Persiapan dan Evaluasi Novel Emodin-loaded Stearic Acid-g-chitosan Oligosaccharide Nanomicelles
Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk membuat dan mengkarakterisasi emodin-loaded stearic acid-g-chitosan oligosaccharide (CSO-SA/EMO) dan mengevaluasi aktivitas antitumornya secara in vitro. Dalam penelitian ini, oligosakarida asam stearat-g-kitosan digunakan sebagai pembawa dan sifat fisikokimianya ditentukan dengan metode yang berbeda. Perilaku serapan sel diperiksa menggunakan oligosakarida asam stearat-g-kitosan berlabel FITC. CSO-SA/EMO disiapkan menggunakan ultrasonikasi dan dialisis. Ukuran partikel, potensial permukaan, efisiensi penjeratan, dan perilaku pelepasan obat dipelajari secara in vitro. Efek CSO-SA/EMO pada sel kanker lambung diselidiki menggunakan uji MTT dan flow cytometry. Hasil penelitian menunjukkan ukuran partikel CSO-SA/EMO lebih besar dan potensial lebih kecil dibandingkan oligosakarida asam stearat-g-kitosan. Serapan misel 12 h oleh sel MGC803 dan BGC823 sudah cukup, dan misel dapat terakumulasi secara melimpah di lokasi lesi pada tikus sehingga mencapai penargetan EPR pasif yang baik. Uji MTT dan penghentian siklus sel menunjukkan aktivitas antitumor yang ditingkatkan CSO-SA/EMO secara signifikan terhadap sel MGC803 dan BGC823 dibandingkan dengan emodin bebas. Volume tumor, pewarnaan hematoxylin dan eosin, dan uji pelabelan terminal deoxynucleotide transferase dUTP nick-end membuktikan bahwa CSO-SA/EMO memiliki efek antitumor yang signifikan pada jaringan tumor in vivo. Kesimpulannya, metode ultrasonikasi-dialisis menyediakan metode sederhana dan efektif untuk mempersiapkan CSO-SA/EMO. Pengiriman emodine menggunakan sistem misel meningkatkan efek antitumornya secara efektif.
Pengantar
Emodin (EMO) adalah turunan antrakuinon alami yang diekstraksi terutama dari ramuan tradisional Cina seperti rhubarb, cuspidatum, dan multiflorum. Pengobatan Tradisional Cina (TCM) banyak digunakan dalam penelitian klinis karena toksisitasnya yang rendah, sedikit efek samping dan biaya rendah [1].
Studi telah menunjukkan EMO memiliki aktivitas farmakologis yang luas, termasuk penekanan kekebalan, anti-pertusis, anti-hipertensi, anti-inflamasi, antibakteri, dan aktivitas antikanker. EMO telah ditemukan untuk menghambat pertumbuhan sel kanker [2,3,4] dan untuk mengatur gen terkait untuk mengontrol apoptosis sel tumor, tumorigenesis, proliferasi sel, invasi, dan metastasis [5,6,7,8,9]. Penelitian telah menunjukkan EMO dapat menghambat beragam sel kanker, seperti sel adenokarsinoma kolorektal manusia, sel hepatokarsinoma, sel leukemia limfoid [10], dan kanker lidah manusia SCC-4 [11]. EMO dapat menghambat proliferasi sel tumor pada kanker lambung, payudara, dan prostat [7, 12]. Namun, EMO tidak menunjukkan efek sitotoksik pada sel normal seperti fibroblas gingiva manusia normal [13], sel epitel bronkial manusia [14], dan sel mammae manusia [15]. Ini menunjukkan EMO menunjukkan sitotoksisitas selektif terhadap sel tumor dibandingkan dengan sel normal.
Kitosan, polisakarida alami, adalah bentuk deasetilasi dari kitin. Polimer alami ini memiliki kelarutan air yang sangat baik, bio-fungsi, kompatibilitas darah, dan karakteristik degradabilitas mikroba, dan dikenal untuk berbagai aplikasi biomedis. Kami mendegradasi kitosan dengan berat molekul tinggi (450 kDa) menggunakan kitosanase dalam kondisi asam untuk mendapatkan oligosakarida kitosan dengan berat molekul rendah (CSO, 18 kDa). CSO dapat menembus membran sel dengan kuat [16] dan asam stearat (SA) dapat memasuki nukleus melalui jalur glikoprotein. CSO dimodifikasi secara hidrofobik dengan SA menggunakan carbodiimide (EDC) sebagai coupling reagen untuk mensintesis amphipathic stearic acid-g-chitosan oligosaccharide (CSO-SA).
