Muatan Permukaan Mengatur Kompleksasi Nanopartikel Pullulan–Albumin Serum Manusia dan Pengobatan Terkontrol

Abstrak

Desain nanopartikel bergantung pada bagaimana kimia permukaan mengatur adsorpsi protein dalam aliran darah. Kami menyintesis tiga polimer berbasis pullulan—pullulan yang dimodifikasi kolesterol (CHP), pullulan yang dimodifikasi CH terani (CHAP), dan pullulan yang dimodifikasi CH karboksilat (CHSP)—dan membentuk nanopartikel melalui diyalisis. Pencaharan cahaya dinamis mengungkapkan bahwa ukuran partikel bervariasi dengan jumlah grup terisi: CHP (73,1 nm, −0,698 mV), CHAP (116,9 nm, +12,9 mV), dan CHSP (156,9 nm, −15,4 mV). Kalorimetri titrasi isotermal menunjukkan profil termodinamika yang berbeda untuk binding HSA: konstanta binding (K_b) sebesar 1,41 × 10⁴, 27,7 × 10⁴, dan 412 × 10⁴ M⁻¹ untuk CHSP, CHP, dan CHAP, masing-masing, yang mencerminkan pengaruh muatan permukaan. Analisis fluorescensi dan sirkular dikloro mengonfirmasi bahwa HSA mengalami pengurangan helik α- saat kompleksasi, dengan CHP menginduksi perubahan konformasi terbesar. Studi pelepasan obat in vitro menggunakan mitoksantron menunjukkan bahwa adsorpsi HSA secara signifikan memperlambat pelepasan: setelah 48 jam, CHSP–HSA melepaskan 35,8 %, CHP–HSA 33,9 %, dan CHAP–HSA 32,5 %, dibandingkan dengan 53,7 %, 58,5 %, dan 63,2 % untuk setara nanopartikel bebasnya. Hasil ini menekankan bahwa ukuran nanopartikel, muatan permukaan, dan formasi korona protein secara kritis menentukan kinetika pelepasan obat dan, dengan demikian, efektivitas terapeutik.

Latar Belakang

Pengiriman obat nano yang ditargetkan telah muncul sebagai sumbu dari onkologi modern, menawarkan rilis yang berkelanjutan dan toksis sistemik yang dimin (1–3). Agar nanopartikel (NP) mencapai jaringan tumor, ia harus menavigasi sirkulasi darah, melewati endotelis vaskular, menembus matriks ekstraselular, dan masuk ke sel kanker (4–6). Adsorpsi protein—terutama protein plasma yang berlimpah seperti albumin serum manusia (HSA)—membentuk "korona protein" yang dapat mengubah distribusi biodistribusi NP, penyerapan seluler, dan pelepasan obat (10–14). Komposisi korona didorong oleh konsentrasi protein, affinitas NP, dan properti permukaan, termasuk muatan, hidrofobisitas, dan ukuran (15–19).

Pullulan, polisakarida netral, dapat dimodifikasi kimiawi untuk memperkenalkan grup hidrofobik kolesterol, menghasilkan polimer amfifilik yang menyusun diri menjadi NP inti-kulit. Karya sebelumnya telah menunjukkan bahwa pullulan yang dimodifikasi kolesterol (CHP) dapat mengenkapsulasi obat anti-kanker dan HSA terikat pada CHP melalui interaksi hidrofobik (28–31). Berdasarkan ini, kami merancang dua varian tambahan: pullulan terani yang dimodifikasi CH (CHAP) yang membawa grup amino dan pullulan karboksilat yang dimodifikasi CH (CHSP) yang membawa grup karboksilat. Modifikasi ini memungkinkan eksplorasi sistematis tentang bagaimana muatan permukaan mempengaruhi adsorpsi protein dan pelepasan obat.

Metode

Bahan

HSA (Sigma-Aldrich), N,N-imidazol, etilendiamina, anhidrid suksinat, dan reagen lainnya adalah kelas analitik.

