Redox-Sensitive Gelatin/Silica-Aptamer Nanogels untuk Pengiriman siRNA yang Ditargetkan
Abstrak
Interferensi RNA (RNAi) memiliki keunggulan potensial dibandingkan pendekatan terapi gen lainnya karena spesifisitasnya yang tinggi dan kemampuannya untuk menghambat ekspresi gen target. Namun, stabilitas dan pengiriman siRNA spesifik jaringan tetap menjadi hambatan terbesar untuk terapi RNAi. Di sini, kami mengembangkan sistem seperti itu dengan mengkonjugasikan nanogel berbasis gelatin dengan aptamer AS1411 yang ditargetkan nukleolin dan siRNA tersubstitusi deoksinukleotida bersama-sama (Apt-GS / siRNA) melalui penghubung disulfida untuk mencapai docking sementara siRNA. Nanogel Apt-GS / siRNA ini menunjukkan pelepasan siRNA yang menguntungkan dalam kondisi reduksi karena pembelahan disulfida. Lebih lanjut, sistem cerdas ini dapat secara elektif melepaskan siRNA ke dalam sitosol dalam sel-sel positif nukleolin (A549) oleh pembongkaran yang dipicu glutathione dan selanjutnya RNAi yang efisien untuk luciferase. Selain itu, nanogel Apt-GS yang dilengkapi disulfida menunjukkan biokompatibilitas yang baik secara in vitro. Secara keseluruhan, nanogel cerdas penargetan tumor yang responsif terhadap redoks ini menunjukkan potensi besar dalam memanfaatkan pengiriman siRNA yang difungsikan dan terapi tumor.
Pengantar
Interferensi RNA (RNAi) adalah pembungkaman gen yang spesifik urutan dan juga saat ini sedang dievaluasi sebagai metode yang paling menjanjikan dalam pengobatan berbagai penyakit termasuk kelainan genetik, kanker, dan penyakit menular, karena spesifisitasnya yang tinggi dan toksisitasnya yang rendah. [1]. RNA pengganggu kecil (siRNA) dengan molekul RNA untai ganda lebih tahan terhadap degradasi nuklease daripada oligonukleotida antisense dan karena itu menunjukkan keunggulan dibandingkan terapi antisense. Penggabungan nukleotida yang dimodifikasi secara kimia ke dalam siRNA digunakan untuk menambah atau mengurangi kemanjuran dan durasi RNAi. Penggantian ribonukleotida sense strand dengan deoxynucleotides telah terbukti dapat meningkatkan stabilitas sense strand dan mempertahankan efikasi RNAi 40% [2, 3]. Namun, pengiriman siRNA spesifik jaringan tetap menjadi kendala besar untuk aplikasinya meskipun potensi knockdown gen yang besar diamati dalam studi in vitro [4, 5].
Pengiriman berbasis nanopartikel memiliki keuntungan potensial dalam stabilisasi siRNA yang efektif dan modifikasi lebih lanjut untuk pengiriman spesifik lokasi [6,7,8]. Pengiriman siRNA yang diarahkan ke situs yang produktif dapat meningkatkan transfeksi dan mengurangi efek di luar target, yang diperlukan oleh sebagian besar aplikasi praktis [9]. Nukleolin dikaitkan dengan beragam proses biologis dan diekspresikan secara liar dalam nukleus dan sitoplasma berbagai sel normal. Selain itu, nukleolin sangat diekspresikan pada membran plasma sel kanker yang berkembang biak secara aktif relatif terhadap rekan normalnya dan karenanya digunakan sebagai target yang menarik untuk perawatan antineoplastik. Aptamer AS1411 (juga dikenal sebagai AGRO100), aptamer DNA kuartet G, dapat secara kuat mengikat nukleolin permukaan sel dan memblokir jalur antiapoptosis dalam sel kanker dengan menggabungkan dengan modulator esensial faktor-kB nuklir, yang telah mencapai uji klinis fase II sebagai obat aptamer asam nukleat pertama untuk pengobatan kanker pada manusia [10, 11]. Sejauh ini, AS1411 telah berhasil terkonjugasi ke berbagai nanopartikel dan menginternalisasikannya ke dalam sel kanker [12,13,14,15]. Gelatin telah digunakan untuk enkapsulasi siRNA karena biokompatibilitasnya yang sangat baik, biodegradabilitas, dan sifat gelasi [16,17,18]. Kelompok kami telah mengeksplorasi serangkaian siloxane-crosslinked gelatin nanogels (GS NGs) dengan ukuran dan muatan permukaan yang terkontrol, menunjukkan efisiensi transfeksi GS NGs in vitro dan in vivo [19, 20].
