Desain Aptamer-Gold Nanoparticle-Loaded pH-Sensitive Liposomes Encapsulate Morin untuk Mengobati Kanker
Abstrak
Studi ini mengusulkan sintesis jenis nanopartikel antikanker, aptamers, dan liposom sensitif pH Morin (MSL) yang dimodifikasi nanopartikel Au (Apt-Au), yang menunjukkan sifat penargetan. Tumor sulit disembuhkan karena lingkungan mikronya berbeda dari jaringan normal; pHnya lebih rendah dari jaringan normal, yang umumnya menghambat efektivitas obat. Dengan demikian, obat yang responsif terhadap pH telah menarik perhatian yang luas. Nanopartikel emas (AuNPs) menunjukkan potensi sebagai pembawa obat karena ukurannya yang kecil, biokompatibilitas yang baik, modifikasi permukaan yang mudah, dan penetrasi sel yang kuat. Apt-Au@MSL menunjukkan sifat monodispersitas dan penargetan tumor yang sangat baik dan dapat dilepaskan dalam lingkungan sebagian asam melalui dialisis. Kami menyaring sel kanker model kami dengan uji MTT dan menemukan bahwa sel SGC-7901 dapat secara efektif menekan proliferasi. Hasil in vivo menunjukkan bahwa pemberian Apt-Au@MSL dapat menghambat pertumbuhan tumor pada model tikus xenograft. Pewarnaan H&E dan uji TUNEL lebih lanjut menegaskan bahwa Apt-Au@MSL dapat mempromosikan apoptosis tumor. Apt-Au@MSL dapat menginduksi apoptosis dengan memicu kelebihan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) dan mengatur beberapa sinyal crosstalk. Baik tes biokimia darah dan pewarnaan H&E menunjukkan bahwa bahan-bahan ini menunjukkan toksisitas akut yang dapat diabaikan dan biokompatibilitas yang baik secara in vivo. Dengan fungsinya yang kuat, Apt-Au@MSL dapat digunakan sebagai bahan antikanker berbasis target untuk pengobatan kanker klinis di masa depan.
Pengantar
Salah satu penyebab kematian yang paling umum [1], kanker, dapat menyebabkan kerugian ekonomi yang besar dan membahayakan manusia. Upaya yang cukup besar telah diarahkan pada pengembangan obat pintar untuk pengobatan kanker [2]. Karena kemampuannya untuk melindungi obat sampai mereka mencapai situs target, nanopartikel polimer berpotensi meningkatkan pengiriman obat terapeutik [3]. Untuk memastikan bahwa agen terapeutik dikirim ke situs aktif, nanopartikel yang sangat reaktif digunakan. Nanopartikel tersebut dapat dirancang untuk bervariasi dalam sifat material di bawah rangsangan biologis yang berbeda. Nanopartikel reaktif dirancang menggunakan rangsangan yang berbeda, termasuk rangsangan eksternal (misalnya, suhu dan cahaya) dan rangsangan biologis (misalnya, pH atau kondisi redoks). NP responsif terhadap pH telah menarik minat penelitian karena perubahan pH setelah endositosis nanopartikel. Bahan yang merespons pH juga menarik perhatian karena fungsi responsif terhadap pH dapat dengan mudah diintegrasikan ke dalam berbagai struktur polimer untuk merancang kumpulan nanopartikel yang merespons pH. Nanopartikel dapat merespon pH dengan perubahan kimia permukaan, perubahan ukuran atau bentuk partikel, dan pemecahan atau pelepasan zat. Perubahan sifat partikel nano ini dapat digunakan untuk mengatur serapan seluler dan pelepasan terkontrol. Oleh karena itu, nanopartikel yang responsif terhadap pH memberikan strategi yang kuat untuk desain sistem pengiriman terapeutik.
Morin hidrat (3,5,7,2′,4′-pentahydroxyflavone) (Gbr. 1) adalah zat aktif alami yang diisolasi dari obat atau tanaman herbal Cina [4]. Ini adalah senyawa progesteron dan metabolit sekunder fenol pada tanaman. Morin didistribusikan secara luas di alam dan memberikan antioksidan yang baik, antikanker [5], dan efek anti-inflamasi yang signifikan. Potensi Morin untuk berbagai aplikasi telah menarik minat yang cukup besar [6], tetapi potensi tersebut secara signifikan dibatasi oleh kelarutan air yang rendah dan bioavailabilitas zat [7].
Struktur kimia Morin hidrat
Liposom (berongga) terdiri dari lesitin dan ceramide antara lain memiliki struktur bilayer yang terdiri dari molekul lipid amfifilik [8]. Liposom memberikan fitur yang diinginkan, seperti biokompatibilitas, fungsionalitas, pengurangan efek samping, dan kemampuan untuk merangkum sejumlah besar obat [9, 10]. Mereka dapat secara efisien membawa agen hidrofilik dan hidrofobik dan melindungi mereka dari kondisi eksternal, berhasil mengangkutnya ke daerah jaringan yang ditargetkan [11]. Peningkatan kemanjuran dimasukkan dalam desain untuk memfasilitasi pelepasan bahan antikanker yang dipicu oleh pH di dalam interstitium tumor melalui liposom yang peka terhadap pH [12,13,14,15]. Liposom yang peka terhadap pH ini adalah liposom khusus yang melepaskan obat di lingkungan jaringan dan dengan cepat menjadi tidak stabil di lingkungan asam, seperti endosom jaringan kanker [16,17,18].