Sintesis CHP, CHSP, dan CHAP

CHP disiapkan dengan esterifikasi pullulan dengan suksinat kolesterol (CHS) dalam DMSO, diikuti dengan pemurnian (Gambar 1). CHAP diperoleh dengan bereaksi CHP dengan N,N-diimidazol dan etilendiamina; CHSP disintesis melalui kopling anhidrid suksinat. Konfirmasi struktural dilakukan oleh FTIR dan ¹H-NMR, menghasilkan derajat substitusi kolesterol sebesar 4,5 % (CHP), 7,8 % (CHSP), dan 14,1 % (CHAP) (Gambar 2–3).

Persiapan dan Karakterisasi NP

Nanopartikel dibentuk melalui diyalisis polimer dalam DMSO terhadap air, diikuti dengan filtrasi (0,45 µm). Ukuran dan potensi zeta diukur oleh pencaharan cahaya dinamis (DLS). NP CHP, CHAP, dan CHSP menunjukkan diameter rata-rata 73,1 nm, 116,9 nm, dan 156,9 nm, dengan potensi zeta masing-masing −0,698 mV, +12,9 mV, dan −15,4 mV (Gambar 4).

ITC

Kalorimetri titrasi isotermal mengkuantifikasi termodinamika binding HSA ke setiap tipe NP pada 25 °C (Gambar 5). Binding eksotermik diamati untuk CHP dan CHSP, sementara CHAP menunjukkan fase eksotermik awal diikuti dengan binding endotermik, yang mencerminkan interaksi antara gaya hidrofobik dan elektrostatis.

Spektroskopi Fluorescensi

Fluorescensi HSA (eksitasi 280 nm, emisi 290–450 nm) dipantau setelah dicampur dengan setiap tipe NP. Analisis pemaduan menggunakan persamaan Stern–Volmer yang dimodifikasi menghasilkan konstanta binding sebesar 2,02, 2,99, dan 4,72 × 10⁵ M⁻¹ untuk CHSP, CHP, dan CHAP, masing-masing, yang mengindikasikan interaksi terkuat untuk CHAP yang bermuatan positif.

Analisis Dikloro Sirkular

Spektra CD (200–250 nm) menilai perubahan struktur sekunder HSA saat binding NP. Konten helik α- menurun dari 55 % (HSA bebas) menjadi 48–52 % untuk kompleks, dengan reduksi paling terpinggirkan untuk CHP–HSA (Gambar 8).

Pelepasan Obat In Vitro

Mitoksantron (MTO) dienkapsulasi ke dalam setiap NP melalui diyalisis. Profil pelepasan diukur dalam PBS pada 37 °C, dengan dan tanpa HSA (0,1 mg/mL). Obat bebas melepaskan 99,8 % dalam 4 jam. Untuk NP saja, tingkat pelepasan 48 jam adalah 53,7 % (CHP), 58,5 % (CHAP), dan 63,2 % (CHSP). Kehadiran HSA mengurangi tingkat ini menjadi 33,9 % (CHP–HSA), 32,5 % (CHAP–HSA), dan 35,8 % (CHSP–HSA) (Gambar 9).

Hasil

Karakterisasi Polimer CHP, CHSP, dan CHAP

Spektra FTIR mengonfirmasi fungsionalisasi yang berhasil: puncak karbonil ester pada 1731 cm⁻¹ untuk CHP, puncak amida pada 1648 cm⁻¹ untuk CHAP, dan puncak karboksilat pada 1710 cm⁻¹ untuk CHSP (Gambar 2). Analisis NMR mengukur derajat substitusi (Tabel 1).

Properti NP CHP, CHSP, dan CHAP

Ukuran dan muatan permukaan secara langsung mempengaruhi penyusunan diri NP: CHSP yang bermuatan negatif dan CHAP yang bermuatan positif membentuk partikel yang lebih besar (156,9 nm dan 116,9 nm) dibandingkan CHP netral (73,1 nm). Potensi zeta mencerminkan grup fungsional yang dimasukkan (−15,4 mV, +12,9 mV, −0,698 mV). Kehadiran grup terisi mengganggu empaatan inti, menghasilkan struktur yang lebih longgar dan lebih besar (Gambar 4).