Selain hambatan intraseluler, hambatan intraseluler setelah internalisasi termasuk pembongkaran siRNA yang efisien dan pelepasan endosom sama-sama tetap menantang. Konjugasi siRNA ke pembawa melalui ikatan labil atau tidak labil adalah metode yang menjanjikan untuk mengatasi tantangan pengiriman ini. Pelepasan rangsangan-responsif di bawah pH asam dan potensi redoks telah mendapat perhatian besar. Tautan silang disulfida menunjukkan potensi besar dalam ledakan pelepasan obat melalui ikatan yang terputus dalam sel tumor karena tingkat glutathione (GSH) yang lebih tinggi di lingkungan ekstraseluler [21, 22]. Telah dilaporkan bahwa konjugat poli (asam laktat-co-glikolat) (PLGA)/siRNA yang terbentuk melalui ikatan disulfida menunjukkan peningkatan enkapsulasi dan efisiensi pengiriman [23].
Dalam karya ini, nanogel hibrida berdasarkan GS dengan fungsi ganda respons redoks konjugasi disulfida dan penargetan tumor spesifik aptamer AS1411 dieksplorasi sebagai pembawa siRNA untuk terapi kanker (Skema 1). Kami bertujuan untuk menyelidiki apakah GS NG fungsional AS1411 akan meningkatkan internalisasi seluler yang efektif dan mencapai pembungkaman gen spesifik tumor dari gen model luciferase in vitro. Selain itu, keamanan sistem ini juga dievaluasi secara in vitro.
Apt-GS NG yang responsif redoks dan menargetkan tumor dikembangkan untuk pengiriman siRNA dengan konjugasi disulfida dan aptamer AS1411
Metode
Materi
Gelatin (nomor mekar:240-270, pH 4.5–5.5) dibeli dari BBI Company Inc. (AS). T -succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP), 3-glycidoxypropyl-trimethoxysilane (GPSM), dan 3-aminopropyl-trimethoxysilane (APTMS) dibeli dari Sigma-Aldrich Co. (AS). 3-(4, 5-Dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) dibeli dari Amresco Co. (AS). Media Dulbecco yang dimodifikasi Eagle (DMEM), serum janin sapi, penisilin, dan streptomisin diperoleh dari Hyclone Co. (USA). Aptamer AS1411, AS1411 berlabel 5′-FAM, dan DNA kontrol negatif (TDO) disintesis oleh Sangon Biotech Co. (China). Untai indra tiol dari Luc-siRNA, 5′-SH-(CH2 )6 -CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3′ (pengganti deoksinukleotida untuk ribonukleotida) dan untai anti-sense, 3′-TTGAAUGCCAUCAUGAAGCU-5′, dan untai anti-sense berlabel FAM pada ujung 3 disintesis dan dimurnikan dengan HPLC oleh Gene Pharma Co. ( Cina). Lipofectamine 2000, luciferase plasmid pGL3, dan sistem uji luciferase dibeli dari Promega Co. (AS). Sel adenokarsinoma paru-paru manusia ganas A549 dan fibroblas NIH 3T3 normal digunakan dan disediakan oleh Pusat Teknik Biomedis Universitas Xiamen (Cina). Semua bahan yang digunakan adalah kelas analitis dan tanpa pemurnian lebih lanjut. Peralatan gelas dibersihkan secara menyeluruh dan dibilas dengan air deionisasi.