Untuk meningkatkan selektivitas dan kemanjuran pengobatan tumor, liposom yang sensitif terhadap pH harus dimodifikasi untuk membentuk nanopartikel yang menargetkan tumor [19]. Aptamers DNA baru-baru ini dikembangkan sebagai sensor pencitraan dan biosensing yang sangat selektif dan sensitif, serta agen potensial untuk terapi bertarget kanker [20]. Aptamer DNA untai tunggal AS1411 telah terbukti berfungsi sebagai agen kemoterapi karena afinitas pengikatannya yang tinggi untuk inti sel kanker [21]. Aptamer (Apt) ini digabungkan dengan Au NPs untuk membuat konstruksi nano dua komponen dari Au NPs yang dimuat Apt yang dapat berinteraksi dengan inti sel kanker. Beberapa penelitian juga telah menunjukkan bahwa desain hibrida liposom-nanopartikel dapat menyediakan toolbox yang kaya untuk fabrikasi modalitas multifungsi tersebut [22]. Sistem vesikular liposom-Au NP hibrid yang terdiri dari liposom kationik dan Au NP telah dirancang untuk meningkatkan penetrasi obat dalam interstitium tumor dan meningkatkan aktivitas antikanker [23, 24].
Nanopartikel emas (Au NPs) telah dianggap sebagai pembawa obat yang baik dan dapat dimodifikasi dengan molekul terkait bio untuk meningkatkan spesifisitas target kanker [25]. Dengan modifikasi permukaan Au NP, aptamer dari gugus sulfhidril dapat digunakan untuk memodifikasi permukaan Au NP, yang dapat ditargetkan oleh ikatan kovalen Au-S, dan gugus sulfhidril yang sesuai pada permukaan nanogold dapat dilekatkan pada permukaan nanogold [26]. Dari perspektif teknik dan aplikasi, nanomaterial emas terikat ligan menyediakan platform yang kuat untuk memfasilitasi identifikasi, deteksi, dan perawatan yang ditargetkan.
Dalam penelitian ini, kami menggunakan liposom sensitif-pH yang mengenkapsulasi Morin dan merakit Au-Apt yang dimodifikasi pada permukaan liposom (Apt-Au@MSL, Gbr. 3a). Morin, yang dicirikan oleh kelarutan air dan bioavailabilitas yang rendah, diubah. Morfologi, ukuran, dan sifat lain dari Apt-Au@MSL yang disiapkan dikarakterisasi. Nanopartikel baru menunjukkan sifat target tumor dan aktivitas antikanker yang tinggi. Aktivitas antikanker Apt-Au@MSL dieksplorasi secara in vitro dan in vivo (Gbr. 2).
Diagram skematik yang diusulkan dari Apt-Au@MSL yang dirancang kami yang mengandung Morin untuk pengiriman obat ke sel kanker dengan properti bertarget tumor.
Bahan dan Metode
Materi
L-α-Phosphatidylcholine (PC), kolesterol (Chol), cholesteryl hemisuccinate (CHEMS), Morin (≥ 99,99%), natrium sitrat (99,9%), HAuCl4 ·3H2 O (≥ 99,9%), polivinilpirolidon (PVP, berat 40.000), NaOH (98,0%), dan HCl (37%) dibeli dari Sigma-Aldrich Chemical Co. (AS). Aptamer AS1411 dengan modifikasi disulfida disintesis oleh TaKaRa (Dalian, China) dengan urutan sebagai berikut:5′-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3′. Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), propidium iodide (PI), calcein, dan Alexa Fluor 488 Annexin V dibeli dari Sigma-Aldrich Chemical. Semua larutan berair disiapkan dalam air suling ganda. Semua reagen lainnya adalah yang terbaik yang tersedia secara komersial.
Sintesis Au NP
Hingga 1 mL HAuCl4 ·4H2 O (1%) dilarutkan dalam 25 mL air Milli-Q (pH = 5,5), dan 50 mg PVP ditambahkan ke dalam larutan. Solusi yang diperoleh dituangkan ke dalam labu leher tiga (150 mL) dan diperlakukan dengan iradiasi gelombang mikro (MW) selama 5 menit dengan pengadukan mekanis. Selanjutnya, 1,5 mL larutan natrium sitrat (1%) dengan cepat ditambahkan ke dalam larutan dan diiradiasi MW selama 3 min. Solusinya dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 5 menit.
Sintesis NP Apt-Au
Ikatan disulfida aptamers diputus menggunakan tris(2-karboksyetil)fosfin. Setelah 30 min, larutan aptamer (100 μL, 100 μM) ditambahkan ke 10 mL 5 nM larutan Au NPs dan kemudian diinkubasi selama 24 h untuk membentuk Au-Apt NPs. Setelah 1 hari, kami mengasinkan larutan campuran dengan 2,5 mL larutan 500 mM NaCl dua kali, dipisahkan dengan 4 h [27].
Persiapan Liposom yang Sensitif terhadap pH
Liposom terdiri dari PC telur ke CHEMS ke Chol pada rasio molar 33:13:5 dan Morin 5% disiapkan dengan hidrasi film. Telur PC, CHEMS, Chol, dan 2 mg Morin dilarutkan dalam 8 mL CHCl3 , dan pelarut organik dihilangkan pada suhu 40 °C dengan rotavapor. Untuk Morin-liposom, film lipid tipis yang dihasilkan dihidrasi menggunakan 2% (b/v) PBS dan kemudian disonikasi menggunakan probe penangas es selama 15 menit. Liposom akhir disintesis dan distabilkan dalam sistem koloid. Untuk liposom sensitif pH Apt-Au@Morin (Apt-Au@MSL), lapisan lipid dihidrasi dengan 475 μg/mL Au-Apt NP dalam dekstrosa 5% diikuti dengan sonikasi [23].