Analisis Termodinamika

Data ITC (Tabel 2) mengungkapkan binding eksotermik untuk CHP (ΔH = 42,8 kJ mol⁻¹) dan CHSP (ΔH = 80,4 kJ mol⁻¹), dan profil eksotermik-endotermik campuran untuk CHAP (ΔH = 22,4 kJ mol⁻¹). Perubahan entropi menunjukkan binding HSA yang lebih mudah pada CHP dan CHAP (ΔS = 0,251 kJ mol⁻¹ K⁻¹ dan 2,775 kJ mol⁻¹ K⁻¹) dibandingkan CHSP (ΔS = 0,201 kJ mol⁻¹ K⁻¹).

Spektroskopi Fluorescensi

Pemaduan fluorescensi mengonfirmasi fase adsorpsi cepat diikuti dengan pembentukan kompleks yang lebih lambat. Konstanta binding yang dihasilkan dari analisis Stern–Volmer cocok dengan hasil ITC, menekankan peran dominan elektrostatis untuk CHAP dan hidrofobisitas untuk CHP (Gambar 7).

Analisis Spektra CD

Pengukuran CD menunjukkan hilangnya helik α- secara progresif saat kompleksasi: CHP–HSA turun menjadi 48,0 %, CHAP–HSA menjadi 48,6 %, dan CHSP–HSA menjadi 52,0 % (Gambar 8). Pengurangan helikitas tercepat terjadi untuk CHP, konsisten dengan inti yang lebih kecil dan padatnya.

Pelepasan Obat

Adsorpsi HSA secara konsisten memperlambat pelepasan obat di semua tipe NP. Hierarki tingkat pelepasan (48 jam) sesuai dengan urutan ukuran dan muatan permukaan NP: CHSP > CHAP > CHP untuk NP bebas, dan CHSP–HSA > CHP–HSA > CHAP–HSA untuk kompleks yang terikat protein (Gambar 9). Temuan ini menyoroti bagaimana korona protein memodulasi jalur difusi dan degradasi.

Pembahasan

Data kami mengonfirmasi bahwa muatan permukaan adalah faktor penentu dalam pembentukan korona HSA dan pelepasan obat berikutnya. CHAP yang bermuatan positif membentuk kompleks NP–HSA yang terkuat, yang diatribusikan pada kombinasi tarikan elektrostatis dan ancoran hidrofobik. Sebaliknya, CHSP yang bermuatan negatif menunjukkan binding yang terlemah, terbatas pada tolakan muatan dan cangkang yang lebih berlubang yang melambat migrasi protein ke inti. CHP netral menempati posisi menengah, menampilkan cakupan HSA tertinggi karena inti hidrofobik yang padat.

Interaksi ini mempengaruhi nasib in vivo dari NP yang dimuat obat. Korona protein yang padat dapat menghalangi penyeberangan endotelis, mengubah distribusi organ, dan mengurangi penyerapan seluler (15–18). Dengan menyesuaikan muatan permukaan, kita dapat memodulasi komposisi korona dan dengan demikian menyesuaikan farmakokinetik dan jendela terapeutik.

Kesimpulan

Kami berhasil merancang tiga nanopartikel berbasis pullulan dengan muatan permukaan yang berbeda. Ukuran, muatan, dan hidrofobisitas secara kolektif mengatur adsorpsi HSA, kekuatan binding, dan kinetika pelepasan obat. CHAP yang bermuatan positif menunjukkan binding protein terkuat dan pelepasan obat paling lambat, sedangkan CHP netral menunjukkan cakupan protein tertinggi tetapi pelepasan tercepat di antara NP bebas. Wawasan ini memberikan biruan untuk merancang nanokarier dengan profil korona protein yang disesuaikan untuk mengoptimalkan pengiriman yang ditargetkan dan rilis yang dikendalikan.