Meningkatkan Terapi Kanker HIFU Menggunakan Mikrobubuk Sonodinamik N2O
Abstrak
Ultrasuara fokus tinggi (HIFU) adalah metode representatif terapi kanker non-invasif, tetapi efensi terapi yang rendah dan risiko kerusakan pada jaringan normal di sekitarnya menghambat pengembangan dan aplikasi klinis lebih lanjut. Terapi sonodinamik (SDT) membunuh sel tumor melalui molekul oksigen reaktif yang dihasilkan oleh sonosensitizer selama pengobatan ultrasuara. SDT dapat meningkatkan efensi HIFU seperti mikrobubuk. Dalam karya ini, kami mengembangkan mikrobubuk N2O skala nano (N2O-mbs) dengan metode osilasi mekanis yang ditingkatkan. Mikrobubuk ini menunjukkan kompatibilitas biologis yang baik dan ikatan sel tumor. Sonosensitivitas N2O-mbs terdeteksi baik secara seluler maupun intrakeluler melalui deteksi generasi spesies oksigen reaktif. Efek toksik mikrobubuk sonodinamik ini pada sel tumor dan efek sinergi pada pengobatan HIFU dievaluasi. Apoptosis yang signifikan disebabkan oleh spesies oksigen reaktif yang dihasilkan oleh N2O-mbs di bawah irian ultrasuara. N2O-mbs bersama HIFU meningkatkan nekrosis dan apoptosis sel tumor in vitro dan volume nekrosis koagulatif serta intensitas gema pada area target hati sapi ex vivo. Mikrobubuk sonodinamik ini juga telah terbukti secara efisien menghambat pertumbuhan tumor in vivo. N2O-mbs memiliki dampak signifikan pada pengobatan dan efek ablasi HIFU karena keuntungan mikrobubuk dan sonosensitivitas luar biasa. Temuan ini menunjukkan bahwa N2O-mbs mungkin menjadi agen pendamping ultrasuara baru yang dapat digunakan untuk mempromosikan ablasi termal tumor HIFU.
Pendahuluan
Tumor ganas adalah salah satu penyakit besar yang mengancam nyawa dan kesehatan manusia [1]. Ultrasuara fokus tinggi (HIFU) adalah teknik baru untuk ablasi lokal non-invasif tumor. HIFU telah berhasil digunakan dalam pengobatan tumor padat ganas dan jinak di hati, ginjal, pankreas, prostat, payudara, tulang, dan rahim [2, 3]. Namun, keterbatasan bawaan HIFU, seperti penurunan energi ultrason selama pengobatan, penurunan akumulasi energi pada area target, dan kerusakan jaringan sehat non-target mengurangi efek terapeutiknya [4, 5]. Lapangan fokus yang terbentuk oleh irian HIFU biasanya kecil, biasanya dalam ukuran milimeter. Membutuhkan waktu yang lama untuk mablasi tumor besar. Perpanjang waktu irian HIFU akan meningkatkan suhu tubuh, bahkan mencapai 39,2 °C. Semakin dalam lokasi tumor di dalam tubuh, energi ablasi HIFU juga perlu ditingkatkan [6]. Hal ini meningkatkan risiko kerusakan fisik pada pasien dan mengurangi efensi dan keamanan pengobatan HIFU. Oleh karena itu, para peneliti telah berkomitmen untuk mencari cara meningkatkan efensi terapeutik HIFU dalam beberapa tahun terakhir [7,8,9]. Mikrobubuk dapat secara sinergis meningkatkan efensi terapeutik HIFU [7, 10]. Gas dalam mikrobubuk termasuk bahan impedansi akustik tinggi. Mikrobubuk meningkatkan pencitraan dan refleksi gelombang ultrason di area target ketika HIFU memancarkan area jaringan tumor [11, 12]. Mikrobubuk meningkatkan suhu area target tumor dan meningkatkan efek termal pengobatan HIFU dengan meningkatkan akumulasi energi HIFU di area target [13]. Selain itu, mikrobubuk sebagai inti kavitasi eksogen juga mengurangi ambang kavitasi jaringan dan meningkatkan efek kavitasi HIFU saat melewati sirkulasi darah ke dalam jaringan tumor [14]. Dalam beberapa tahun terakhir, studi menunjukkan bahwa terapi sonodinamik (SDT) dapat secara sinergis meningkatkan efensi pengobatan HIFU [15, 16]. Interaksi antara sonosensitizer dan ultrason menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS), termasuk oksigen tunggal dan radikal hidroksil, yang membunuh sel tumor dan menghambat pertumbuhan tumor melalui apoptosis dan nekrosis [17]. SDT telah membuat kemajuan besar dalam bidang pengobatan tumor non-invasif dalam beberapa tahun terakhir. Ini memungkinkan pengurangan dosis obat dan daya irian HIFU dibandingkan dengan monoterapi konvensional. Agar dapat memanfaatkan keuntungan keduanya, studi ini menggabungkan mikrobubuk dan efek sonodinamik untuk meningkatkan efensi HIFU lebih lanjut. Sonosensitizer adalah bagian penting dari SDT [18, 19]. Sebagian besar sonosensitizer tradisional yang saat ini dipelajari berasal dari photosensitizer. N2O adalah photosensitizer [20, 21], yang menghasilkan bahan toksik di bawah kondisi irian ultraviolet. Dalam studi ini, sonosensitivitas N2O juga awalnya dijelajahi. Kami sebelumnya menemukan bahwa aplikasi anestesi inhalasi N2O dalam operasi HIFU memperburuk tingkat cedera jaringan, termasuk peningkatan ketebalan abdomen dan kekongesan kulit [22]. Penggunaan gabungan N2O dan HIFU memainkan efek sinergis pada cedera jaringan. Namun, efek biologis apa yang dimiliki N2O dalam pengobatan HIFU tidak jelas. N2O adalah gas molekuler kecil yang relatif stabil tanpa biotransformasi dan spesifikitas jaringan pada sel. Ia dapat digunakan secara luas dalam jaringan dan tidak memiliki efek toksik pada tubuh [23, 24]. Jadi, ini adalah prospek yang menarik sebagai sonosensitizer. Dalam studi ini, mikrobubuk skala nano (N2O-mbs) disiapkan menggunakan N2O yang dibungkus lipid dan C3F8. Dosis N2O dikurangi dan rentang tindakannya in vivo juga secara efektif dibatasi pada area jaringan tumor. Efek sonodinamik N2O dan efek sinerginya pada efensi HIFU diperiksa.