Karakterisasi
Spektroskopi ultraviolet–tampak (UV–Vis, S-3100 Photodiode Array, Scinco Co., Ltd., Korea) dan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT–IR) dilakukan (Nicolet iS50, USA, Thermo Fisher Scientific). Morfologi Apt-Au@MSL diperiksa dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, HT7700, Tokyo Jepang, Hitachi). Persentase pelepasan Morin dideteksi dengan spektroskopi UV-vis. Morfologi Morin-liposom dan Apt-Au@MSL juga diamati dengan memindai mikroskop elektron (SEM, S-4800, Hitachi, Jepang). Pengukuran hamburan cahaya dinamis (DLS) dan potensi zeta digunakan untuk mengkarakterisasi sifat optik dan ukuran Morin–liposom dan Apt-Au@MSL pada penganalisis potensial Brookhaven ZetaPALS.
Budaya Sel
Garis sel kanker manusia, SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7, dan Hs68, dibeli dari American Type Culture Collection (ATCC) dan dipelihara di RPMI dengan 10% serum janin sapi pada 37 °C dan 5% CO2 .
Studi Aktivitas Antikanker In Vitro
SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7, dan Hs68 diunggulkan pada pelat 96-sumur (2.0 × 10
3
sel/sumur) kemudian dikultur dengan Apt-Au@MSL pada berbagai konsentrasi (0, 5, 10, 15, 20, dan 30 μg/mL). Au NP dan Morin ditetapkan sebagai kelompok kontrol. Kelompok kosong terdiri dari sel-sel yang tidak diobati. Pelat 96-sumur diinkubasi dalam inkubator yang dilembabkan. Setelah inkubasi, 9,6 mL larutan MTT (5 mg/mL) ditambahkan ke setiap sumur dan selanjutnya diinkubasi selama 2 h. Setiap kelompok diuji dalam rangkap tiga, dan IC50 nilai diturunkan dari nilai OD rata-rata dari tes rangkap tiga versus kurva konsentrasi obat. Kecerahan masing-masing kelompok diperoleh dengan mikroskop fluoresensi confocal [28].
Adhesi sel dipantau menggunakan sistem penginderaan elektronik sel waktu-nyata (RT-CES; ACEA Biosciences, Inc.) setiap 10 menit selama 75 jam. Untuk menentukan adhesi sel, masing-masing sumur di piring diunggulkan dengan sel (1.0 × 10
4
sel/sumur) dengan media segar hingga volume akhir 200 μL dan kemudian diinkubasi dalam larutan Apt-Au@MSL pada berbagai konsentrasi (10, 20, dan 30 μg/mL) pada 10 h diinkubasi selama 12 h [29] . Kelompok kosong terdiri dari sel yang tidak diberi perlakuan, dan kelompok kontrol terdiri dari kelompok Morin dan Morin-liposom.
Mikroskopi Fluoresensi
Sel SGC-7901 ditumbuhkan di pelat 48-sumur semalaman pada suhu 37 °C, 5% CO2 . Sel-sel tersebut kemudian diperlakukan dengan larutan Apt-Au@MSL (10 dan 30 μg/mL) pada konsentrasi yang berbeda selama 12 h. Kelompok kontrol terdiri dari kelompok Morin dan Morin-liposom. Selanjutnya media tersebut dibuang. Kelompok kosong terdiri dari sel-sel yang tidak diobati. Sel dicuci dengan PBS tiga kali. Sel-sel diwarnai dan kemudian diukur dengan pewarnaan sel hidup dan sel mati (uji LIVE/DEAD). Setelah pewarnaan bersama dengan Calcein–AM/PI selama 30 menit, sel dicuci dengan PBS dua kali untuk menghilangkan pewarna berlebih, dan gambar fluoresensi diperoleh dengan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) (untuk calcein–AM, Ex = 488 nm dan Em = 515 nm; PI Ex = 535 nm dan Em = 615 nm [30]).
Analisis Kematian Sel Apoptosis
Untuk mengukur efek antikanker dari Apt-Au@MSL, masing-masing sumur di piring enam sumur diunggulkan dengan sel SGC-7901 (1.0 × 10
5
sel/sumur) dan kemudian diinkubasi dalam larutan Apt-Au@MSL pada berbagai konsentrasi (5, 10, 20, dan 30 μg/mL) selama 12 h. Kelompok kosong terdiri dari sel yang tidak diberi perlakuan, dan kelompok kontrol terdiri dari kelompok Morin dan Morin-liposom. Setelah perawatan, sel-sel dikumpulkan dan dicuci dengan PBS dua kali. Sel diwarnai dengan PI dan Annexin V–FITC dan kemudian dianalisis menggunakan penganalisis CytoFLEX (Beckman Coulter) (untuk PI, Ex = 535 nm dan Em = 615 nm; Annexin V–FITC, Ex = 488 nm dan Em = 525 nm ) [31].