Meskipun EMO memiliki aktivitas biologis yang luas, struktur antrakuinonnya kurang larut dalam air. Karena obat terapeutik diangkut melalui aliran darah, kelarutannya mempengaruhi penyerapan dan distribusinya secara langsung. Cangkok CSO-SA dapat dirakit sendiri dalam larutan berair untuk membentuk nanomisel yang bersifat hidrofobik di dalam dan hidrofilik di luar. Kami menyebarkan nanomicelles dari keadaan berkumpul menggunakan probe ultrasound. Karena EMO dan CSO keduanya hidrofobik, EMO dienkapsulasi di tengah misel.
Beberapa obat model diterapkan pada CSO-SA, yang membutuhkan berat molekul, struktur, dan hidrofobisitas obat model. Studi yang ada meliputi curcumin [17], doxorubicin [18], lamivudine stearate [19], dan oxaliplatin [20] yang dapat meningkatkan efek antitumor secara signifikan. Kami mengeksplorasi kondisi pemuatan CSO-SA/EMO yang optimal. CSO-SA/EMO menciptakan bentuk sediaan baru dengan kelarutan dan efisiensi pemanfaatan yang lebih tinggi. CSO-SA/EMO dapat memberikan ide untuk memilih model obat atau pembawa, dan aplikasi klinis misel.
Bahan dan Metode Eksperimental
Materi Eksperimental
BALB/C+/nu tikus telanjang jantan diperoleh dari Pusat Hewan Eksperimental Universitas Zhejiang. Garis sel kanker lambung diferensiasi rendah MGC803 dan BGC823 dibeli dari bank sel ATCC. Media kultur RPMI-1640 dan FBS diperoleh dari Perusahaan Bioteknologi Daun Holly Hangzhou. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, trinitrobenzene sulfonat acid, dan pyrene dipasok oleh Sigma Aldrich. Universitas Zhejiang dilengkapi CSO-SA. Reagen lain yang dibeli adalah kelas AR.
Penentuan CMC dan
1
Spektrum H NMR CSO-SA
Dalam laporan ini, konsentrasi misel kritis (CMC) CSO-SA ditentukan dengan spektrofotometri fluoresensi menggunakan pirena sebagai probe fluoresen. Berbagai konsentrasi larutan CSO-SA ditambahkan ke dalam larutan pirena aseton setelah aseton diuapkan semalaman. Spektrum emisi dan nilai puncak pirena dalam larutan CSO-SA dengan konsentrasi yang berbeda dianalisis dengan spektrofotometri fluoresensi. Puncak pertama (I1 =374 nm) dan puncak ketiga (I3 =385 nm) dari spektrum direkam. Kami memplot konsentrasi logaritmik (Log C) sebagai absis dan I1 /Aku3 sebagai ordinat dan menghitung CMC untuk misel polimer.
CSO dan CSO-SA dibubarkan di D2 O pada konsentrasi 10 mg/ml.
1
Spektrum H NMR direkam, dibandingkan, dan dianalisis untuk karakteristik puncak CSO dan CSO-SA.
Gelar Substitusi Amina Terdeteksi
Derajat substitusi amina (SD%) dideteksi menggunakan metode asam sulfat trinitrobenzena (TNBS).
Konsentrasi berbeda dari larutan CSO dan CSO-SA disiapkan setelah 4% NaHCO3 dan 0,1% TNBS ditambahkan berturut-turut. Setelah inkubasi pada 37 °C selama 2 jam dalam penangas air, ditambahkan 2 mol/L asam klorida. Absorbansi diukur pada 344 nm dengan spektrofotometri ultraviolet-tampak setelah 30 menit ultrasonikasi. Kurva standar digambar dan SD% sampel CSO-SA dihitung.
Ukuran dan Potensi Partikel CSO-SA
Larutan CSO-SA 1,0 mg/ml disiapkan dan misel didispersikan sepenuhnya dengan probe pengganggu sel ultrasonik. Ukuran partikel dan potensi CSO-SA ditentukan dengan ukuran partikel dan penganalisis potensial permukaan.