Materi dan Metode
Bahan
1,2-Diheksadekanoyl-ras-glicero-3-fosfokolin (DPPC) dan 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000] (DSPE-mPEG2000) dibeli dari Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, AS). Glikerin dan agarosa diperoleh dari Sigma Aldrich (St. Louis, MO, AS). N2O dan C3F8 dibeli dari Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (Tiongkok). 4′,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI), 1,1′-dioktadesil-3,3,3′,3′-tetrametilindosiarbokianin perklorat (DiI), 2′,7′-diklorofluoresin diasetat (DCFH-DA), 3-amino,4-aminometil-2′,7′-difluoresin, diasetat (DAF-FM DA) dan CCK-8 dibeli dari Beyotime Biotechnology (Chongqing, Tiongkok). Kalsin-AM (CAM) dan iodida propidium (PI) diperoleh dari Santa Cruz Biotechnology (TX, AS). Annexin V-FITC/PI diperoleh dari Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, Tiongkok). Sensor hijau oksigen tunggal (SOSG) dibeli dari Invitrogen (NY, AS).
Pembuatan N2O-mbs dan C3F8-mbs
N2O-mbs disiapkan dengan metode film berputar gabungan dengan osilasi mekanis. Kami mengambil DPPC dan DSPE-PEG2000 sebagai bahan cangkang dan N2O sebagai inti. Singkatnya, 5 mg DPPC, 2 mg DSPE-PEG2000 dan 10 mL kloroform dituang sekaligus ke dalam botol bundar, dicampur dan larut sepenuhnya oleh gelombang ultrason. Kemudian, film lipid dibentuk oleh evaporator rotary (60 menit, 55 °C, 100 r/min). Selanjutnya, 2 mL gliserin 10% ditambahkan untuk menghidrasi film lipid dan mempersiapkan suspensi. 500 μL dari suspensi tersebut ditambahkan ke dalam tabung kapsul. Tabung kapsul ditutupi dengan tutup karet. Udara di dalam tabung diganti dengan N2O dan C3F8 oleh perangkat penggeser gas. Kemudian, suspensi tersebut diosilasi secara mekanis oleh pemosok kapsul perak–merkuri (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., Tiongkok) selama 150 detik. Akhirnya, suspensi yang dihasilkan dilakukan sentrifugasi diferensial untuk mendapatkan target N2O-mbs, dan diusentrifugasi pada 300 rpm selama 5 menit, dan kemudian diusentrifugasi pada 800 rpm selama 5 menit. N2O-mbs dire susahkan kembali dalam PBS dan disimpan pada 4 °C untuk digunakan lebih lanjut.
C3F8-mbs dibuat dengan metode osilasi mekanis yang sama, seperti yang dijelaskan sebelumnya [25]. N2O-mbs yang dilabeli DiI dapat disiapkan dengan menambahkan DiI selama pembentukan film putar. Perlu disebutkan bahwa N2O memiliki berat molekul rendah dan tidak stabil. N2O di dalam mikrobubuk mudah meluap. Oleh karena itu, umur setengah mikrobubuk berkurang. C3F8 adalah gas iners makromolekul yang banyak digunakan dalam studi mikrobubuk kontras ultrason. C3F8 dapat meningkatkan stabilitas mikrobubuk. Oleh karena itu, dalam studi ini, N2O dan C3F8 (2:1) dicampur sebagai inti N2O-mbs untuk meningkatkan stabilitasnya.
Pembuatan dan Deteksi Kinerja N2O-mbs
Morfologi dan distribusi ukuran N2O-mbs diamati di bawah mikroskop optik lapangan terang. Konsentrasi N2O-mbs dan C3F8-mbs dihitung oleh globulimeter sesuai dengan pedoman perhitungan. Ukuran partikel rata-rata dan potensi zeta N2O-mbs ditentukan oleh sistem pencitraan cahaya dinamis (Malvern Instruments, Malvern, Inggris). Struktur dan morfologi N2O-mbs dikarakterisasi dengan mikroskop transmisi elektron (TEM, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokyo, Jepang). N2O-mbs yang disiapkan disimpan pada 4 °C. Untuk mengamati stabilitas N2O-mbs, morfologi dan konsentrasi dicatat pada hari pertama, kedua, dan ketiga. Pada saat yang sama, ukuran partikel rata-rata dan potensi zeta mikrobubuk ditentukan.
Kultur Sel dan Model Hewan
Sel kanker payudara manusia (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, Tiongkok) diurai di laboratorium kurang dari 3 bulan setelah direvitalisasi. Sel dipertahankan dalam inkubator 37 °C dengan 5% CO2, menggunakan DMEM yang mengandung serum fetus sapi 10%, 50 μg/L streptomisin dan 50 μg/L penicilin. Ketika sel mencapai 80% kekeruhan, sel digunakan untuk eksperimen.