Urutan DNA adalah sebagai berikut:
AS1411 aptamer:5′-GGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3′, Kontrol TDO:5′-CACCGGGAGGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTT-3′
Persiapan dan Karakterisasi Kompleks Apt-GS/siRNA
Gelatin/silika nanogel yang difungsikan dengan amino (GS NGs) pertama kali dibuat dengan prosedur sol-gel, seperti yang dijelaskan sebelumnya [19]. Biasanya, 0,2 g GPSM ditambahkan ke 20 mL larutan gelatin 0,75% dalam larutan HCl (pH = 3) pada 60 °C di bawah 30 menit pengadukan, dan kemudian menambahkan 0,08 g APTMS dan inkubasi selama 24 jam. GS NG yang diperoleh dimurnikan dengan sentrifugasi (14.000 rpm, 25 °C, 12 min) selama tiga kali. Kedua, GS NGs (0,5 mL, 5 g/L dalam PBS) diperlakukan dengan 25 uL SPDP (20 mM dalam DMSO) selama 60 mnt pada suhu kamar, diikuti dengan penambahan AS1411 tiolasi (1 mg/mL) dan diaduk untuk 12 jam. Nanogel Apt-GS diperoleh dengan sentrifugasi (14.000 rpm, 25 °C, 12 min) dan dimurnikan dengan air deionisasi tiga kali. Ketiga, suspensi Apt-GS NG teraktivasi SPDP yang diperoleh (80 mL, 5 mg/mL) dicampur langsung dengan untai rasa siRNA semalaman pada suhu 4 °C. Setelah pemurnian dengan sentrifugasi, untai anti-sense siRNA ditambahkan dan diinkubasi selama 5 min pada 94 °C, kemudian dianil selama 20 min pada 47 °C untuk membentuk kompleks Apt-GS/siRNA.
Morfologi permukaan kompleks AS1411-GS dan AS1411-GS/siRNA diperiksa dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) (Hitachi S-4300, Jepang). Ukuran partikel dan potensi zeta dari setiap sampel diukur dengan detektor hamburan cahaya dinamis Nano-ZS Zetasizer (Malvern Instruments, UK). Diameter partikel efektif dihitung dari fungsi autokorelasi menggunakan perangkat lunak Malvern Zetasizer dengan asumsi distribusi log-normal. Konjugasi GS dan AS1411 atau siRNA ditentukan dengan mengumpulkan dan mengukur konsentrasi DNA berlabel FAM yang tidak terikat menggunakan mikroskop fluoresensi F-7000 (Olympus-IX73, Jepang). Gugus amino total (-NH2 ) pada permukaan nanogel GS ditentukan secara kuantitatif dengan menggunakan reaksi kolorimetri ninhidrin. Jumlahnya sekitar 0,642 mmol/g.
Analisis Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel dilakukan pada 100 V selama 20-30 min menggunakan gel agarosa 2% (b/v) dalam buffer TBE. Gambar diamati dengan penyinaran dengan sistem dokumentasi gel (Tanon GIS-2008, China). Dalam uji enkapsulasi Apt-GS/siRNA, kompleks telanjang siRNA, GS/siRNA, dan Apt-GS/siRNA dimasukkan ke dalam gel tanpa aditif apa pun. Dalam pengujian responsif redoks, kompleks GS/siRNA dan Apt-GS/siRNA diinkubasi dengan larutan GSH 10 mM dalam PBS selama 2 jam sebelum pengukuran.
Sitotoksisitas In Vitro
Sitotoksisitas terhadap sel adenokarsinoma A549 paru manusia dievaluasi dengan uji MTT. Secara singkat, sel A549 (1 × 10
4
sel/sumur) diunggulkan dalam pelat kultur polistiren 96-sumur dan diinkubasi selama 24 jam hingga pertemuan 70%. Setelah mengeluarkan media kultur, 100 μL media DMEM bebas serum yang mengandung nanogel (100-600 mg/mL) ditambahkan ke setiap sumur. Sel diperlakukan dengan media hanya berfungsi sebagai kelompok kontrol negatif. Setelah ko-inkubasi 24 h, 100 μL media segar dengan 20 μL larutan MTT (5 mg/mL dalam buffer PBS) ditambahkan dan dikultur selama 4 h lagi. Kemudian, larutan MTT dihilangkan dan ditambahkan 100 μL dimetil sulfoksida (DMSO). Setelah berosilasi selama 30 min dalam gelap, absorbansi masing-masing sumur diukur dengan pembaca lempeng mikro (TECAN DNA export, Swiss) pada panjang gelombang 490 nm. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Viabilitas sel relatif (%) dinyatakan sebagai persentase relatif terhadap sel kontrol yang tidak diberi perlakuan.