Studi tentang Penghancuran Dinding
Untuk mempelajari penghancuran dinding sel dalam uji antikanker, sel SGC-7901 ditumbuhkan dalam pelat enam lubang pada 37 °C dan 5% CO2 . Sel-sel yang dikultur tanpa bahan digunakan sebagai kelompok kosong. Setelah sel dikultur dengan Apt-Au@MSL pada konsentrasi yang bervariasi (5, 10, 20, dan 30 μg/mL) selama 12 h, mereka diperlakukan dengan larutan Trypsin-EDTA 0,25%. Semua sel (termasuk sel terapung dalam medium) dikumpulkan dengan 2000 r/min selama 5 min. Sel-sel yang dikumpulkan kemudian difiksasi dalam larutan dialdehida glutarik 2,5% selama 4 jam [32]. Sel-sel tetap didehidrasi dalam seri gradien aseton selama 20 menit. Sel-sel tersebut akhirnya menjalani serangkaian prosedur, dipasang pada jaringan tembaga, dan diamati oleh TEM (HT-7700, Hitachi, Jepang).
Pengujian Western Blot
Ekspresi protein sel SGC-7901 dideteksi dengan analisis Western blot. Sel SGC-7901 (4.0 × 105 sel/sumur) diinokulasi pada pelat kultur 9 cm dan 20 μg/mL Apt-Au@MSL selama 1, 6, 12, dan 24 jam. Sel dipanen setelah perawatan dan ditangguhkan dalam buffer lisis sel di atas es selama 1 jam. Campuran ditempatkan dalam centrifuge pada 11.000g pada 4°C selama 10 menit, dan supernatan yang mengandung protein seluler total dikumpulkan. Konsentrasi protein total dalam supernatan ditentukan menggunakan metode BCA. Protein kemudian disuspensikan kembali dalam buffer pemuatan dan direbus pada 100 ° C selama 10 menit. Sampel yang mengandung jumlah protein yang sama (40 μg/jalur) dijadikan sasaran SDS-PAGE (10% gel trisin). Mereka kemudian dipindahkan ke membran nitroselulosa (NC) pada 100 V selama 1,5 h dan diblokir menggunakan 5% susu non-lemak dalam saline buffer Tris dengan 0,1% Tween-20 (TBST) selama 1 h. Kemudian, membran NC diinkubasi dengan antibodi primer dan antibodi kedua, masing-masing. Pita protein target divisualisasikan pada membran menggunakan reagen deteksi western blotting ECL. -aktin digunakan sebagai kontrol internal pemuatan dan transfer protein yang sama. Ekspresi protein dikuantifikasi oleh Quantity-One Software, dan laju ekspresi diberi label di bawah pita [33].
Model Hewan
Tikus telanjang jantan BALB / c (~ 17 g) dibeli dari Model Animal Research Center Universitas Nanjing dan dibesarkan di lingkungan axenic (hewan bebas patogen spesifik). Model tumor dibuat dengan injeksi suspensi sel subkutan (sel SGC-7901, 100 μL, 1 × 10
6
/mL) ke dalam bahu tikus telanjang. Gambar terang tumor dihasilkan 15 hari setelah sel tumor injeksi subkutan. Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Pusat Hewan Laboratorium Universitas Pertanian Anhui (Nomor Izin:SYXK 2016-007). Jangka sorong digunakan untuk menentukan diameter longitudinal maksimum (panjang) dan diameter transversal maksimum (lebar) setiap tumor. Volume tumor kemudian dihitung menggunakan rumus panjang × lebar
2
× 0,5 [34].
Studi Antikanker Di Vivo
Tes tindak lanjut dilakukan ketika volume tumor mencapai 50 mm
3
. Tikus secara acak dibagi menjadi lima kelompok menjadi sasaran perawatan intravena berikut:PBS (100 μL), Morin, Morin-liposom, Au-Apt, dan Apt-Au@MSL. Tikus disuntikkan secara intravena ke ekor dengan dosis 2 mg/kg bahan untuk pengobatan. Ukuran tumor tikus diukur setelah 24 hari. Berat badan dan kelangsungan hidup tikus juga ditentukan. Tikus di-eutanasia, dan tumor serta jaringan organ tikus dikumpulkan untuk pewarnaan H&E [35, 36].
Setelah pemblokiran dan permeabilisasi, slide tumor dicuci dengan PBS, diwarnai dengan uji TUNEL, dan dilakukan pewarnaan tandingan DAPI. Gambar fluoresensi diperoleh dengan CLSM. Untuk pencitraan DAPI, Ex = 358 nm dan Em = 461 nm, dan untuk uji TUNEL, Ex = 450–500 nm dan Em = 515–565 nm [37].
Uji Evaluasi Toksisitas
Untuk mengevaluasi toksisitas pengobatan Apt-Au@MSL pada organ vital, tikus dalam empat kelompok perlakuan dikorbankan setelah 30 hari. Organ penting (hati, limpa, ginjal, jantung, paru-paru, dan tumor) mencit dari semua kelompok dikumpulkan dan diwarnai dengan H&E. Sampel darah juga dikumpulkan, dan glukosa darah diukur. Selain itu, bobot tikus ditentukan [38].