Semua eksperimen hewan dilakukan sesuai dengan pedoman Komite Etika Hewan Universitas Medika Chongqing. Sejumlah tikus telanjang betina (4–6 minggu usia; berat 15–20 g) dibeli dari Pusat Eksperimen Hewan Universitas Medika Chongqing (Chongqing, Tiongkok). Untuk pembentukan tumor padat, sel MDA-MB-231 (1 × 106 sel/mL) yang disuspendasi dalam larutan garam normal (100 μL) disuntik subkutan di pinggul kanan setiap tikus. Semua tikus yang membawa tumor digunakan untuk eksperimen terapi ketika volume tumor mencapai sekitar 150 mm3.
Pengambilan Sel dan Evaluasi Kompatibilitas Biologis N2O-mb
Sel MDA-MB-231 dalam fase pertumbuhan ditanam dengan kepadatan sekitar 1 × 105 sel per kantong mikroskop laser konfokal (CLSM) selama 24 jam. Selanjutnya, 100 μL (1 × 105 gelembung/mL) larutan pengencer medium lengkap N2O-mbs yang dilabeli DiI ditambahkan untuk mengisi kantong confocal dengan medium. Kantong ditutupi dengan seal plate dan disimpan terbalik dalam inkubator, menjaga N2O-mbs dalam kontak dengan sel. Setelah 2 jam dan 4 jam ko-inkubasi, sel dicuci lembut 3 kali dengan PBS, dienkaps dengan paraformaldehyd (PFA) 4% selama 20 menit dan diwarnai dengan DAPI selama 20 menit. Akhirnya, perilaku target sel N2O-mbs diamati oleh CLSM (Nikon A1, Jepang).
Situsik N2O-mbs dievaluasi dengan tes CCK-8 standar. Sel MDA-MB-231 ditanam pada plate 96-lubang (5 × 104 sel/lubang) selama 24 jam. Selanjutnya, 100 μL berbagai konsentrasi (1 × 104/mL, 1 × 105/mL, dan 1 × 106/mL) N2O-mb ditambahkan. Setelah 24 jam inkubasi, larutan CCK-8 (10 μL) ditambahkan ke setiap lubang. Kemudian, sel MDA-MB-231 dikultur pada 37 °C selama 2 jam lagi. Akhirnya, absorbansi setiap lubang diukur pada 450 nm dengan pembaca plate Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, AS).
Sepuluh tikus telanjang betina sehat dengan berat sekitar 20 g dibagi secara acak menjadi dua kelompok. Kelompok N2O-mbs (n = 5) diinjeksi secara intravena dengan N2O-mbs (200 μL, 1 × 105/mL) dan kelompok kontrol (n = 5) diinjeksi dengan larutan garam normal (200 μL). Setelah 21 hari, organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru dan ginjal) semua tikus diangkut dan diwarnai dengan hematoxylin–eosin (H&E).
Efensi SDT In Vitro N2O-mbs
Metode deteksi radikal oksigen didasarkan pada laporan sebelumnya [26]. Singkatnya, 10 μL SOSG (500 μM) dicampur dengan 2 mL larutan sampel. Pengelompokan perlakuan adalah sebagai berikut: kelompok C (kelompok kontrol kosong), hanya PBS ditambahkan; kelompok N2O-mbs, 100 μL N2O-mbs (1 × 105/mL) dalam 2 mL larutan PBS ditambahkan; kelompok C3F8-mbs, 100 μL C3F8-mbs (1 × 105/mL) dalam 2 mL larutan PBS ditambahkan; kelompok LIFU, PBS diirian oleh ultrason (2 W/cm2; Institut Cerdas Citra Ultrasuara Ilmu Kedokteran Chongqing, Chongqing, Tiongkok) selama 100 detik; kelompok LIFU–N2O-mbs, PBS dengan N2O-mbs ditambahkan diirian ultrason; kelompok LIFU–C3F8-mbs, PBS dengan C3F8-mbs ditambahkan diirian ultrason. Parameter perlakuan kelompok eksperimen ditetapkan sebagai 2 W/cm2 dan 100 detik melalui analisis dan perbandingan hasil eksperimen dan konsultasi literatur [27, 28]. Parameter ultrason yang digunakan untuk tujuan pengobatan ditetapkan sebagai berikut: frekuensi, 650 kHz; panjang fokus, 12,5 mm; mode gelombang pulse, 50% siklus kerja; dan durasi pulse, 1 detik. Generasi oksigen tunggal (1O2) ditentukan oleh spektrometri fluoresens (Cary Eclipse, Agilent Technologies) dengan mengukur intensitas fluoresens (λ eksitasi/λ emisi = 504 nm/525 nm). Pemilihan intensitas ultrason dan durasi selaras dengan eksperimen sel in vitro.
Setelah generasi spesies oksigen reaktif (ROS) ekstraseluler terdeteksi menggunakan tes SOSG, produksi ROS intrakeluler terdeteksi dengan kit tes ROS berbasis DCFH-DA. Sel MDA-MB-231 ditanam dengan kepadatan sekitar 1 × 105 sel per kantong CLSM. Kemudian, mereka didistribusikan secara acak ke dalam enam kelompok: kelompok kontrol (tanpa perlakuan), kelompok hanya N2O-mbs (100 μL, 1 × 105 gelembung/mL), kelompok hanya C3F8-mbs (100 μL, 1 × 105 gelembung/mL), kelompok hanya LIFU (2 W/cm2 selama 100 detik), kelompok LIFU–C3F8-mbs, kelompok LIFU–N2O-mbs. Setelah diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan penempelan sel, setiap kelompok diberi intervensi eksperimental yang sesuai yang dijelaskan di atas. Kemudian, jumlah DCFH-DA yang sama (30 μM) ditambahkan ke kantong yang sesuai dalam setiap kelompok, dan kantong diinkubasi selama 20 menit dalam kegelapan. Kemudian sel dicuci lembut 3 kali dengan PBS untuk menghapus sond DCFH yang tidak masuk ke sel. Akhirnya, generasi ROS intrakeluler ditentukan oleh CLSM. Untuk memverifikasi lebih lanjut efensi SDT N2O-mbs, sel ditanam pada plate 6-lubang, dikultur selama 24 jam dan didistribusikan secara acak ke enam kelompok, seperti yang dijelaskan di atas. Kemudian, perlakuan yang sesuai dilakukan dalam setiap kelompok. Sel dalam setiap kelompok dicerna dan disiapkan ke dalam suspensi sel dengan konsentasi yang sesuai dan ditempatkan ke dalam kantong CLSM. Akhirnya, sel discan oleh CLSM setelah diwarnai bersama dengan cat CAM dan PI untuk membedakan sel mati (merah) dan sel hidup (hijau). Apoptosis terdeteksi dengan sitometri aliran dan pewarnaan Annexin V-FITC/PI. Setelah 1 jam perlakuan, setiap kelompok sel diusentrifugasi, dan sel dikumpulkan. Setelah pewarnaan bersama Annexin V-FITC/PI, deteksi sitometri aliran (Becton–Dickinson, Franklin Lakes, NJ) dilakukan.