Serapan Sel dari CSO-SA
Larutan FITC dan CSO-SA dicampur, diaduk semalaman, dan dipindahkan ke kantong dialisis. FITC yang tidak bereaksi dan etanol absolut dihilangkan dengan dialisis dengan air deionisasi selama 24 jam. Akhirnya, diperoleh larutan CSO-SA (FITC-CSO-SA) berlabel FITC dengan konsentrasi 1,0 mg/mL.
Sel MGC803 dan BGC823 digunakan sebagai sel target untuk memeriksa serapan sel CSO-SA. Berdasarkan tingkat proliferasi sel, sel-sel diunggulkan di piring 24-sumur dan dikultur semalaman sampai mereka menjadi benar-benar patuh. Delapan puluh L larutan FITC-CSO-SA kemudian ditambahkan pada titik waktu yang ditentukan. Sel diinkubasi dengan 10 μL Hoechst 33342 (1 mg/mL) selama 15 min untuk menodai inti sel. Serapan CSO-SA oleh FITC-CSO-SA dideteksi dengan laser scanning confocal microscopy.
Distribusi CSO-SA di Vivo
Distribusi CSO-SA in vivo ditentukan dengan pewarnaan pewarna fluoresen DiR. Larutan CSO-SA/DiR disiapkan dengan dialisis.
Tikus telanjang jantan berumur enam minggu digunakan sebagai model percobaan. Tikus telanjang diinokulasi secara subkutan dengan 1 × 10
8
/mL sel MGC803. CSO-SA/DiR diberikan melalui vena ekor pada volume sel tumor sekitar 200 mm
3
. Tikus kemudian dibius pada titik waktu yang ditentukan. Distribusi waktu CSO-SA/DiR in vivo direkam menggunakan pencitraan tubuh hidup hewan kecil (rentang panjang gelombang, 580-700 nm, waktu pemaparan 1000 ms).
Deteksi Konsentrasi EMO oleh HPLC
Konsentrasi EMO ditentukan dengan HPLC. EMO diterapkan ke kolom paket Eclipse XDB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) dengan kolom perlindungan (4,6 × 10 mm, 5 μm). Suhu kolom diatur pada 30 °C, laju alir 1,0 mL/menit, panjang gelombang deteksi 254 nm, dan volume injeksi 20 μL. Fase geraknya adalah metanol/asam fosfat 0,1% (85:15, v/v). Konsentrasi EMO diplot sebagai absis dan area puncak sebagai ordinat. Kurva standar EMO digambar untuk menentukan rentang linier optimal. Semua sampel yang disuntikkan HPLC disaring melalui filter organik 0,45 m untuk melindungi kolom.
Persiapan CSO-SA/EMO
Dalam penelitian ini, EMO dienkapsulasi dengan probe ultrasonik. Rasio formulasi awal 10% (EMO:CSO-SA, b/b) digunakan sebagai titik awal. Larutan EMO secara perlahan ditambahkan dengan cara tetes demi tetes ke dalam larutan misel dalam penangas es. Probe ultrasonik kemudian diterapkan selama 20 siklus (400 W, bekerja 2s, berhenti 3s).
Misel berisi obat dipindahkan ke kantong dialisis (MWCO, 3,5 kDa) dan didialisis terhadap air deionisasi selama 24 jam untuk menghilangkan etanol dari pelarut. CSO-SA/EMO murni diperoleh dengan sentrifugasi dialisat untuk menghilangkan EMO bebas.
Properti CSO-SA/EMO (Potensi Diameter Partikel, TEM, EE%)
Ukuran partikel dan potensial permukaan CSO-SA/EMO diukur dengan ukuran partikel dan potensi permukaan analyzer.
Larutan 0,1 mg/ml CSO-SA/EMO ditambahkan tetes demi tetes pada kawat tembaga yang dilapisi film karbon, diwarnai dengan asam fosfotungstat 2% dan dikeringkan. Morfologi dan ukuran partikel CSO-SA/EMO diamati dengan mikroskop elektron transmisi.
