS yang diwarnai dengan DCFH-DA); d nilai intensitas fluoresensi rata-rata (DCFH-DA) setiap kelompok dihitung dengan Gambar J. (Data ditampilkan sebagai mean ± SD, n =5 per grup, *p <0,05, dibandingkan dengan LIFU–C₃ F₈ -mbs grup)

Selain deteksi generasi ROS dalam larutan air setelah iradiasi ultrasonik N₂ O-mbs, kit uji DCFH-DA ROS digunakan untuk menentukan produksi ROS intraseluler oleh N₂ O-mbs. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b, kelompok kontrol positif menunjukkan intensitas fluoresensi terkuat. Sinyal fluoresensi hijau terkuat berikutnya hanya muncul di LIFU–N₂ Kelompok O-mbs, mengungkapkan produksi konsekuensial ROS dalam kehadiran simultan N₂ O-mbs dan iradiasi LIFU. Namun, tidak ada fluoresensi yang jelas terdeteksi di salah satu kelompok yang tersisa (Gbr. 3c). Viabilitas sel dari kelompok kontrol didefinisikan sebagai 100%. Hasil uji CCK-8 menunjukkan sekitar 46% kematian sel di LIFU–N₂ Grup O-mbs (Gbr. 3d). Sitotoksisitas N₂ O-mbs dalam kombinasi dengan LIFU dievaluasi dengan pengamatan CLSM kematian sel setelah pengobatan. CAM digunakan untuk mewarnai sel hidup dengan fluoresensi hijau. PI digunakan untuk menodai sel-sel mati dengan fluoresensi merah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, ada banyak sel mati di LIFU–N₂ grup O-mbs. Selanjutnya, hasil flow cytometry menunjukkan bahwa tingkat apoptosis kelompok sel MDA-MB-231 secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok lain (p <0,05) setelah gabungan N₂ O-mbs dengan pengobatan LIFU (Gbr. 4b). Gabungan C₃ F₈ -mbs dengan pengobatan LIFU tidak menyebabkan kematian sel yang jelas atau apoptosis. Hasilnya lebih lanjut menunjukkan bahwa apoptosis dan nekrosis yang luas terjadi sebagai respons terhadap SDT. Hasil flow cytometry konsisten dengan hasil CLSM. Hasil ini menunjukkan bahwa N₂ O-mbs dikombinasikan dengan LIFU menginduksi apoptosis sel tumor in vitro (File tambahan 2:Gambar S2; File tambahan 3:Gambar S3).

a Analisis flow cytometry dari apoptosis dan nekrosis sel tumor; b gambar confocal dari sel MDA-MB-231 yang diwarnai bersama CAM / PI setelah berbagai perawatan. Bilah skala adalah 100 m

Penilaian Efek Sinergis HIFU In Vitro pada Sel Kanker

Hasil flow cytometry ditunjukkan pada Gambar 5a. Keduanya N₂ O-mbs dan C₃ F₈ -mbs meningkatkan kematian sel MDA-MB-231 setelah ablasi HIFU. Selanjutnya, dibandingkan dengan HIFU-C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs secara signifikan meningkatkan apoptosis MDA-MB-231 (p <0,05; Gambar 5b). Hasil uji NO menunjukkan bahwa intensitas fluoresensi supernatan HIFU–N₂ Kelompok O-mbs juga secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok yang tersisa (p <0,05) (Gbr. 5c). Perubahan sitoplasma dan organel diamati oleh TEM (Gbr. 5d). Sel pada kelompok kontrol (tanpa perlakuan apapun) menunjukkan morfologi sel yang lengkap. Sejumlah besar zat vakuolar ditemukan di sitoplasma sel kelompok HIFU. Tetapi sel-sel masih memiliki membran sel dan membran inti yang lengkap. Namun, baik HIFU–N₂ Grup O-mbs dan HIFU–C₃ F₈ Kelompok -mbs menunjukkan hilangnya integritas membran sel dan disintegrasi lengkap dari struktur sel. Patut disebutkan bahwa pengamatan TEM hanya sesaat pada proses kematian sel dan apoptosis setelah perlakuan pada masing-masing kelompok. N₂ O-mbs sebagai gelembung mikro eksogen memiliki efek sinergis yang jelas pada pengobatan HIFU. Dalam HIFU–N₂ Grup O-mbs, efek sonodinamik dari N₂ O-mbs dapat mempromosikan lebih banyak apoptosis sel. Hasilnya telah divalidasi dalam deteksi flow cytometry dan eksperimen in vivo (File tambahan 4:Gambar S4; File  tambahan 5:Gambar S5)