Efek Sonodinamik In Vitro N2O-mbs Meningkatkan Efensi Pengobatan HIFU
Sistem HIFU (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, Tiongkok) yang terdiri dari unit ultrason diagnostik, unit ultrason terapeutik, dan sistem pemrosesan pusat digunakan seperti yang dijelaskan sebelumnya [29]. Parameter HIFU yang digunakan untuk tujuan pengobatan ditetapkan sebagai berikut: frekuensi kerja, 0,94 MHz; panjang fokus, 140 mm; diameter, 220 mm; dan frekuensi transducer diagnostik real-time, 3,5 MH. Transdutor terintegrasi dienduskan dalam air yang telah di-degas. Untuk mengevaluasi efek peningkatan N2O-mbs pada pengobatan HIFU, sel MDA-MB-231 diusentrifugasi, 5 × 105/mL, dan didistribusikan ke dalam empat kelompok: kelompok kontrol (tanpa perlakuan), kelompok hanya HIFU (125 W, 5 detik), kelompok hanya HIFU–N2O-mbs, kelompok hanya HIFU–C3F8-mbs. Selanjutnya, perlakuan yang berbeda dilakukan untuk setiap kelompok. Sel yang telah diperlakukan diusentrifugasi dan dicuci dengan PBS, diwarnai ganda dengan Annexin V-FITC/PI dan dipanen untuk sitometri aliran. Sonda oksida nitrik (NO) DAF-FM digunakan untuk mendeteksi NO dalam supernatant dari setiap kelompok perlakuan. Semua eksperimen dilakukan 3 kali. TEM digunakan untuk mengidentifikasi morfologi ultrastruktur sel yang telah diperlakukan. Setelah setiap perlakuan, sel yang telah diperlakukan segera dienkaps dengan 2% OsO4, dihidrasi dalam serangkaian alkohol, dan dienkaps rata dalam Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Irisan ultra-halus (100 nm) disiapkan, diwarnai dengan asetat uranil dan sitrat timbal, dan diperiksa di bawah mikroskop elektron.
Efek Sonodinamik Ex Vivo dan In Vivo N2O-mbs Meningkatkan Efensi Ablasi HIFU
Jaringan hati sapi segar dibeli dari rumah potong hewan lokal dan digunakan dalam 12 jam setelah pembuangan. Hati sapi ex vivo segar dengan sedikit jaringan ikat dan sedikit pembuluh darah diiris menjadi bagian 10 cm × 5 cm × 5 cm dan di-degas selama 1 jam pada 37 °C. Hati sapi dibagi menjadi tiga kelompok: kelompok C3F8-mbs, kelompok N2O-mbs dan kelompok PBS. Pertama, hati sapi yang baru diisolasi ditempatkan dalam wadah yang berisi air yang telah di-degas. Kemudian, 200 μL (1 × 105 gelembung/mL) mikrobubuk dalam PBS langsung diinjeksi ke dalam hati sapi dengan cara yang ditunjukkan pada Gambar 6a. Di bawah panduan transducer ultrason diagnostik, titik fokus HIFU ditempatkan pada lokasi injeksi. Kemudian, transducer terapeutik digunakan untuk melakukan ablasi selama 5 detik pada berbagai daya (100 W, 125 W, 150 W) pada lokasi injeksi hati sapi. Akhirnya, volume nekrosis koagulatif area target dalam jaringan hati sapi dihitung berdasarkan panjang, lebar dan kedalaman maksimum (mm) yang diukur dengan persamaan berikut: V (mm3) = π/6 × panjang × lebar × kedalaman. Selain itu, nilai abu-abu area target sebelum dan setelah ablasi HIFU dalam setiap kelompok dicitrak pada citra ultrason diagnostik.
Dua puluh tikus yang membawa tumor dibagi secara acak menjadi empat kelompok (n = 5 per kelompok), termasuk kelompok kontrol (tanpa perlakuan apa pun), kelompok HIFU–PBS, kelompok HIFU–C3F8-mbs, dan kelompok HIFU–N2O-mbs. Ablasi tumor HIFU (125 W, 5 detik) dilakukan setelah tikus menerima injeksi intravena 200 μL kelompok C3F8-mbs, N2O-mbs dan PBS. Prosedur ablasi HIFU tumor padat mirip dengan hati sapi yang diisolasi ex vivo. Pertama, tikus dianesteshi dengan 1% pentobarbital (8 mL/kg). Lokasi tumor tikus diinokulasi ke dalam wadah yang berisi air yang telah di-degas. Di bawah panduan transducer ultrason diagnostik, titik fokus HIFU ditempatkan pada jaringan tumor. Berat badan tikus dan volume tumor dicatat dengan interval 3 hari. Akhirnya, semua tikus dibunuh 21 hari setelah perlakuan dan jaringan tumor diangkut dari tikus dan kemudian dikirim untuk pewarnaan H&E, pewarnaan antigen inti sel proliferasi (PCNA), dan terminal deoxynukleotidil transferase dUTP nick end labeling (TUNEL).