Efisiensi jebakan (EE%) dan pemuatan obat (DL%) dari CSO-SA/EMO dideteksi dengan ekstraksi pelarut organik dan HPLC. Untuk sampel 200 μL larutan misel CSO-SA/EMO, 1,8 mL metanol ditambahkan untuk membubarkan misel dan mengekstrak obat. Konsentrasi EMO diukur sebagai CEMO . 400 μL larutan misel CSO-SA/EMO lainnya ditempatkan dalam tabung sentrifus ultrafiltrasi dan disentrifugasi (12.000 rpm, 5 min) untuk mendapatkan supernatan. EE% dan DL% dihitung menurut rumus berikut:
dimana CEMO adalah konsentrasi EMO dalam misel, C adalah konsentrasi EMO dari misel berisi obat setelah sentrifugasi ultrafiltrasi, V adalah volume misel berisi obat yang menjalani dialisis, MEMO adalah jumlah EMO yang diberikan selama pemuatan obat, MCSO-SA adalah massa CSO-SA.
Evaluasi Pelepasan Obat In Vitro
Pelepasan obat dari CSO-SA/EMO diselidiki menggunakan PBS (pH 7.2) sebagai media pelepasan. Satu mililiter larutan misel berisi obat ditempatkan dalam tas dialisis 3,5 kDa yang disegel di kedua ujungnya kemudian ditempatkan dalam media pelepasan yang sesuai yang berisi tabung. Kantong dialisis ditempatkan dalam pengocok termostat horizontal 37 °C. Sampel diambil pada titik waktu yang ditentukan dan diganti dengan volume yang sama dari media rilis baru. Kandungan EMO dalam sampel ditentukan oleh HPLC dan jumlah kumulatif EMO yang dilepaskan dihitung.
Sitotoksisitas CSO-SA/EMO
Tingkat kelangsungan hidup sel kanker lambung yang diobati dengan CSO-SA/EMO, CSO-SA, dan EMO dideteksi dengan uji MTT. Sel diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan konsentrasi sekitar 10
5
/ml. CSO-SA/EMO, CSO-SA, dan EMO ditambahkan pada konsentrasi yang berbeda. Setelah inkubasi untuk periode waktu yang berbeda, 20 μL larutan kerja MTT ditambahkan. Setelah 4 jam inkubasi, 200 μL DMSO ditambahkan dan densitas optik (OD) larutan pada 570 nm diukur dengan pembaca lempeng mikro.
Pengaruh CSO-SA/EMO pada Siklus Sel
Sel-sel dari dua garis sel diunggulkan dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan 10
5
/mL. Setelah 12 jam kultur, CSO-SA, CSO-SA/EMO, dan EMO ditambahkan dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel tersebut kemudian dicerna, dikumpulkan, dan dicuci. 500 μL larutan pewarnaan PI kemudian ditambahkan ke setiap sampel sel, pelet sel disuspensikan kembali secara perlahan, dan sel diinkubasi dalam gelap pada suhu 37 °C selama 30 menit. Fluoresensi merah dideteksi oleh flow cytometer pada panjang gelombang eksitasi 488 nm. Konten DNA dianalisis oleh perangkat lunak FlowJo.
Efek Antitumor CSO-SA/EMO Dievaluasi oleh In Vivo dan Analisis Histologis
Eksperimen hewan dilakukan sesuai dengan Pedoman untuk Perawatan dan Komite Penggunaan Hewan, Universitas Zhejiang. Sel MGC803 (1 × 10
6
) disuntikkan secara subkutan ke sisi anterior kanan mencit telanjang jantan pada usia 5 sampai 6 minggu. Tumor dibiarkan tumbuh dengan diameter sekitar 5 mm. Pada saat itu, tikus secara acak dibagi menjadi kelompok kontrol, kelompok injeksi EMO dan kelompok injeksi CSO-SA/EMO, dengan 3 hewan di setiap kelompok. Semua tikus disuntik secara intravena dengan reagen yang relevan melalui vena ekor sekali sehari selama 2 minggu. Jangka sorong elektronik digunakan untuk mengukur panjang (a) dan pendek (b) diameter tumor (b). Volume tumor dihitung menurut rumus V =a × b
2
/2. Berat badan masing-masing tikus dicatat setelah tumor dikumpulkan untuk analisis histologis. Tingkat penghambatan tumor ditentukan dalam jaringan tumor setelah pewarnaan hematoxylin dan eosin (HE). Terminal deoxynucleotide transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) dilakukan untuk mendeteksi apoptosis seluler di jaringan ileum terminal menggunakan kit deteksi kematian sel in situ sesuai dengan instruksi pabrik.