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan liposom baru yang memiliki keunggulan nanopartikel (Apt-loaded Au NPs) dan dapat digunakan secara efektif sebagai agen antikanker. Sifat dasar liposom baru penting untuk dilakukan penelitian lebih lanjut. Apt-Au@MSL disintesis seperti yang dijelaskan dalam penelitian sebelumnya [23], dengan sedikit modifikasi, dan kemudian dikarakterisasi menggunakan berbagai metode (Gbr. 3). Gambar 3b menyajikan hasil spektroskopi UV–vis, yang menunjukkan puncak karakteristik dan dapat memantau pembentukan Au NP. Puncak karakteristik diamati dalam spektrum UV-vis NP Au pada sekitar 530 nm. Secara khusus, analisis spektrum UV-vis menunjukkan absorbansi UV yang kuat, yang dipengaruhi oleh modifikasi Apt permukaan. Hasil yang sama diamati. Puncak karakteristik dipindahkan setelah liposom sensitif pH dilapisi dengan Morin. Puncak karakteristik dari Apt-Au@MSL yang dibuat terletak pada 362 dan 550 nm. Hasil ini menunjukkan bahwa sintesis berhasil diselesaikan. Untuk karakterisasi lebih lanjut, dilakukan spektroskopi FT-IR untuk memverifikasi hasil sintesis. Puncak karakteristik pergeseran merah Morin-liposom dan Apt-Au@MSL selanjutnya menunjukkan modifikasi Morin yang berhasil (Gbr. 3c). Kami melakukan uji pelepasan Morin dalam PBS pada tingkat pH yang berbeda untuk menentukan sensitivitas pH Apt-Au@MSL. Ketiga nilai pH ini mensimulasikan lingkungan netral sirkulasi darah, lingkungan tumor yang agak asam, dan lingkungan asam dari tubuh intraseluler. Persentase pelepasan Morin dideteksi dengan spektroskopi UV-vis. Pada pH 5,0, sekitar 54% Morin dilepaskan dalam 24 h, dan pelepasan terus menerus diamati pada 96 h berikut; sementara itu, pada pH 7.4, hanya sekitar 10% Morin yang dilepaskan dalam waktu 24 h. Hasil ini menunjukkan bahwa Apt-Au@MSL menunjukkan stabilitas yang baik dalam kondisi fisiologis normal, mencegah kebocoran obat; namun, obat dilepaskan dengan cepat di badan inti. Perilaku pelepasan obat ini dapat secara efektif meningkatkan efek pengobatan (Gbr. 3d). TEM dan SEM dilakukan untuk menjelaskan struktur liposom dan Apt-Au@MSL (Gbr. 3f). TEM dilakukan untuk menjelaskan struktur AuNPs. Seperti yang ditunjukkan pada Gbr. 3g, AuNP memiliki ukuran partikel sekitar 10 nm, yang konsisten dengan ukuran modifikasi pada liposom (Gbr. 3g). Hasil SEM pada Gambar. 3e menunjukkan bahwa liposom mentah hanya membentuk vesikel unilamellar dengan diameter tidak seragam sekitar 120 nm, yang konsisten dengan ukuran yang ditentukan oleh DLS. Sebaliknya, Apt-Au@MSL menunjukkan bahwa morfologi vesikel hibrida dikaitkan dengan modifikasi Au-Apt. Diameter 150 nm juga konsisten dengan ukuran yang ditentukan oleh DLS (Gbr. 3i). Khususnya, investigasi TEM dari interaksi antara liposom yang sensitif terhadap pH dan Au-Apt mengungkapkan bahwa Au NP dikaitkan hampir secara eksklusif dengan bilayer lipid vesikular dan terlokalisasi di pinggiran vesikel (Gbr. 3h). Pengukuran potensial disajikan pada Gambar 3j, dan potensial zeta dari Au NP dan Au-Apt adalah negatif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa NP Au (− 57.1 ± 0.3 mV) dan Au-Apt bermuatan negatif (− 31.7 ± 0.2 mV). Apt-Au@MSL dimodifikasi dengan Morin-liposom bermuatan positif, dan potensial berubah menjadi 36,4 ± 0,3 mV. Adsorpsi muatan positif dan negatif adalah mekanisme pengikatan Au-Apt dan Morin-liposom. Selain itu, Gambar 3k menunjukkan perubahan laju enkapsulasi partikel dari waktu ke waktu, yang menunjukkan stabilitas partikel selama periode waktu tertentu. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3k, laju enkapsulasi partikel hampir tidak berubah dalam 24 jam, menunjukkan bahwa partikel menunjukkan stabilitas yang baik selama periode waktu tertentu. Kurva standar konsentrasi Morin versus absorbansi UV-Vis Morin disiapkan untuk mempelajari laju enkapsulasi Morin-liposom dan Apt-Au@MSL. Hasil penelitian menunjukkan bahwa efisiensi penjebakan Morin-liposom dan Apt-Au@MSL dapat mencapai 90,2% dan 89,6%, seperti yang ditunjukkan pada Tabel S1 dan Gambar. S1