Analisis Statistik
Semua data disajikan dan dianalisis dengan GraphPad Prism (versi 7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, AS). Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SD. Setiap eksperimen diulang setidaknya 3 kali. Analisis statistik dilakukan dengan satu arah ANOVA dengan tes lanjutan Bonferroni (membandingkan semua kelompok) atau Dunnett tes lanjutan (membandingkan semua kelompok dengan kelompok kontrol). Nilai p < 0,05 dianggap berarti secara statistik.
Hasil
Karakterisasi N2O-mbs
Pembuatan N2O-mbs dengan metode osilasi mekanis yang dimodifikasi menghasilkan suspensi susu putih yang sangat stabil (Gambar 1a). N2O-mbs tidak berubah secara signifikan dalam ukuran partikel dan morfologi setelah penyimpanan 72 jam pada suhu ruangan. Di bawah mikroskop cahaya, N2O-mbs diamati dengan ukuran seragam, dispersi yang baik dan stabilitas tinggi (Gambar 1b). Konsentrasi N2O-mbs adalah 5,12 ± 0,45 × 108 gelembung/mL. Seperti yang ditunjukkan pada gambar TEM (Gambar 1c), ukuran N2O-mbs terdistribusi merata, dan ukuran rata-rata sekitar 450 nm. Hasil pencitraan cahaya dinamis N2O-mb menunjukkan diameter hidrodinamik 458,1 ± 17,26 nm (indeks dispersi polidispersi = 0,368; Gambar 1d), yang selaras dengan hasil TEM. Potensi N2O-mbs adalah − 16,2 ± 0,35 mV (Gambar 1e) (Berkas Tambahan 1: Gambar S1).
a Foto N2O-mbs yang terdiseminasikan dalam air deionisasi; b citra N2O-mbs di bawah mikroskop optik lapangan terang; c citra mikroskop transmisi elektron N2O-mbs; d distribusi ukuran N2O-mbs; e potensi zeta N2O-mbs
Pengambilan Sel dan Kompatibilitas Biologis N2O-mbs
Situsik N2O-mbs terhadap sel in vitro diteliti dengan metode CCK-8. Kami mendefinisikan keandalan sel kelompok kontrol sebagai 100%. Setelah 24 jam inkubasi, hasil keandalan sel tidak menunjukkan situsik yang signifikan pada sel MDA-MB-231. Bahkan pada konsentrasi N2O-mb yang tinggi, keandalan sel tetap lebih dari 95% (Gambar 2a). Situsik N2O-mbs in vivo pada tikus telanjang betina sehat dianalisis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b, analisis histopatologi organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru dan ginjal) menunjukkan bahwa N2O-mbs tidak menyebabkan keracunan yang signifikan pada tikus. Hasil ini menunjukkan bahwa N2O-mbs memiliki kompatibilitas biologis yang tinggi.
a Keandalan sel ditentukan oleh tes CCK-8; b pewarnaan H&E organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru dan ginjal) pada tikus telanjang betina sehat dengan atau tanpa menerima N2O-mbs; c citra dari a sampai d menunjukkan sel dalam lapangan terang, inti sel diwarnai oleh DAPI, N2O-mbs diwarnai oleh DiI, dan hasil gabungan dari tiga citra fluoresens; skala bar = 50 μm [NS tidak signifikan, dibandingkan dengan kelompok kontrol (0 gelembung/mL)]
Pengambilan sel N2O-mbs selama waktu inkubasi yang panjang (2 jam dan 4 jam) divisualisasikan oleh CLSM. Inkubasi sel dengan N2O-mbs yang dilabeli DiI menghasilkan akumulasi sejumlah besar N2O-mbs pada membran sel dan sitoplasma sel kanker. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2c, terdapat kolokalisasi yang baik antara N2O-mbs fluoresens merah dengan sel fluoresens biru. Temuan ini menunjukkan bahwa N2O-mbs diinternalisasi secara efisien ke dalam sel kanker MDA-MB-231.
Efek Sonodinamik N2O-mbs In Vitro
SOSG adalah sond deteksi oksigen tunggal yang umum digunakan yang sangat sensitif dan andal untuk deteksi generasi radikal bebas oksigen. Untuk mengeksplorasi potensi N2O-mbs sebagai sonosensitizer, SOSG digunakan untuk mendeteksi generasi ROS in vitro [30, 31]. SOSG berikatan dengan 1O2 untuk membentuk SOSG-EP, yang ditandai dengan peningkatan intensitas fluoresens. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3a, setelah irian ultrason larutan SOSG yang mengandung N2O-mbs, nilai intensitas fluoresens meningkat secara signifikan; dibandingkan dengan kelompok lainnya, produksi radikal bebas oksigen meningkat secara signifikan (p < 0,01).