Internalisasi Sel
Sel-sel dikultur bersama dengan 25 μL nanogel Apt-GS dan TDO-GS berlabel FAM (2 mg/mL) selama 10 jam dalam media bebas serum pada suhu 37 °C. Setelah dicuci tiga kali dengan PBS, sel difiksasi dengan paraformaldehyde (4% dalam PBS) selama 30 menit dan kemudian diamati dengan mikroskop pemindaian laser confocal (Leica, Jerman). Untuk mengukur serapan seluler, sel diperlakukan dengan 25 μL AS1411-GS berlabel FAM dan TDO-GS (2 mg/mL) untuk suatu periode (0,5–16 h) dalam media bebas serum pada suhu 37 °C. Untuk mengevaluasi peran nukleolin dalam penyerapan seluler Apt-GS NGs, campuran Apt-GS NGs yang disiapkan dan aptamers AS1411 gratis dengan konsentrasi bervariasi (0,5, 5, dan 50 M) diinkubasi dengan sel A549 selama 8 H. Kemudian, sel ditangguhkan kembali dalam PBS sedingin es, dan sel fluoresen dengan nanogel berlabel FAM dihitung dari 10.000 sel dengan menggunakan flow cytometer EPICS XL (Beckman Coulter, USA). Analisis data dilakukan dengan perangkat lunak sitometer aliran EPICS XL, dan gerbang analitik dipilih sebagai 1% sel kontrol yang termasuk dalam wilayah positif.
Pembungkaman Gen
Kemampuan untuk membungkam gen diperiksa menggunakan kombinasi siRNA untuk luciferase dan sel yang mengekspresikan luciferase. Secara singkat, A549 yang mengekspresikan luciferase (2 × 10
5
sel/sumur) dan fibroblas NIH 3 T3 (4 × 10
5
sel/sumur) diunggulkan dalam pelat 12-sumur dan dikultur semalaman dan kemudian diperlakukan dengan 100 μL kompleks uji (80 μg/mL) yang mengandung LUC-siRNA (atau siRNA kontrol) selama 8 h. Sampel dibagi menjadi tiga kelompok:(a) hanya kompleks Apt-GS/siRNA untuk 8 h, (b) kompleks Apt-GS/siRNA untuk 8 h diikuti oleh liposom untuk 1 h lebih lanjut (dinamai sebagai A-GS/si→ Grup bibir), dan (c) ko-inkubasi kompleks Apt-GS/siRNA dan liposom selama 8 h (grup A-GS/si+Lip). Sel-sel tanpa pengobatan apapun dan yang ditransfeksi dengan luciferase plasmid pGL3 (Madison, WI, USA) sebagai kontrol. Setelah inkubasi 40 jam lebih lanjut, efisiensi knockdown gen diselidiki dengan mengukur ekspresi luciferase dalam sel menggunakan sistem uji luciferase sesuai dengan protokol pabrikan. Eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga, dan data ditampilkan sebagai rata-rata ± kesalahan standar rata-rata.
Hasil dan Diskusi
Sintesis dan Karakterisasi Kompleks GS-AS1411/siRNA
Untuk membangun pembawa siRNA penargetan kanker, nanogel gelatin/silika-AS1411 (Apt-GS) dirancang (Skema 1) menggunakan metode sol-gel [19, 20]. Gambar TEM khas (Gbr. 1) mengungkapkan bahwa GS kosong dan Apt-GS adalah struktur bola yang tersebar dengan diameter rata-rata 170-200 nm. DNA berlabel FAM digunakan untuk sintesis untuk mengkonfirmasi penggabungan AS1411 dan siRNA ke GS NGs. Jumlah aptamer terkonjugasi pada GS adalah sekitar 0,65 μmol/g, sebagaimana diukur menggunakan spektrum fluoresensi. Sementara itu, fluoresensi hijau yang intens dapat dengan mudah diamati pada gambar fluoresensi, menunjukkan integrasi aptamer AS1411 dan siRNA. Seperti yang digambarkan pada Gambar. 2, ukuran hidrodinamik dari GS telanjang, Apt-GS, dan Apt-GS/siRNA NGs (162,3 nm, 216,5 nm, dan 234.9 nm, masing-masing) secara bertahap meningkat seiring dengan prosedur fungsionalisasi karena peningkatan lapisan fungsional permukaan. Di sisi lain, potensi zeta Apt-GS kurang positif (33,9 ± 0,5 mV) dibandingkan dengan GS NGs (40,1 ± 0,5 mV) karena efek penyembunyian aptamers DNA negatif di permukaan. Setelah konjugasi lebih lanjut dengan siRNA di permukaan, potensi zeta dari Apt-GS/siRNA NGs masih bergeser secara negatif ke 24,9 mV karena gugus fosfat negatif bebas berlebih dari siRNA. Hasil ini menunjukkan penurunan toksisitas biologis karena muatan positif yang kuat dapat mengganggu protein bermuatan negatif dalam darah dan mengganggu membran sel [24].
