Nanogel Gelatin/Silika Respons Redoks Fungsional dengan Aptamer AS1411 untuk Pengiriman siRNA Terpadu

Abstrak

Interferensi RNA (RNAi) menawarkan spesialitas yang tak tertandingi untuk penggenenan gen, namun stabilitas siRNA dan pengiriman jaringan yang tepat masih menjadi faktor pembatas. Kami merancang sistem dual‑respons dengan mengonjugasi nanogel berbasis gelatin (GS) dengan aptamer targeting nukleolin AS1411 dan siRNA yang disubstitusi deoksinukleotida melalui linker disulfida. Desain ini memungkinkan docking sementara siRNA dan memicu pelupusannya di dalam mikroenvironment tumor yang kaya glutation. Dalam sel A549 positif nukleolin, nanogel Apt‑GS/siRNA terurai pada paparan GSH seluler, mengirimkan siRNA secara efisien ke sitosol dan mencapai penggenenan luciferase yang kuat. Uji sitotoksisitas mengonfirmasi biocompatibilitas pada konsentrasi yang relevan secara terapeutik. Nanogel targeting tumor yang respons redoks ini mewakili platform yang menjanjikan untuk terapi kanker berbasis siRNA.

Pendahuluan

RNAi memanfaatkan penggenenan gen yang spesifik urutan, memosisikannya sebagai kandidat terdepan untuk mengobati gangguan genetik, kanker, dan penyakit infeksi karena presisi dan toksisitas rendahnya. Dibandingkan dengan oligonukleotida antisense, siRNA kecil (siRNA) menunjukkan resistensi nuklease yang yang ditingkatkan. Modifikasi kimia—seperti substitusi ribonukleotida dengan deoksinukleotida—telah menunjukkan meningkatkan stabilitas siRNA sambil mempertahankan sekitar 40 % aktivitas RNAi. Meskipun kemajuan ini, pengiriman yang efisien dan spesifik jaringan tetap menjadi tantangan yang menakutkan.

Pengempa nanopartikel dapat melindungi siRNA dari degradasi dan memfasilitasi pengiriman yang di‑target. Nukleolin, yang overexpressed pada permukaan banyak sel kanker yang proliferasi, adalah target yang menarik untuk penyerapan spesifik tumor. Aptamer DNA G‑kuadrupleks AS1411 (AGRO100) terikat nukleolin dengan affinitas tinggi dan telah memasuki uji klinis Fase II sebagai agen antikanker. Studi sebelumnya telah berhasil mengonjugasi AS1411 ke berbagai nanomaterial, mencapai penyerapan selektif sel kanker. Gelatin, protein yang dapat biodegradasi, telah digunakan untuk enkapsulasi siRNA karena biocompatibilitas dan propersi gelasi yang luar biasa. Kami sebelumnya telah mengembangkan nanogel gelatin bersilang siloksan (GS NG) dengan ukuran dan muatan permukaan yang terkontrol, menunjukkan transfeksi yang efisien in vitro dan in vivo.

Mengatasi halangan seluler—terutama escape endosom dan pelupusan siRNA—adalah kritis. Linker respons stimulus, seperti ikatan disulfida yang terputus dalam lingkungan glutation (GSH) tinggi dari sel tumor, telah menarik minat yang signifikan. Pengempa yang bersilang disulfida dapat memicu pelupusan beban terapeutis secara spesifik dalam sel ganas.

Di sini kami menyajikan sistem nanogel hibrida yang menggabungkan GS NG, targeting aptamer AS1411, dan linker disulfida untuk pelupusan siRNA yang dipicu redoks. Kami mengevaluasi kemampuannya untuk meningkatkan penyerapan seluler, mencapai penggenenan gen spesifik tumor, dan mempertahankan sitotoksisitas rendah.

Metode

Bahan

Gelatin (Bloom 240–270, pH 4,5–5,5) diperoleh dari BBI Company Inc. (USA). SPDP, GPSM, dan APTMS dibeli dari Sigma‑Aldrich (USA). MTT, DMEM, FBS, penicilin, dan streptobisin diperoleh dari Hyclone (USA). AS1411, 5′‑FAM‑AS1411, dan kontrol negatif TDO disintesis oleh Sangon Biotech (China). Deoksinukleotida‑substitusi Luc‑siRNA (rantai sensor: 5′‑SH‑(CH₂)₆‑CTTACGCTGAGTACTTCGATT‑3′; rantai antisense: 3′‑TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU‑5′; antisense berlabel FAM) difurnasi HPLC oleh Gene Pharma (China). Lipofectamine 2000, plasmid luciferase pGL3, dan sistem uji luciferase dari Promega (USA). Sel adenocarcinoma paru A549 dan fibroblast NIH 3T3 disediakan oleh Pusat Teknik Biomedis Universitas Xiamen (China). Semua reagen kelas analitis; kaca lab dibersihkan dengan baik dan dicuci dengan air deion.