a Hasil uji pengikatan Annexin V-FITC/PI; b rata-rata tingkat apoptosis sel pada setiap kelompok; c analisis kuantitatif generasi NO dari N₂ O-mbs disinari oleh HIFU; d gambar mikroskop elektron transmisi sel. Bilah skala adalah 100 m. (Data ditampilkan sebagai mean ± SD, n =5 per grup, *p <0,05, dibandingkan dengan kontrol, HIFU , HIFU–C₃ F₈ -mbs grup)

N₂ O-mbs sebagai Sinergis untuk Terapi HIFU

Setelah ablasi HIFU dari hati sapi yang diisolasi, wilayah nekrotik koagulatif abu-abu-putih muncul di area yang ditargetkan (Gbr. 6b). Perubahan intensitas gema rata-rata di area target sebelum dan sesudah HIFU ditunjukkan pada Gambar. 6c. Dibandingkan dengan kelompok PBS, nilai intensitas gema target C₃ F₈ -mbs grup dan N₂ O-mbs group were significantly increased after HIFU treatment (p <0.05) and increased as the HIFU ablation intensity increased. The coagulative necrotic volume of the latter two groups and the echo intensity of the B-mode ultrasound images of the target area both increased as the HIFU power increased (Fig. 6d, e).

a Schematic illustration of ex vivo HIFU ablation on degassed bovine livers; b photography of the targeted area in excised bovine liver after HIFU ablation; c real-time ultrasound images before and after HIFU irradiation on bovine livers at 100 W, 125 W and 150 W for 5 s; d quantitative analysis of echo intensity; e quantitative analysis of coagulative necrosis volume of the targeted area in the excised bovine liver after HIFU ablation. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with 100 W, 5 s, 125 W, 5 s groups)

The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU therapy was further verified in vivo. As shown in Fig. 7a, the digital photos of mice and corresponding tumor tissue were recorded 21 days after different treatment. Tumor growth was more effectively inhibited after N₂ O-mbs combined with HIFU treatment. The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU treatment was also evaluated by H&E, PCNA, and TUNEL staining (Fig. 7b), which demonstrated that N₂ O-mbs combined with HIFU irradiation could cause larger scale of tumor cell necrosis as compared with HIFU–C₃ F₈ -mbs group. The cell morphology changes exhibited in HIFU–N₂ O-mbs were more obvious than other groups, including karyopyknosis, karyorrhexis and karyolysis, indicating the substantial necrosis of cancer cells.

a Digital photos of tumor-bearing mice and ex vivo tumors 21 days after different treatments; b H&E, PCNA and TUNEL staining of tumor sections after various treatments; c the corresponding calculated tumor volume of each group after 21 days of different treatments; d body weight of tumor-bearing mice for each group. The scale bars in HE staining are 100 μm; the scale bars in TUNEL and PCNA staining are 50 μm. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with HIFU-C₃ F₈ -mbs group)

In addition, the tumor volume of HIFU–N₂ O-mbs exhibited a more significant inhibited tendency than HIFU–C₃ F₈ -mbs within the 21 days (Fig. 7c, d).