Gambar Apt-GS (a , c ) dan nanogel Apt-GS/siRNA (b , d ). a , b gambar TEM. Bilah skala mewakili 0,5 μm. c , d Gambar fluoresen. Bilah skala mewakili 5 μm
Ukuran hidrodinamik dan potensi zeta nanogel GS, Apt-GS, dan Apt-GS/siRNA
Pemuatan dan Pelepasan siRNA
RNAi yang berhasil hanya dapat terjadi ketika siRNA dikirim dan dilepaskan dengan cepat dari pembawanya ke dalam sitoplasma [25]. Sel tumor memiliki konsentrasi GSH 7-10 kali lipat lebih tinggi daripada sel normal [26, 27]. Dalam penelitian ini, siRNA dikonjugasikan ke Apt-GS NGs aktif melalui reaksi ikatan silang disulfida. Elektroforesis gel (GE) dilakukan untuk mengevaluasi kemampuan pemuatan dan pelepasan siRNA dari kompleks Apt-GS/siRNA. Seperti yang diharapkan, sementara pDNA bebas (Gbr. 3, jalur 1-5) pindah ke posisi biasanya, kompleks Apt-GS/siRNA menunjukkan penurunan mobilitas dalam uji pergeseran elektromobilitas (Gbr. 3, jalur 10-11) menunjukkan baik pemuatan siRNA. Untuk meniru kondisi intraseluler, 10 mM GSH diperlakukan dengan kompleks selama 2 h untuk mengurangi Apt-GS/siRNA NGs. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, jalur 6-7, molekul siRNA diamati dalam gel poliakrilamida setelah perlakuan GSH, menunjukkan bahwa Apt-GS/siRNA NGs dapat melepaskan molekul siRNA fungsional secara reversibel dengan pembelahan disulfida dengan adanya glutathione. Selain itu, jumlah siRNA pada nanopartikel dianalisis dengan membandingkan jumlah total siRNA dan siRNA kontrol pada elektroforesis gel poliakrilamida 2%. Apt-GS mengenkapsulasi molekul siRNA dengan rasio 3:1∼2:1 pmol per mikrogram. Juga dicatat bahwa campuran siRNA dan Apt-GS menunjukkan retensi yang lebih lemah karena jebakan fisik siRNA negatif (Gbr. 3, jalur 8).
Analisis AGE dari pengikatan reversibel siRNA ke nanogel Apt-GS. Jalur 1-5:siRNA bebas dengan jumlah 50, 40, 30, 20, dan 10 pmol. Jalur 6 dan 7:GS/siRNA dan Apt-GS/siRNA dengan 10 mM GSH pada 2 h. Jalur 8:campuran siRNA bebas dan NG Apt-GS. Jalur 10 dan 11:Kompleks GS/siRNA dan Apt-GS/siRNA tanpa 10 mM GSH sebagai kontrol
Penargetan Sitotoksisitas dan Nukleolin
Evaluasi sitotoksisitas in vitro diselidiki dengan uji MTT dalam sel A549. Uji MTT digunakan untuk menilai sitotoksisitas nanogel yang disiapkan. SiRNA luciferase tidak beracun dipilih sebagai reporter, yang tidak memiliki efek membunuh pada sel tumor [28, 29]. Oleh karena itu, viabilitas sel mewakili biokompatibilitas pembawa. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, proliferasi sel tidak terlalu dipengaruhi oleh GS, Apt-Apt, dan Apt-Apt/siRNA pada konsentrasi kelompok 100–600 μg/mL (viabilitas sel> 80%) dan sitotoksisitas muncul sesuai dosis -bergantung. Dibandingkan dengan GS NG telanjang, nanogel yang dimodifikasi AS1411 memiliki sedikit penurunan viabilitas sel karena penghambatan pensinyalan NF-kB [27, 30] dan penghancuran membran organel [16]. Biokompatibilitas jinak dari nanogel Apt-GS membuatnya cocok sebagai pembawa siRNA in vivo.