a Spektrum fluoresens SOSG dengan N2O-mbs yang diirian oleh LIFU; b keandalan sel ditentukan oleh tes CCK8; c citra konfokal generasi ROS intrakeluler (fluoresens hijau menunjukkan pewarnaan positif ROS dengan DCFH-DA); d nilai intensitas fluoresens rata-rata (DCFH-DA) setiap kelompok yang dihitung oleh Image J. (Data ditampilkan sebagai rata-rata ± SD, n = 5 per kelompok, *p < 0,05, dibandingkan dengan kelompok LIFU–C3F8-mbs)
Selain deteksi generasi ROS dalam larutan air setelah irian ultrason N2O-mbs, kit tes ROS DCFH-DA digunakan untuk menentukan produksi ROS intrakeluler oleh N2O-mbs. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3b, kelompok kontrol positif menunjukkan intensitas fluoresens yang paling kuat. Sinyal fluoresens hijau berikutnya yang paling kuat hanya muncul pada kelompok LIFU–N2O-mbs, yang mengungkapkan produksi ROS yang signifikan pada kehadiran bersama N2O-mbs dan irian LIFU. Namun, tidak ada fluoresens yang terdeteksi pada kelompok mana pun lainnya (Gambar 3c). Keandalan sel kelompok kontrol didefinisikan sebagai 100%. Hasil tes CCK-8 menunjukkan sekitar 46% kematian sel pada kelompok LIFU–N2O-mbs (Gambar 3d). Situsik N2O-mbs dalam kombinasi dengan LIFU dievaluasi dengan pengamatan CLSM kematian sel setelah perlakuan. CAM digunakan untuk mewarnai sel hidup dengan fluoresens hijau. PI digunakan untuk mewarnai sel mati dengan fluoresens merah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4a, terdapat banyak sel mati pada kelompok LIFU–N2O-mbs. Selain itu, hasil sitometri aliran menunjukkan bahwa tingkat apoptosis sel MDA-MB-231 secara signifikan lebih tinggi dari kelompok lainnya (p < 0,05) setelah perlakuan gabungan N2O-mbs dengan LIFU (Gambar 4b). Perlakuan gabungan C3F8-mbs dengan LIFU tidak menyebabkan kematian sel atau apoptosis yang jelas. Hasil ini lebih lanjut menunjukkan bahwa apoptosis dan nekrosis yang luas terjadi sebagai respons terhadap SDT. Hasil sitometri aliran selaras dengan hasil CLSM. Hasil ini menunjukkan bahwa N2O-mbs yang dikombinasikan dengan LIFU menginduksi apoptosis sel tumor in vitro (Berkas Tambahan 2: Gambar S2; Berkas Tambahan 3: Gambar S3).
a Analisis sitometri aliran apoptosis dan nekrosis sel tumor; b citra konfokal sel MDA-MB-231 yang diwarnai bersama CAM/PI setelah berbagai perlakuan. Skala bar adalah 100 μm
Penilaian Efek Sinergi HIFU In Vitro pada Sel Kanker
Hasil sitometri aliran ditunjukkan pada Gambar 5a. Baik N2O-mbs dan C3F8-mbs meningkatkan mortalitas sel MDA-MB-231 setelah ablasi HIFU. Selain itu, dibandingkan dengan HIFU-C3F8-mbs, N2O-mbs secara signifikan meningkatkan apoptosis MDA-MB-231 (p < 0,05; Gambar 5b). Hasil tes NO menunjukkan bahwa intensitas fluoresens supernatant kelompok HIFU–N2O-mbs juga secara signifikan lebih tinggi dari kelompok lainnya (p < 0,05) (Gambar 5c). Perubahan sitoplasma dan organel diamati oleh TEM (Gambar 5d). Sel dalam kelompok kontrol (tanpa perlakuan apa pun) menunjukkan morfologi sel yang utuh. Sejumlah besar substanta vakuol ditemukan dalam sitoplasma sel kelompok HIFU. Namun, sel masih memiliki membran sel dan membran inti yang utuh. Namun, baik kelompok HIFU–N2O-mbs dan kelompok HIFU–C3F8-mbs menunjukkan kehilangan integritas membran sel dan disintegrasi lengkap struktur sel. Perlu disebutkan bahwa pengamatan TEM hanya momen dalam proses kematian sel dan apoptosis setelah perlakuan dalam setiap kelompok. N2O-mbs sebagai mikrobubuk eksogen memiliki efek sinergis yang jelas pada pengobatan HIFU. Pada kelompok HIFU–N2O-mbs, efek sonodinamik N2O-mbs dapat mempromosikan lebih banyak apoptosis sel. Hasil telah divalidasi dalam deteksi sitometri aliran dan eksperimen in vivo (Berkas Tambahan 4: Gambar S4; Berkas Tambahan 5: Gambar S5)
a Hasil tes ikatan Annexin V-FITC/PI; b rata-rata tingkat apoptosis sel dalam setiap kelompok; c analisis kuantitatif generasi NO dari N2O-mbs yang diirian oleh HIFU; d citra mikroskop transmisi elektron sel. Skala bar adalah 100 μm. (Data ditampilkan sebagai rata-rata ± SD, n = 5 per kelompok, *p < 0,05, dibandingkan dengan kontrol, HIFU, kelompok HIFU–C3F8-mbs)
N2O-mbs sebagai Sinergis untuk Terapi HIFU
Setelah ablasi HIFU hati sapi yang diisolasi, wilayah nekrosis koagulatif abu-abu putih muncul di area target (Gambar 6b). Perubahan rata-rata intensitas gema di area target sebelum dan setelah HIFU ditunjukkan pada Gambar 6c. Dibandingkan dengan kelompok PBS, nilai intensitas gema target kelompok C3F8-mbs dan kelompok N2O-mbs secara signifikan meningkat setelah perlakuan HIFU (p < 0,05) dan meningkat seiring peningkatan intensitas ablasi HIFU. Volume nekrosis koagulatif dua kelompok terakhir dan intensitas gema citra ultrason B-mode area target keduanya meningkat seiring peningkatan daya HIFU (Gambar 6d, e).