Gambar karakterisasi. a Ilustrasi skema sintesis Apt-Au@MSL. b Spektrum serapan ultraviolet Morin, Au NPs, Au-Apt, Morin-liposome, dan Apt-Au@MSL. c Spektrometer FT-IR Morin, Morin-liposom, dan Apt-Au@MSL. d Perilaku pelepasan Morin dari Apt-Au@MSL pada kondisi pH yang berbeda. e Gambar SEM dari Morin-liposom. f Gambar SEM dari Apt-Au@MSL. g Gambar TEM dari Au NP. h Gambar TEM dari Apt-Au@MSL. saya Diameter Morin-liposom dan Apt-Au@MSL ditentukan setidaknya tiga kali melalui DLS. j -Potensi Au NP, Apt-Au, dan Apt-Au@MSL. k Tingkat efisiensi jebakan (EE%) Morin–liposom dan Apt-Au@MSL
Uji Aktivitas Antikanker Apt-Au@MSL
In Vitro
Morin menunjukkan aktivitas antitumor yang unggul tetapi memiliki bioavailabilitas yang rendah karena kelarutannya dalam air yang rendah. Setelah Morin dienkapsulasi oleh liposom yang peka terhadap pH dan diubah menjadi bahan yang larut dalam air, permukaan liposom dimodifikasi menggunakan Au-Apt untuk mendapatkan efek antitumor yang ditargetkan. Gambar 4a menunjukkan aktivitas antikanker Apt-Au@MSL dengan uji MTT in vitro. Konsentrasi obat ditentukan oleh konsentrasi Morin. Kelompok yang diberi Morin tidak menunjukkan aktivitas antikanker yang nyata, dibandingkan dengan kelompok yang kosong. Namun, kelompok yang diobati dengan Morin yang dienkapsulasi oleh liposom yang peka terhadap pH menunjukkan peningkatan aktivitas antikanker. Hasilnya menunjukkan bahwa aktivitas antitumor Morin-liposom lebih unggul daripada Morin mentah. Secara bersamaan, kami menemukan bahwa aktivitas antitumor dari liposom yang dimodifikasi oleh Apt (Apt-Au@MSL) ditingkatkan. Tabel 1 mencantumkan IC50 nilai Morin, Morin-liposom, Apt-Au@MSL, dan cisplatin. Morin, Morin-liposom, dan Apt-Au@MSL menunjukkan berbagai aktivitas antikanker pada sel tumor. Mereka menunjukkan preferensi yang berbeda untuk sel SGC-7901 dengan potensi tinggi dan toksisitas rendah terhadap sel manusia normal. IC50 nilai Apt-Au@MSL adalah 15.6 ± 1.5 μg/mL untuk sel SGC-7901. Hasil ini selanjutnya dikonfirmasi oleh pengujian RTCA. Sel SGC-7901 dikultur dengan Apt-Au@MSL pada konsentrasi yang berbeda; kelompok kosong diperlakukan dengan PBS, dan kelompok kontrol terdiri dari Morin dan Morin-liposom. Adhesi dan penyebaran dipantau menggunakan iCELLigence (Gbr. 4b). Hasilnya sebagian besar mirip dengan yang diperoleh dengan pengujian MTT. Aktivitas antitumor Apt-Au@MSL secara signifikan lebih tinggi daripada Morin dan Morin-liposom. Apt-Au@MSL dapat menghambat proliferasi sel SGC-7901 dengan peningkatan konsentrasi. Perubahan morfologi sel setelah pengobatan Apt-Au@MSL juga diamati dengan mikroskop fluoresensi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4c, sel SGC-7901 tanpa Apt-Au@MSL mempertahankan integritas struktural sel. Sebaliknya, integritas sel terganggu setelah sel diperlakukan dengan Apt-Au@MSL pada konsentrasi yang berbeda.
a Viabilitas sel dari sel SGC-7901 yang diinkubasi dengan bahan yang berbeda (Morin, Au-Apt, Morin–liposome, dan Apt-Au@MSL) pada konsentrasi yang berbeda (0, 5, 10, 15, 20, dan 30 μg/mL). Sel yang telah diperlakukan oleh PBS ditetapkan sebagai kelompok kosong. b Kurva proliferasi sel sel SGC-7901 dideteksi oleh sistem RT-CES. Senyawa yang berbeda ditambahkan pada 10 h. Konsentrasi a , b , dan c berbeda Apt-Au@MSL (10, 20, dan 30 μg/mL), masing-masing. c Gambar sel terang pada konsentrasi yang berbeda (0, 2.5, 5, 10, 20, dan 30 μg/mL)
Analisis Kematian Sel Apoptosis
Analisis kuantitatif apoptosis dilakukan dengan flow cytometry menggunakan pewarnaan Annexin-FITC. Sel-sel diwarnai dengan PI dan Annexin V-FITC dan kemudian dianalisis menggunakan sitometer aliran CytoFLEX (Beckman Coulter). Annexin V digunakan untuk mendeteksi sel-sel apoptosis awal yang terikat pada fosfatidilserin yang terpapar, dan pelabelan PI digunakan untuk menodai sel-sel apoptosis akhir. Rasio apoptosis adalah 1,57% untuk kelompok kosong. Sel-sel yang diobati dengan Morin menunjukkan rasio apoptosis 3,51%. Apt-Au@MSL pada konsentrasi yang berbeda menunjukkan kemampuan menginduksi yang lebih tinggi dengan rasio apoptosis 7,44%, 10,75%, 15,53%, dan 40,77% (Gbr. 5). Apoptosis yang ditingkatkan juga mengkonfirmasi aktivitas antikanker yang luar biasa yang diinduksi oleh Apt-Au@MSL. Rasio apoptosis sel SGC-7901 meningkat dengan meningkatnya konsentrasi Apt-Au@MSL.