Diskusi

HIFU, as a new method of oncotherapy, has been clinically recognized and has achieved notable progress in the treatment of many solid tumors [32]. The thermal effect, cavitation effect, mechanical effect and acoustic chemical effect play significant roles in killing tumor cells and causing irreversible damage to the target area tissue during HIFU ablation [33]. HIFU has limited impact on surrounding normal tissues and is essentially a non-invasive tumor treatment. However, the energy carried by the ultrasound is attenuated due to increased transmission distance, absorption by the blood flow in the target area and the blockage of bones or gas in the body during the HIFU treatment, so that the energy transferred to the target area is reduced. However, prolonging the ablation time and increasing the treatment power increases the risk of normal tissue damage, such as skin burns, neurovascular damage and other complications [34]. Therefore, it is necessary to increase the efficacy of HIFU. Many studies have confirmed that both microbubbles and SDT can improve the efficacy of HIFU [15, 16, 35]. N₂ O-loaded microbubbles prepared in this study have a smaller particle size, but similar characteristics as ultrasonic microbubble contrast agents. Studies have shown that nano/microbubbles have the same imaging capability as microbubbles in vitro, but have greater capability than microbubbles in vivo [36]. So, N₂ O-mbs not only could be used for ultrasound guidance and localization for HIFU treatment, but also could be used as exogenous microbubbles to enhance the efficacy of HIFU (Additional file 6:Figure S6). At the same time, the sonodynamic effect of N₂ O-mbs could effectively improve the efficacy of HIFU. The generation of ROS after ultrasonic excitation is one of the most important factors for sonosensitizers [16]. To verify the sonosensitivity of N₂ O-mbs, the production of ROS in both extracellular and intracellular environments was detected in this study. The consistent result of both tests showed that N₂ O-mbs can generate ROS in both aqueous solution and intracellularly. Studies have also shown that gases (N₂ dan O₂ ) trapped in cavitation nuclei in solution can undergo cleavage reactions and produce N and O free radicals [37, 38], as follows:

$$ {N}_2O\to {N}_2+{O}_2\kern0.50em {O}_2\to 2\bullet O\ \ \ {N}_2\to 2N.N.+ HO.\to NO+H. NO+ HO.\to HNO $$

The cavitation effect and the advantage of microbubble packaging reduce the difficulty of the N₂ O reaction [39]. When incubated with cells, N₂ O-mbs exhibit good biocompatibility. The high selectivity, high affinity and high drug loading of nanoparticles [40], as well as the active phagocytosis by cells, promote efficient N₂ O-mbs binding to cancer cells. The nanobubbles display increased penetration, stability and ease of cell entry or aggregation around the cells [36]. In addition, the sonoporation effect of ultrasound can effectively promote the transfer of microbubbles into cells [41].

In contrast to the traditional microbubble contrast agent C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs have a greater inhibitory effect on cell growth after ultrasonic irradiation, which is characterized by increased intracellular ROS, decreased cell viability, and apoptosis and necrosis. These results preliminarily suggested the sonodynamic toxic effect of N₂ O-mbs.