a Ilustrasi skematis ablasi HIFU ex vivo pada hati sapi yang telah di-degas; b foto area target di hati sapi yang diangkut setelah ablasi HIFU; c citra ultrason real-time sebelum dan setelah irian HIFU pada hati sapi pada 100 W, 125 W dan 150 W selama 5 detik; d analisis kuantitatif intensitas gema; e analisis kuantitatif volume nekrosis koagulatif area target di hati sapi yang diangkut setelah ablasi HIFU. (Data ditampilkan sebagai rata-rata ± SD, n = 5 per kelompok, *p < 0,05, dibandingkan dengan 100 W, 5 detik, 125 W, 5 detik kelompok)
Efek sinergis N2O-mbs pada terapi HIFU diverifikasi lebih lanjut in vivo. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7a, foto digital tikus dan jaringan tumor yang sesuai dicatat 21 hari setelah berbagai perlakuan. Pertumbuhan tumor lebih efektif dihindari setelah N2O-mbs dikombinasikan dengan perlakuan HIFU. Efek sinergis N2O-mbs pada pengobatan HIFU juga dievaluasi oleh pewarnaan H&E, PCNA, dan TUNEL (Gambar 7b), yang menunjukkan bahwa N2O-mbs dikombinasikan dengan irian HIFU dapat menyebabkan skala nekrosis sel tumor yang lebih besar dibandingkan dengan kelompok HIFU–C3F8-mbs. Perubahan morfologi sel yang ditampilkan pada HIFU–N2O-mbs lebih jelas daripada kelompok lainnya, termasuk piknosis, koreksis, dan lisis inti, yang menunjukkan nekrosis yang signifikan sel kanker.
a Foto digital tikus yang membawa tumor dan tumor ex vivo 21 hari setelah berbagai perlakuan; b pewarnaan H&E, PCNA dan TUNEL irisan tumor setelah berbagai perlakuan; c volume tumor yang dihitung masing-masing setiap kelompok setelah 21 hari berbagai perlakuan; d berat badan tikus yang membawa tumor untuk setiap kelompok. Skala bar pada pewarnaan HE adalah 100 μm; skala bar pada pewarnaan TUNEL dan PCNA adalah 50 μm. (Data ditampilkan sebagai rata-rata ± SD, n = 5 per kelompok, *p < 0,05, dibandingkan dengan kelompok HIFU-C3F8-mbs)
Selain itu, volume tumor HIFU–N2O-mbs menunjukkan kecenderungan penahanan yang lebih signifikan daripada HIFU–C3F8-mbs selama 21 hari (Gambar 7c, d).
Diskusi
HIFU, sebagai metode baru terapi onkologi, telah diakui secara klinis dan telah mencapai kemajuan yang signifikan dalam pengobatan banyak tumor padat [32]. Efek termal, efek kavitasi, efek mekanis dan efek akustik kimia memerankan peran penting dalam membunuh sel tumor dan menyebabkan kerusakan yang tidak dapat diperbaiki pada jaringan area target selama ablasi HIFU [33]. HIFU memiliki dampak terbatas pada jaringan normal di sekitarnya dan pada dasarnya adalah pengobatan tumor non-invasif. Namun, energi yang dibawa oleh ultrason terattenuasi karena jarak transmisi yang meningkat, penyerapan oleh aliran darah di area target dan penghalang tulang atau gas di dalam tubuh selama pengobatan HIFU, sehingga energi yang ditransfer ke area target berkurang. Namun, memperpanjang waktu ablasi dan meningkatkan daya pengobatan meningkatkan risiko kerusakan jaringan normal, seperti luka bakar kulit, kerusakan saraf dan pembuluh darah dan komplikasi lainnya [34]. Oleh karena itu, perlu untuk meningkatkan efensi HIFU. Banyak studi telah mengkonfirmasi bahwa baik mikrobubuk maupun SDT dapat meningkatkan efensi HIFU [15, 16, 35]. Mikrobubuk N2O yang dimuat yang disiapkan dalam studi ini memiliki ukuran partikel yang lebih kecil, tetapi karakteristik yang sama dengan mikrobubuk kontras ultrason. Studi menunjukkan bahwa nano/mikrobubuk memiliki kemampuan citra yang sama dengan mikrobubuk in vitro, tetapi memiliki kemampuan yang lebih besar dari mikrobubuk in vivo [36]. Jadi, N2O-mbs tidak hanya dapat digunakan untuk panduan dan lokasi ultrason untuk pengobatan HIFU, tetapi juga dapat digunakan sebagai mikrobubuk eksogen untuk meningkatkan efensi HIFU (Berkas Tambahan 6: Gambar S6). Pada saat yang sama, efek sonodinamik N2O-mbs dapat secara efektif meningkatkan efensi HIFU. Generasi ROS setelah irian ultrason adalah salah satu faktor terpenting untuk sonosensitizer [16]. Untuk memverifikasi sonosensitivitas N2O-mbs, produksi ROS di lingkungan ekstraseluler dan intrakeluler terdeteksi dalam studi ini. Hasil yang konsisten dari kedua tes menunjukkan bahwa N2O-mbs dapat menghasilkan ROS baik dalam larutan air maupun intrakeluler. Studi juga telah menunjukkan bahwa gas (N2 dan O2) yang terperangkap dalam inti kavitasi dalam larutan dapat mengalami reaksi pembelahan dan menghasilkan radikal bebas N dan O [37, 38], sebagai berikut:
Efek kavitasi dan keuntungan kemasan mikrobubuk mengurangi kesulitan reaksi N2O [39]. Saat diinkubasi dengan sel, N2O-mbs menunjukkan kompatibilitas biologis yang baik. Keselektifitas tinggi, afinitas tinggi dan muatan obat tinggi nanopartikel [40], serta fagosit aktif oleh sel, mempromosikan ikatan yang efisien N2O-mbs pada sel kanker. Nanobubuk menunjukkan penetrasi, stabilitas dan kemudahan masuk sel atau agregasi di sekitar sel yang meningkat [36]. Selain itu, efek sonoporasi ultrason dapat secara efektif mempromosikan transfer mikrobubuk ke dalam sel [41].