Analisis sitometri aliran berbasis pewarnaan Annexin V-FITC/PI dari apoptosis SGC-7901 setelah perawatan dengan metode yang berbeda. Konsentrasi a , b , c , dan d adalah 5, 10, 20, dan 30 μg/mL, masing-masing
Studi Aktivitas Antikanker dengan Uji Fluoresensi
Efek antitumor pada sel SGC-7901 yang diinduksi oleh Apt-Au@MSL dievaluasi secara intuitif dengan uji fluoresensi LIVE/DEAD. Setelah sel diinkubasi dengan Morin, Morin-liposom, dan Apt-Au@MSL pada konsentrasi yang berbeda, mereka diwarnai bersama dengan kit LIVE/DEAD selama 30 menit dalam kondisi gelap. Pada Gambar. 6, sel-sel dalam kelompok kosong menunjukkan bahwa semua sel fluoresensi hijau mewakili sel hidup. Kelompok kontrol, termasuk Morin dan Morin-liposom, menunjukkan jumlah sel fluoresen merah. Namun, sel-sel yang diperlakukan dengan Apt-Au@MSL pada konsentrasi yang berbeda jelas menunjukkan sejumlah besar sel-sel apoptosis. Dengan peningkatan konsentrasi, sel-sel hidup secara bertahap menurun. Persentase sel kematian meningkat secara dominan, dan kepadatan sel menurun. Hasilnya menegaskan bahwa Apt-Au@MSL dapat secara efektif mempromosikan apoptosis tumor.
Gambar mikroskopis fluoresensi SGC-7901 diinkubasi dengan konsentrasi berbeda Apt-Au@MSL dan pewarnaan singkat berikutnya. Kelompok kosong adalah PBS. Morin dan Morin–liposom ditetapkan sebagai kelompok kontrol
Studi Integritas Sel
Untuk mengkonfirmasi pengaruh penyerapan dan pengangkutan Apt-Au@MSL ke sel SGC-7901, kami melakukan uji TEM. Perubahan morfologi sel diamati oleh TEM. Gambar TEM dilakukan untuk mengamati struktur internal sel dan memberikan referensi untuk mekanisme antikanker. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7, gambar kosong sel SGC-7901 tanpa pengobatan menunjukkan perubahan signifikan dalam morfologi dan tampilan dinding sel yang jernih. Pada kelompok kontrol (Morin dan Morin-liposom), morfologi sel menunjukkan kerusakan parsial, dan daerah inti berkontraksi. Namun, perubahan signifikan pada dinding sel dan struktur internal juga diamati setelah terpapar Apt-Au@MSL. Sitoplasma bocor, dan struktur inti menjadi tidak jelas. Banyak fragmen sel terbentuk di sekitar sel berongga. Selain itu, dinding sel hancur atau hancur. Seluruh profil menjadi tidak jelas, sel-sel rusak, dan sitoplasma bocor. Panah merah mewakili area Au NP. As the concentration of the Apt-Au@MSL increased, more Au NP regions appeared in the nucleus. This occurrence suggested the release of Morin after Apt-Au@MSL entered the cell interior, hence the appearance of a large amount of Au NPs. These aforementioned results suggest that antitumor activity was associated with compromised cell integrity and nuclear structure.
TEM images of SGC-7901 cells treated with different concentration of Apt-Au-MSL (10, 20, and 30 μg/mL). The blank group was PBS. The Morin and Morin–liposome were set as control group. The red square is the enlarge area. The red arrow point to Au NPs
Molecular Mechanism Induced by Apt-Au@MSL
To explore the molecular mechanism of Apt-Au@MSL-induced apoptosis, we detected the expression levels of caspases and PARP. Activation of caspase-3, -8, and -9 was first detected with specific substrates. As shown in Fig. 8a, Apt-Au@MSL treatment induces dose-dependent activation of caspase-3, -8, and -9. Caspase-9 promotes mitochondria-mediated apoptosis more than does caspase-8, indicating that the mitochondria-mediated apoptosis signaling pathway is dominant. Western blot analysis further confirmed the existence of Apt-Au@MSL-induced apoptosis at the protein level. Figures 8b and c show that after cells are treated with Apt-Au@MSL, activation of caspases and cleavage of PARP shows time and dose dependence (Figs. 8b, c). In Fig. 8d, e, the Western blot analysis confirmed our results. In conclusion, Apt-Au@MSL inhibits the growth of SGC-7901 cells mainly by inducing apoptosis.
Apt-Au@MSL induced apoptosis in SGC-7901 cells. a SGC-7901 cells were treated with indicated concentrations of Apt-Au@MSL for 24 h. Then, the total protein was extracted and incubated with synthetic Apt-Au@MSL substrates for measuring caspase activities. Dose-dependent (b ) and time-dependent (c ) effects of Apt-Au@MSL on PARP and caspases expression. d , e Quantitative analysis of PARP, caspase-7, caspase-9, and caspase-3 expressions. Data are means ± SD, *P < 0,05, **P < 0.01
Apt-Au@MSL Inhibits Tumor Growth
In Vivo
The in vivo antitumor activities of Apt-Au@MSL were evaluated using an SGC-7901 tumor xenograft model. A comparison of the images of the tumors with those of the control group (Morin and Morin–liposomes) showed that mice treated with Apt-Au@MSL markedly reduced the weight and size of the tumor (Fig. 9a). The relative tumor volume curves and the mice weight curves indicate that the Apt-Au@MSL in vivo exhibits a higher anticancer efficiency (Fig. 9b) than those of the other treatment groups. No significant difference in average tumor volume was indicated between the control group (Morin and Morin–liposomes) and the blank group. The tumor volume of the Apt-Au@MSL group was only nearly a tenth of the blank group and nearly a sixth of the control group. The result indicated that raw Morin and Morin–liposomes at 40 mg/kg exerted no effect on the growth rate of tumors. However, Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth. The body weight of mice in the different groups (PBS, Morin, Morin–liposomes, and Au-Apt groups) showed no marked fluctuation (Fig. 9c) during the treatment period. This result suggested that the treatment was tolerated and caused no acute side effects. Notably, we found that the mice with Apt-Au@MSL treatment showed markedly prolonged survival (Fig. 9d). The surviving mice in this group behaved normally, showing no apparent sign of unhealthy condition. These results demonstrated that the administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models.