Hasil dan Diskusi
CMC dan
1
Spektrum H NMR CSO-SA
Polimer amfifilik dirakit sendiri menjadi misel dalam media hidrofilik. CMC yang lebih rendah menghasilkan pembentukan misel yang lebih besar. Ini bermanfaat untuk pemeliharaan struktur misel setelah pemberian intravena. Ketika CSO-SA membentuk misel, probe fluoresen pirena dapat dengan mudah memasuki inti hidrofobik misel, meningkatkan intensitas fluoresensi dari pirena bermuatan yang meningkatkan intensitas spektrum emisi. Pada titik ini, Aku3 meningkat secara signifikan lebih cepat dari I1 , dengan demikian, saya1 /Aku3 rasio intensitas fluoresensi menurun tiba-tiba. Sebuah breakpoint yang signifikan dapat diamati di I1 /Aku3 plot dan nilai Log C (Gbr. 1). Perhitungan titik belok menunjukkan bahwa CMC adalah 179,02 μg/mL. Semakin kecil CMC, semakin kuat kemampuan untuk membentuk misel dan semakin kuat ketahanan terhadap pengenceran yang meningkatkan perlindungan struktur misel setelah pemberian intravena.
EDC digunakan sebagai zat penghubung ikatan silang untuk bereaksi dengan gugus karboksil SA dan membentuk intermediet aktif -OO-asil isourea turunan. Ini dapat bereaksi dengan gugus amina primer CSO untuk membentuk ikatan amida. Struktur CSO-SA ditentukan dan dikonfirmasi berdasarkan spektrum proton resonansi magnetik nuklir.
1
H NMR (400 MHz, D2 O) 1,06 (m, CH2), 1,02 (m, CH3) masing-masing sesuai dengan metilen proton, dan metil proton SA.
Derajat Pengganti dari Grup Amino
SD% CSO-SA adalah persentase gugus amino tersubstitusi asam stearat pada kitosan. TNBS bereaksi dengan gugus amino bebas pada kitosan dan membentuk turunan trinitrobenzena dengan serapan UV pada 344 nm. Kurva standar turunan trinitrobenzena kitosan ditentukan dengan absorbsi UV pada 344 nm. SD% CSO-SA dihitung menjadi 9,3 ± 8%. Ini menegaskan bahwa CSO dan SA telah berhasil dihubungkan berdasarkan rasio cangkok mereka.
CSO-SA, CSO-SA/EMO Ukuran dan Potensi Partikel
Tabel 1 menunjukkan bahwa Z-rata-rata CSO-SA adalah 139,3 ± 2,2 nm. PDI adalah 0,179 ± 0,03 menunjukkan dispersi yang relatif seragam. Dibandingkan dengan CSO-SA, Z-average dan PDI CSO-SA/EMO meningkat. Setelah memuat EMO, muatan positif permukaan CSO-SA/EMO lebih tinggi daripada CSO-SA.
Serapan Sel
FITC tidak mempengaruhi sifat fisikokimia CSO-SA. Kami memperoleh FITC-CSO-SA dengan mencangkok FITC fluorescein ke CSO-SA. Setelah sel diwarnai dengan Hoechst 33342, pengambilan sel FITC-CSO-SA diamati menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal. Kami menemukan bahwa penyerapan MGC803 secara bertahap meningkat seiring dengan bertambahnya waktu dan fluoresensi FITC secara bertahap meningkat. Penyerapan misel BGC823 mirip dengan MGC803 dengan cara yang bergantung pada waktu. FITC-CSO-SA memiliki kemampuan penetrasi sel yang baik dan terdistribusi merata di sitoplasma sel kanker lambung (Gbr. 2).
Penyerapan misel CSO-SA tergantung waktu seluler in vitro di MGC803 (a ) dan BGC823 (b ) sel untuk 1, 4, 8, 12 h, masing-masing (biru, Hoechst 33342; hijau, FITC; bilah skala =50 μm)
Distribusi CSO-SA Di Vivo
Teknologi pencitraan inframerah-dekat (NIR) menguntungkan untuk menembus biomaterial dan jaringan. Setelah CSO-SA/DiR disuntikkan ke dalam vena ekor mencit telanjang, distribusi CSO-SA/DiR diamati dan direkam pada waktu yang berbeda menggunakan pencitra tubuh hewan kecil yang hidup. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, distribusi CSO-SA/DiR mirip dengan misel lain pada 4 jam setelah injeksi vena ekor dan terutama didistribusikan di hati, limpa, dan jaringan tumor. Distribusi nanomisel dalam tumor meningkat secara bertahap dalam intensitas dengan bertambahnya waktu. Graft CSO-SA yang ditunjukkan ini memiliki kemampuan penargetan pasif yang baik terutama karena efek EPR dari nanomisel (Gbr. 3).