Viabilitas sel sel A549 dengan nanogel GS, Apt-GS, dan Apt-GS/siRNA dari berbagai konsentrasi ditentukan oleh uji MTT
Untuk menilai penargetan Apt-GS dalam sel tumor in vitro, kami menginkubasi sel A549 dan fibroblas 3T3 dengan jumlah Apt-GS berlabel FAM yang sama atau mengontrol TDO-GS (GS didekorasi dengan oligonukleotida kontrol). Fluoresensi tingkat rendah dapat diamati pada sel 3T3 atau ketika sel diperlakukan dengan kontrol TDO-GS (Gbr. 5b, c). Sebaliknya, fluoresensi hijau yang dipancarkan oleh aptamer AS1411 secara nyata ditingkatkan dalam sel kanker A549 (Gbr. 5a), menunjukkan bahwa Apt-GS secara khusus terakumulasi dalam sel tumor karena pengenalan aptamer AS1411 yang ditargetkan nukleolin. Dalam analisis kuantitatif dengan flow cytometry (Gbr. 6), Apt-GS NGs menunjukkan intensitas fluoresensi yang bergantung pada waktu di kedua jenis sel. Dari 0,5 hingga 16 h intensitas fluoresensi internalisasi Apt-GS dalam sel A549 dan sel 3T3 masing-masing meningkat 13 dan 2 kali. Adapun rasio sel yang mengandung NG, itu meningkat pesat dalam 30 menit pertama dan tampaknya kemungkinan saturasi maksimal pada 8 jam di A549,96% dari sel A549 telah dipasang atau diambil nanogel dalam 16 jam, sementara hanya 52% dari sel 3T3 diamati. Untuk mengevaluasi peran nukleolin dalam penyerapan seluler nanogel, campuran Apt-GS NG yang disiapkan dan aptamers AS1411 gratis dengan konsentrasi bervariasi (0,5, 5, dan 50 μM) diinkubasi dengan sel A549 selama 8 jam. Intensitas fluoresensi dan persentase sel yang mengandung nanogel masing-masing menurun 50% dan 30%, ketika menggunakan aptamer AS1411 gratis untuk bersaing dengan Apt-GS NGs ke nukleolin yang diekspresikan pada membran sel, menunjukkan endositosis yang dimediasi reseptor yang diinduksi nukleolin ( Gambar 6c). Data ini menunjukkan bahwa Apt-GS NG menunjukkan akumulasi yang lebih tinggi pada sel kanker A549 melalui internalisasi yang dimediasi nukleolin.