Diberkaitan dengan mikrobubuk kontras tradisional C3F8-mbs, N2O-mbs memiliki efek inhibisi yang lebih besar pada pertumbuhan sel setelah irian ultrason, yang ditandai dengan peningkatan ROS intrakeluler, penurunan keandalan sel, dan apoptosis serta nekrosis. Hasil ini secara awal menyiratkan efek toksik sonodinamik N2O-mbs.
Dalam eksperimen sinergi HIFU, parameter perlakuan dalam kelompok eksperimen ditetapkan pada 125 W selama 5 detik dengan menganalisis dan membandingkan hasil eksperimen dan berkonsultasi dengan literatur, yang memvalidasi bahwa daya HIFU yang rendah dapat menginduksi efek ablasi yang cukup dan mengurangi efek samping. Hasil menunjukkan bahwa N2O-mbs meningkatkan nekrosis dan apoptosis lanjutan dari lebih banyak sel tumor. N2O-mbs bertindak sebagai sinergis mikrobubuk skala nano dan efek sonodinamiknya dalam respons terhadap HIFU mungkin adalah alasan hasil eksperimen yang berbeda. Sebagai mikrobubuk, N2O-mbs meningkatkan deponesi energi HIFU di area target dan meningkatkan suhu area target dan meningkatkan efek termal pengobatan HIFU [11]. Generasi efek kavitasi berhubungan erat dengan ambang kavitasi dan konsentrasi inti kavitasi [42]. N2O-mbs adalah inti kavitasi yang mengurangi ambang kavitasi HIFU dan memfasilitasi efek kavitasi. Oleh karena itu, N2O-mbs secara efektif mempromosikan nekrosis sel. Sebagai sinergis mikrobubuk skala nano, N2O-mbs dilisis dan menghasilkan radikal bebas dan oksida nitrik dalam respons terhadap ultrason. Studi telah mengkonfirmasi bahwa ROS adalah faktor penting dalam induksi apoptosis [43]. Perlu diperhatikan bahwa banyak jenis radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan pada sel. Selain generasi radikal oksigen, N2O dapat menghasilkan jenis radikal bebas lainnya dalam reaksi pembelahan, seperti radikal nitrogen, yang berkontribusi pada pembunuhan sel tumor. Sejumlah kecil produksi oksida nitrik (NO) terdeteksi dalam supernatant sel setelah perlakuan HIFU, yang lebih lanjut menunjukkan bahwa reaksi pembelahan N2O terjadi. An et al. [44] melaporkan bahwa NO mungkin memiliki fungsi anti-tumor, mekanismenya melibatkan NO menyerang enzim besir yang menyebabkan sel gagal tumbuh dan berkembang ketika mereka terperangkap. Selain itu, NO yang tidak stabil dapat berinteraksi dengan molekul oksigen untuk membentuk radikal hidroksil (HO·) dan NO2. Radikal hidroksil sangat sitotoksik dan mempromosikan apoptosis sel tumor. NO juga adalah faktor relaksasi berasal dari endotel. Generasi NO mungkin adalah alasan hiperemia dan pembengkakan anormal pada pasien selama operasi HIFU. Dalam eksperimen hati sapi yang diangkut, kami secara cermat membandingkan intensitas gema citra ultrason B-mode, perubahan patologis dan volume nekrosis koagulatif area target setelah ablasi HIFU kehadiran N2O-mbs, C3F8-mbs dan PBS. Semua hasil ini selaras. Dibandingkan dengan PBS, N2O-mbs secara efektif meningkatkan efek ablasi HIFU. Efek sinergis ini juga lebih baik ditunjukkan dalam ablasi tumor padat in vivo, yang manifes dengan peningkatan apoptosis sel tumor, penurunan volume tumor dan inhibisi pertumbuhan tumor. Temuan ini lebih lanjut menunjukkan bahwa N2O-mbs mungkin menjadi agen pendamping ultrason baru yang dapat digunakan untuk mempromosikan ablasi termal tumor HIFU. Efek sinergis N2O-mbs dalam HIFU dan mekanisme sinergi memberikan ide baru dan praktik teoretis untuk penelitian sinergis HIFU. Namun, mekanisme terkait lainnya dari sinergi harus dijelajahi lebih lanjut. Effek ablasi tumor oleh HIFU dikombinasikan dengan N2O-mbs harus ditangani lebih lanjut.
Kesimpulan
Secara ringkas, kami telah mengembangkan nanopartikel N2O-mb. Karakterisasi dan kompatibilitas biologis N2O-mbs telah ditentukan. Sonosensitivitas N2O-mbs diperiksa dengan mendeteksi produksi ROS dalam larutan air dan intrakeluler. Dibandingkan dengan C3F8-mbs, N2O-mbs menghasilkan ROS dan mempromosikan apoptosis dan nekrosis sel tumor, yang menunjukkan sonosensitivitas luar biasa. Dalam eksperimen sinergi HIFU, efek sonodinamik N2O-mbs secara signifikan meningkatkan apoptosis dan nekrosis sel tumor in vitro, dan meningkatkan volume nekrosis koagulatif dan intensitas gema di area target hati sapi yang diisolasi ex vivo, serta secara efektif menghambat pertumbuhan tumor in vivo. Hasil ini menunjukkan bahwa N2O-mbs bisa menjadi jenis sonosensitizer baru dan agen pendamping ultrason baru yang dapat digunakan untuk ablasi tumor oleh HIFU.
Ketersediaan Data dan Bahan
Kesimpulan yang dibuat dalam naskah ini didasarkan pada data yang semua disajikan dan ditampilkan dalam naskah ini.