Citra seluruh tubuh CSO-SA/DiR pada waktu yang berbeda setelah i.v. injeksi
Persiapan CSO-SA/EMO
Pengaruh Lingkungan pH yang Berbeda terhadap Pemuatan Obat
Kami menyiapkan larutan CSO-SA dan menyesuaikan pH CSO-SA untuk menyelidiki pengaruh pH pada pemuatan obat. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, CSO-SA memiliki kapasitas pemuatan obat yang baik dan menunjukkan tren parabola dalam kisaran pH 6.4-6,8. Tingkat pemuatan obat tertinggi terlihat pada pH 6.6 menjadikan nilai ini sebagai pH optimal untuk pemuatan obat (Gbr. 4).
Pengaruh nilai pH yang berbeda dari cangkok CSO-SA pada pemuatan obat. Data disajikan sebagai sarana ± SD (n =3)
Efisiensi Enkapsulasi, TEM, dan Pemuatan Obat
CSO-SA merakit sendiri menjadi misel nanokomposit inti cangkang. Bagian hidrofobik secara spontan membentuk struktur inti hidrofobik untuk menolak media hidrofilik. Struktur ini menyediakan kendaraan kunci untuk pemuatan obat karena EMO dapat dengan mudah dienkapsulasi dalam inti hidrofobik karena struktur hidrofobiknya. Kami menyelidiki pengaruh CSO-SA pada kapasitas pemuatan EMO dengan memvariasikan dosis EMO. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, dengan meningkatnya dosis EMO, jumlah pemuatan obat meningkat. Laju pemuatan CSO-SA mencapai 21,16% saat rasionya 30% (Gbr. 5).
Pengaruh rasio yang berbeda dari EMO dan CSO-SA (5-30%) pada pemuatan obat. Data disajikan sebagai sarana ± SD (n =3)
CSO-SA/EMO diperbesar 30.000 kali dengan mikroskop elektron transmisi. Bentuk dan ukuran nanocell diamati dan dicatat.
Rilis EMO dari CSO-SA/EMO
Solusi misel berisi obat ditambahkan ke tas dialisis 3,5 kDa dengan PBS (pH 7.2) digunakan sebagai media pelepasan. Setiap kali sampel dikeluarkan, sampel tersebut diganti dengan volume medium rilis baru yang sama.
Konsentrasi EMO pada titik waktu yang berbeda ditentukan dengan HPLC, setelah itu persentase pelepasan kumulatif dihitung. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, CSO-SA/EMO menunjukkan efek pelepasan berkelanjutan yang signifikan dibandingkan dengan EMO bebas. Hasil ini menunjukkan bahwa persentase pelepasan EMO gratis adalah 38,4% pada 0,5 h sedangkan persentase pelepasan EMO dari CSO-SA/EMO sekitar 6,6%. Pada 4 h, persentase pelepasan EMO gratis adalah 83,7% dan persentase pelepasan CSO-SA/EMO sekitar 32,5%. Dalam 72 h, rilis EMO gratis mencapai 97,2% sedangkan rilis EMO dari CSO-SA/EMO adalah 78,4%. EMO dilepaskan dari misel berisi obat CSO-SA/EMO melalui dua cara utama:melalui disosiasi EMO dari inti misel dan dengan penetrasi dari inti misel ke dalam media pelepasan.