a –c Serapan sel FAM-siRNA disampaikan oleh nanogel Apt-GS dan TDO-GS. Gambar diambil dengan CLSM. Sinyal hijau:FAM. Bilah skala adalah 10 μm
Analisis aliran cytometry (FCMS) dari serapan sel nanogel Apt-GS dan TDO-GS berlabel FAM dalam tipe sel yang berbeda. Sisipkan:profil FACS, a , b kurva merah, hijau, biru, ungu, aqua, dan kuning menunjukkan waktu inkubasi 0,5-16 h; c kurva merah, hijau, biru, dan ungu berarti konsentrasi AS1411 dari 0 hingga 16 μM
Interferensi RNA
Dilaporkan bahwa penggabungan deoksinukleotida ke dalam siRNA dapat meningkatkan stabilitas sense strand dan menjaga efikasi RNAi 40% [2, 3]. Untuk mengevaluasi efisiensi knockdown dari pembawa siRNA uji, kami menggunakan sistem gen reporter luciferase yang diganti ribonukleotida di kedua sel. Efisiensi gen knockdown (KD) siRNA dinilai melalui aktivitas luciferase setelah 48 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7a, Apt-GS/siRNA meningkatkan efisiensi knockdown gen 4,6 kali lipat dari sel A549 dibandingkan dengan 6% dari sel 3T3 normal, menunjukkan selektivitas sel yang baik. Ini menunjukkan bahwa modifikasi aptamer AS1411 meningkatkan efisiensi transfeksi dengan menghasilkan efek penargetan. Liposom kationik telah terbukti membantu pengiriman kargo dan melarikan diri dari lisosom [31]. Selain itu, penambahan liposom berikutnya (A/si-GS →Grup bibir) tidak membantu meningkatkan aktivitas pembungkaman gen yang dimediasi siRNA (30,4%) meskipun ada gangguan endosom, menyimpulkan pelepasan siRNA di lingkungan intraseluler glutathione (GSH) oleh pembelahan disulfida . Selain itu, co-transfeksi liposom dan Apt-GS/siRNA (Grup A/si-GS + Lip) sedikit meningkatkan efisiensi knockdown ekspresi luciferase (41,6%) di A549 meskipun lisosom bantuan liposom lolos, sesuai dengan laporan sebelumnya [27 , 30]. Namun, sel A549 memiliki aktivitas pembungkaman gen 2,7 kali lipat dan 1,4 kali lipat untuk grup A/si-GS→Lip dan untuk A/si-GS+Lip, masing-masing, dibandingkan dengan sel 3T3, menyimpulkan penurunan selektivitas sel.
Efek pembungkaman in vitro siRNA anti-luciferase yang diformulasikan dalam nanogel Apt-GS dengan perlakuan berbeda (a ) dan konsentrasi kompleks Apt-GS/siRNA (A-GS/si) pada pembungkaman gen (b )
Selanjutnya, kami memeriksa efek konsentrasi nanogel pada RNAi. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 7b, efisiensi interferensi gen mencapai maksimum pada konsentrasi kompleks 80 μg/ml. Penurunan efisiensi KD pada konsentrasi 120 μg/ml mungkin karena peningkatan sitotoksisitas dari aptamer. Juga dicatat bahwa penambahan liposom agen pelarian endosom dapat meningkatkan efisiensi interferensi RNA pada konsentrasi rendah nanogel Apt-GS/siRNA (40 μg/ml dan 80 μg/ml) tetapi tidak menyebabkan pengurangan pada konsentrasi tinggi (120 g/ml). Dengan demikian, diyakini bahwa Apt-GS dapat berhasil mengirimkan siRNA ke sel tumor dan selanjutnya menghasilkan RNAi spesifik.
Kesimpulan
Stabilitas dan pengiriman siRNA spesifik jaringan tetap menjadi hambatan terbesar untuk terapi RNAi. Di sini, siRNA tersubstitusi deoksinukleotida digunakan untuk meningkatkan stabilitas siRNA, dan inti GS selanjutnya dilapisi dengan aptamer AS1411 untuk penargetan tumor dan penghubung disulfida untuk pengiriman siRNA yang responsif redoks. Kendaraan memiliki struktur bola dengan ukuran sekitar 200 nm dan memiliki muatan positif di permukaan. Nanogel Apt-GS / siRNA yang disiapkan ini dapat melindungi kargo dan menunjukkan pelepasan siRNA yang dipercepat di bawah penambahan DTT dengan pembelahan disulfida. Selain itu, dengan penargetan aptamer AS1411, nanogel Apt-GS baru Apt-GS dapat secara efektif mengirimkan dan melepaskan lebih banyak muatan ke sitoplasma, yang mengarah ke peningkatan signifikan (~ 5 kali lipat in vitro dalam aktivitas hening dalam sel A549 yang diekspresikan secara berlebihan oleh nukleolin). Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa pengiriman siRNA tersubstitusi deoksinukleotida adalah strategi inovatif dan nanogel cerdas penargetan tumor yang responsif terhadap redoks ini menjanjikan pengiriman siRNA dan terapi tumor.
Ketersediaan Data dan Materi
Kumpulan data yang mendukung kesimpulan artikel ini disertakan dalam artikel.