a In vivo applications of Apt-Au@MSL and photographs of the mice tumor taken 24 days. A dosage of 2 mg/kg was administrated intravenously for all mice (n = 6–8). b Tumor weight of mice in different groups after 24 days. c Tumor volume index for the different treatment groups. The tumor sizes were measured at the indicated time points. d Survival rate of the mice in different group after tumor inoculation. Data are means ± SD (n = 6-8). The intravenous injection of PBS was set as blank group (100 μL); the treated by Morin and Morin–liposome were set as control group. In vivo therapeutic effects of Apt-Au@MSL in SGC-7901-bearing mice. Data are means ± SD, *P < 0,05, **P < 0.01
Histological Analysis of Anticancer Activity
H&E staining of tumor tissue and organ samples was conducted after fixation and treatment. Treatment efficacy with respect to tumor cell death was also evaluated by H&E staining of tumor tissue from different groups. In Fig. 10a, the mice treated with Au-Apt, Morin, and Morin–liposomes show the same extent of thermal damage as that of the mice in the blank group. No apparent apoptosis was observed in the blank group. The tumor tissue sections consisted of tightly packed tumor cells. However, Apt-Au@MSL treatment exhibited the most significant damage to the tumor tissue, with moderate cell apoptosis in the tumor. The result suggested anticancer activity in the mouse models treated with Apt-Au@MSL. To further investigate the ratio of apoptotic cells in tumors tissue in vivo, TUNEL assay was performed for the detection of apoptotic cells. As shown in Fig. 10b, the apoptotic cells in tumors can be stained with green fluorescence to indicate apoptosis. The merged images show fewer green fluorescent regions in the blank group and the control group (Morin and Au-Apt), indicating the presence of fewer apoptotic cells. The cells of the mice treated with Morin–liposomes appear partly apoptotic. Moreover, a large number of green fluorescent regions were observed in the group treated with Apt-Au@MSL, indicating a large amount of apoptotic cells. The results were consistent with that of H&E staining, confirming that Apt-Au@MSL can promote tumor apoptosis in vivo.
a H&E staining analysis of the tumors in mice. Histological analysis of the tumors in mice following different treatments as PBS, Morin, Morin–liposome, Au-Apt, and Apt-Au@MSL group. b Apoptotic cells were detected by a TUNEL assay (green) and co-stained by nuclear staining DAPI (blue)
In Vivo Toxicity Evaluation
The potential in vivo toxicity is often a significant concern for the clinical application of anticancer medicine. To verify the applicability of Apt-Au@MSL in vivo, the mice were evaluated under different treatments (Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL). Blood biochemical assays were also conducted to examine possible changes in the biochemistry of mice after treatment. As shown in Fig. 11a, the blood glucose index for blood function of the Apt-Au@MSL groups was similar to those of the blank and control groups. No difference in body weight was found in each group. A steady increase was observed, indicating that the drug exhibited no toxicity (Fig. 11b). H&E staining of organ sections (Fig. 11c) showed no sign of damage or inflammation in the group treated with Apt-Au@MSL, compared with the blank and control group. This finding indicated that PBS, Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL were negligible side effects in vivo. These results, as well those of H&E staining, further indicate safety in the use of Apt-Au@MSL for tumor treatment.
In vivo toxicity evaluation. a Blood glucose data detected in the mouse toxicity model. b Weight of mice in different groups after 24 days. c Images of H&E-stained major organs. Each value represents the mean ± SD (n = 3)
Conclusions
In conclusion, this study presents the synthesis of an antitumor nanomaterial, Apt-Au@MSL. Apt-Au@MSL exhibited excellent monodispersity and tumor-targeting properties. The polarity of Morin was modified, and the antitumor activity was enhanced. The pH of the solution was 5.0, and the release rate of Morin from Apt-Au@MSL was the maximum in the characterization experiments. Apt-Au@MSL showed that the morphology of hybrid vesicles was attributable to Au-Apt modification. The diameter of 150 nm was consistent with the size determined by DLS. We screened our model cancer cell by MTT assay and found that SGC-7901 cells could effectively suppress proliferation. The IC50 of Apt-Au@MSL was 15.6 ± 1.5 μg/mL for the SGC-7901 cells. Fluorescent flow cytometric assays confirmed that Apt-Au@MSL could be used as an effective anticancer material and induced apoptosis in vitro. The Apt-Au@MSL found in the internal cell, as shown in the TEM images, suggested that Apt-Au@MSL could target the cancer cell. The administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models, as determined from tumor weight testing. H&E staining and TUNEL assay further confirmed that Apt-Au@MSL could promote tumor apoptosis in vivo. Both blood biochemistry testing and H&E staining suggested that these materials exhibit negligible acute toxicity and good biocompatibility in vivo.
Ketersediaan Data dan Materi
The authors declare that the materials, data, and associated protocols are promptly available to the readers without undue qualifications in material transfer agreements. All data generated and analyzed during this study are included in this article.
Singkatan
Apt:
Aptamers
Apt-Au:
Aptamers and Au nanoparticle
MSL:
Morin pH-sensitive liposome
AuNP:
Nanopartikel emas
ROS:
Spesies oksigen reaktif
Apt-Au@MSL:
Aptamers and Au nanoparticle-modified Morin pH-sensitive liposome