Profil rilis EMO dari CSO-SA/EMO lebih dari 72 h. Bilah kesalahan dalam grafik mewakili deviasi standar (n =3)
Toksisitas CSO-SA/EMO terhadap Sel Kanker Lambung
Uji MTT adalah metode standar untuk mendeteksi viabilitas sel. Sitotoksisitas EMO bebas, CSO-SA, dan CSO-SA/EMO terhadap sel kanker lambung MGC803 dan BGC823 diukur menggunakan uji MTT. Ini menunjukkan bahwa EMO dan CSO-SA/EMO dapat menghambat sel MGC803 dan BGC823 dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu. Namun, pada konsentrasi yang sama, CSO-SA/EMO memiliki efek penghambatan yang lebih tinggi pada sel MGC803 dan BGC823 dibandingkan dengan larutan EMO gratis. IC50 nilai (Tabel 2) EMO dan CSO-SA/EMO untuk sel kanker lambung dihitung. IC50 CSO-SA/EMO secara signifikan lebih rendah daripada EMO pada setiap titik waktu (24 h, 48 h, 72h). IC50 nilai CSO-SA menunjukkan bahwa CSO-SA adalah pembawa biologis yang aman dengan sedikit toksisitas biologis yang menegaskan bahwa sitotoksisitas CSO-SA/EMO disebabkan oleh EMO (Gbr. 7).
Viabilitas sel sel kanker lambung MGC803 dan BGC823 yang diobati dengan CSO-SA, EMO, dan CSO-SA/EMO selama 24 h, 48h, dan 72h. Data disajikan sebagai sarana ± SD (n =3)
Tabel 2 dan Gambar 7 menunjukkan sitotoksisitas sistem penghantaran obat CSO-SA/EMO secara signifikan lebih tinggi daripada EMO bebas. Namun ketika disimulasikan pelepasan CSO-SA/EMO dan EMO bebas dalam lingkungan in vivo, pelepasan EMO bebas mencapai 38,4% pada 0,5 h sedangkan pelepasan CSO-SA/EMO hanya 6,6%. Secara keseluruhan, konsentrasi EMO gratis lebih tinggi daripada konsentrasi CSO-SA/EMO di setiap titik waktu.
Fenomena ini mudah dijelaskan. Meskipun CSO-SA/EMO melepaskan EMO relatif lambat, efek antitumor CSO-SA/EMO tidak melambat atau menurun. Banyak penelitian telah menunjukkan sistem pengiriman nanodrug dapat meningkatkan aktivitas antitumor obat kemoterapi [21].
Pertama, meskipun EMO bebas menunjukkan ledakan aktivitas awal, EMO tidak dapat diserap secara efisien oleh sel sedangkan CSO-SA sangat mempercepat penyerapan sel melalui endositosis atau fagositosis.
Kedua, ketika CSO-SA/EMO mendekati membran sel, interaksi antara nanopartikel dan membran sel dapat mempengaruhi struktur dan sifat nanomisel serta fungsi makromolekul biologis seperti saluran ion. Oleh karena itu, perlekatan CSO-SA/EMO ke membran sel tidak menghasilkan adsorpsi fisik yang sederhana tetapi dapat mengubah keseimbangan dinamis sel dan dengan demikian lebih meningkatkan sitotoksisitas CSO-SA/EMO.
Akhirnya, EMO bebas memiliki struktur antrakuinon hidrofobik yang mengakibatkan distribusi yang buruk dalam darah. Sistem penghantaran obat CSO-SA/EMO meningkatkan kelarutan EMO dan meningkatkan disolusi yang mengarah ke konsentrasi molekul yang lebih tinggi di sel sekitarnya.
Deteksi Penangkapan Siklus Sel oleh FCM
Analisis siklus sel merupakan aspek penting dari pengobatan klinis tumor ganas. Penerapan obat siklus-spesifik untuk sel tumor selama periode obat-sensitif telah terbukti memiliki kemanjuran yang besar. Meskipun analog etidium bromida tidak dapat menembus sel normal, mereka dapat menodai inti sel dengan menembus membran sel yang rusak. DNA untai ganda tertanam PI menghasilkan fluoresensi merah dan intensitas fluoresensi sebanding dengan tingkat DNA untai ganda. Kandungan DNA ditentukan dengan flow cytometry (FCM) setelah pewarnaan DNA dengan PI. Distribusi siklus sel dan apoptosis dianalisis berdasarkan distribusi konten DNA.
Penelitian telah menunjukkan bahwa EMO mempengaruhi distribusi siklus sel [11, 22]. Analisis FCM menunjukkan bahwa CSO-SA/EMO dan EMO dapat memblokir sel MGC803 dan BGC823 dalam fase G2/M dari siklus sel.