In the HIFU synergy experiment, the treatment parameters in the experimental group were set to 125 W for 5 s by analyzing and comparing the experimental results and consulting the literature, which validated a low HIFU power could induce sufficient ablation effect and reduce adverse effects. The results showed that N₂ O-mbs increased the necrosis and advanced apoptosis of more tumor cells. N₂ O-mbs acted as a nanoscale microbubble synergizer and its sonodynamic effect in response to HIFU may be the reason for the different experiment results. As a microbubble, N₂ O-mbs increased the deposition of HIFU energy in the target area and increased the temperature of the target area and increased the thermal effect of HIFU treatment [11]. The generation of the cavitation effect is closely related to the cavitation threshold and cavitation nucleus concentration [42]. N₂ O-mbs were cavitation nucleus that reduce the cavitation threshold of HIFU and facilitate the cavitation effect. Therefore, N₂ O-mbs effectively promoted cell necrosis. As a nanoscale microbubble synergizer, N₂ O-mbs were lysed and generate free radicals and nitrogen oxide in response to ultrasound. Studies have confirmed that ROS are important factors in apoptosis induction [43]. It is worth noting that many kinds of free radicals can cause damage to cells. In addition to the generation of oxygen radicals, N₂ O can generate other types of free radicals in cleavage reactions, such as nitrogen free radicals, which contribute to the killing of tumor cells. A small amount of nitric oxide (NO) production was detected in the cell supernatant after HIFU treatment, further indicating that the N₂ O cleavage reaction occurred. An et al. [44] reported that NO may have an anti-tumor function, the mechanism of which involves NO attacking suspected iron enzymes that cause cells to fail to grow and divide when they are trapped. In addition, unstable NO can interact with oxygen molecules to form hydroxyl radicals (HO ^· ) and NO₂ . Hydroxyl radicals are extremely cytotoxic and promote tumor cell apoptosis. NO is also an endothelium-derived relaxing factor. The generation of NO may be the reason for hyperaemia and abnormal swelling in patients during HIFU operation. In an excised bovine liver experiment, we carefully compared the echo intensity of B-mode ultrasound images, pathological changes and coagulative necrotic volume of the target area after HIFU ablation in the presence of N₂ O-mbs, C₃ F₈ -mbs and PBS. All of these results were consistent. Compared with PBS, N₂ O-mbs effectively enhanced the ablation effect of HIFU. This synergistic effect was also better demonstrated in the ablation of solid tumor in vivo, manifested by tumor cell apoptosis increased, tumor volume reduced and tumor growth inhibition. This finding further indicates that N₂ O-mbs may be a novel auxiliary agent for ultrasound that can be used to promote HIFU thermal tumor ablation. The synergistic effect of N₂ O-mbs in HIFU and the synergistic mechanism provide new ideas and theoretical practice for HIFU synergist research. But, the other related mechanisms of the synergy should be further explored. The effect of tumor ablation by HIFU combined with N₂ O-mbs should be further addressed.

Kesimpulan

In summary, we have developed N₂ O-mb nanoparticles. The characterization and biocompatibility of the N₂ O-mbs were determined. The sonosensitivity of N₂ O-mbs was examined by detecting the production of ROS in aqueous solution and intracellularly. Compared with C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs generated ROS and promoted the apoptosis and necrosis of tumor cells, which exhibited extraordinary sonosensitivity. In the HIFU synergy experiments, the sonodynamic effects of N₂ O-mbs significantly increased the apoptosis and necrosis of tumor cells in vitro, and increased the coagulative necrotic volume and echo intensity in the ex vivo isolated bovine liver target area, and effectively inhibited tumor growth in vivo. These results suggested that N₂ O-mbs could be a new kind of sonosensitizer and a novel auxiliary agent for ultrasound therapy that can be used for the ablation of tumors by HIFU.

Ketersediaan Data dan Materi

The conclusions made in this manuscript are based on the data which are all presented and shown in this paper.

Singkatan

N₂ O-mbs:

N₂ O microbubbles

C₃ F₈ -mbs:

C₃ F₈ microbubbles

HIFU:

high-intensity focused ultrasound

LIFU:

low-intensity focused ultrasound

SOSG:

singlet oxygen sensor green

SDT:

sonodynamic therapy

DPPC:

1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine

DSPE-mPEG2000:

1,2-distearoyl-sn-glycero-3phosphoethanolamine-N -[methoxy(polyethylene glycol)-2000

DAPI:

4′,6-diamidino-2-phenylindole

DiI:

1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

DCFH-DA:

2′,7′-dichlorofluorescin diacetate

DAF-FM:

3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate

CAM:

Calcein-AM

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

confocal laser scanning microscopy

TEM:

transmission electron microscope

DMEM:

Medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco

FBS:

fetal bovine serum

PBS:

phosphate-buffered saline

DI:

deionized water

ROI:

regions of interest

ROS:

reactive oxygen species

NO:

nitric oxide

Fabrikasi mudah dari nanokomposit karet alam/silika berstruktur meso dengan stabilitas termal dan hidrofobisitas yang ditingkatkan Efek Fotogalvanik pada Monolayer MoS2 yang Didoping Nitrogen dari Prinsip Pertama