Sel MGC803 terkena konsentrasi yang sama (20 μM) dari CSO-SA, EMO bebas dan larutan CSO-SA/EMO selama 24 h. Persentase sel MGC803 pada fase G2/M ditemukan masing-masing sebesar 8,95%, 15,29%, dan 23,12%. Persentase kelompok kontrol adalah 6,47%. Persentase sel BGC823 di G2/M yang diobati dengan 20 μM CSO-SA, free EMO, atau CSO-SA/EMO dalam kondisi yang sama masing-masing adalah 14,25%, 16,79%, dan 35,71% yang merupakan nilai yang lebih tinggi daripada kelompok kontrol. (13,66%). Data ini menunjukkan bahwa CSO-SA/EMO memblokir fase G2/M sel MGC803 dan BGC823 lebih efisien dan signifikan daripada EMO bebas pada konsentrasi yang sama. CSO-SA tidak menunjukkan perbedaan dari kontrol (Gbr. 8).
Distribusi siklus sel sel MGC803 dan BGC823 diperlakukan dengan EMO dan CSO-SA/EMO selama 24 jam. t Student siswa tes dihitung dan data disajikan sebagai rata-rata ± SD (n =3), (*p <0,05,
**p <0,005,
***p <0,001)
Efek Antitumor CSO-SA/EMO Di Vivo
Untuk mempelajari lebih lanjut efek antitumor dari CSO-SA/EMO, tingkat penghambatan tumor dan tingkat apoptosis seluler dievaluasi secara in vivo. Hasil menunjukkan bahwa baik CSO-SA/EMO dan EMO memiliki efek penghambatan penting pada pertumbuhan tumor (Gbr. 9a). Tingkat penghambatan tumor kelompok CSO-SA/EMO adalah tiga kali lipat dari kelompok EMO (Gbr. 9d). Berat mencit pada masing-masing kelompok tidak berubah secara signifikan (Gbr. 9b). Hal ini menunjukkan bahwa baik CSO-SA/EMO maupun EMO relatif aman. Perubahan morfologi dan apoptosis pada jaringan tumor masing-masing kelompok menunjukkan bahwa CSO-SA/EMO memiliki efek antitumor yang signifikan (Gbr. 9e, f).
Efek antitumor CSO-SA/EMO in vivo. a Bentuk tumor pada masing-masing kelompok. b Berat badan tikus pada masing-masing kelompok. c Volume tumor di setiap kelompok. d Tingkat penghambatan tumor. e Gambar representatif dari jaringan tumor yang diwarnai TUNEL dari masing-masing kelompok (bilah skala =200 μm). f Gambar representatif dari jaringan tumor yang diwarnai HE dari setiap kelompok (bilah skala =200 μm)
Kesimpulan
Dalam penelitian ini, kami mendeteksi struktur, CMC, SD%, ukuran partikel, dan potensi CSO-SA dengan metode yang berbeda. Results prove amphiphilic CSO-SA performed well as a carrier. Fluorescence intensity of gastric cancer cells showed CSO-SA had been taken up rapidly within 12 h. Nude mice were used as a model to study the distribution of CSO-SA within 72 h. Over time, CSO-SA distribution in lesion became more concentrated exhibiting a good passive targeting effect.
CSO-SA/EMO was prepared with ultrasound-dialysis method. CSO-SA had strong drug-loading capacity. When environment pH was set at 6.6, the level of drug loading reached 21.6% at a 30% formulation ratio. Compared with CSO-SA, CSO-SA/EMO had bigger particle size and zeta potential. The shape of CSO-SA/EMO could be recorded directly using TEM. The release of EMO from CSO-SA/EMO was 78.4% within 72 h, it indicated a smooth and continuous process in body. Considering the antitumor effect of CSO-SA/EMO compared with free EMO, we confirmed it with various experiments.
CSO-SA toxicity to gastric cancer cells was detected by MTT assay. The results showed that CSO-SA was a safe biological carrier. Compared with that of free EMO, CSO-SA/EMO significantly enhanced the antitumor activity against gastric cancer cells. MGC803 and BGC823 cell cycle could be arrested in the G2/M phase more effectively by CSO-SA/EMO. Tumor volume, HE staining, and TUNEL assay proved more significant antitumor effect of CSO-SA/EMO than free EMO.
Based on above results, CSO-SA is both biocompatible and safe carrier. CSO-SA/EMO in this study utilizes a new and effective dosage formulation for the treatment of cancer and exhibits good passive targeting effect in vivo.
Ketersediaan Data dan Materi
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel yang dipublikasikan ini.