Urutan DNA yang digunakan:

Aptamer AS1411: 5′‑GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT‑3′
Kontrol TDO: 5′‑CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT‑3′

Persiapan dan Karakterisasi Kompleks Apt‑GS/siRNA

Nanogel GS disintesis melalui proses sol‑gel: GPSM (0,2 g) ditambahkan ke dalam 20 mL gelatin 0,75 % dalam HCl (pH 3) pada 60 °C selama 30 menit, diikuti oleh APTMS (0,08 g) dan inkubasi 24 jam. NG GS yang dihasilkan dipurnikan melalui sentrifugasi (14.000 rpm, 25 °C, 12 menit) tiga kali. Selanjutnya, NG GS (0,5 mL, 5 g L⁻¹ PBS) bereaksi dengan SPDP (25 µL, 20 mM DMSO) selama 60 menit pada suhu kamar, kemudian diinkubasi dengan AS1411 thiolated (1 mg mL⁻¹) selama 12 jam. NG Apt‑GS dipulihkan melalui sentrifugasi dan dicuci dengan air deion tiga kali. Suspensi NG Apt‑GS yang diaktifkan SPDP (80 mL, 5 mg mL⁻¹) dicampur dengan rantai sensor siRNA selama semalam pada 4 °C. Setelah purnifikasi, rantai antisense di‑anneal dengan memanaskan ke 94 °C selama 5 menit dan pendinginan ke 47 °C selama 20 menit, membentuk kompleks Apt‑GS/siRNA.

Mikroskopi transmisi elektron (TEM, Hitachi S‑4300) mengungkapkan partikel bola. Pengocokan cahaya dinamis (Malvern Zetasizer) mengukur diameter hidrodinamik dan potensial zeta. Efisiensi konjugasi diukur melalui fluoresensi DNA berlabel FAM dan uji ninhydrin untuk grup amino permukaan (≈0,642 mmol g⁻¹).

Analisis Elektroforesis Gel

Elektroforesis dilakukan pada 100 V selama 20–30 menit pada agarosa 2 % dalam buffer TBE. Gambar ditangkap dengan sistem dokumentasi gel. Untuk studi pelupusan, kompleks GS/siRNA dan Apt‑GS/siRNA diinkubasi dengan 10 mM GSH (PBS) selama 2 jam sebelum dimuat.

Uji Sitotoksisitas In Vitro

Uji MTT dilakukan pada sel A549 (1 × 10⁴ sel / lubang) pada papan 96‑lubang. Setelah 24 jam untuk mencapai 70 % konfluensi, sel di‑treat dengan nanogel (100–600 µg mL⁻¹) dalam DMEM bebas serum selama 24 jam, diikuti oleh inkubasi 4 jam dengan MTT (5 mg mL⁻¹). DMSO ditambahkan, dan absorbansi dibaca pada 490 nm. Eksperimen dilakukan tiga kali; viabilitas (%) dihitung relatif terhadap kontrol tidak di‑treat.

Penyerapan Sel

Sel A549 dan 3T3 di‑inkubasi dengan 25 µL Apt‑GS atau TDO‑GS berlabel FAM (2 mg mL⁻¹) selama 10 jam dalam medium bebas serum pada 37 °C. Sel diperapasi dengan paraformaldehida 4 % dan di‑image dengan mikroskopi laser konfokal (CLSM). Untuk sitometri aliran, sel di‑treat dengan nanogel berlabel FAM (2 mg mL⁻¹) selama 0,5–16 jam, kemudian dicuci, direkonsentrasi dalam PBS dingin, dan di‑analisis pada sitrometer aliran EPICS XL. Penghambatan penyerapan dievaluasi dengan pre‑inkubasi sel dengan AS1411 bebas (0,5, 5, 50 µM) selama 8 jam sebelum menambahkan nanogel.

Penggenenan Gen

Sel A549 (2 × 10⁵ sel / lubang) dan NIH 3T3 (4 × 10⁵ sel / lubang) ditransfeksi dengan kompleks Apt‑GS/siRNA (80 µg mL⁻¹) selama 8 jam. Tiga regime perlakuan dievaluasi: (a) Apt‑GS/siRNA saja; (b) Apt‑GS/siRNA diikuti oleh liposom (A‑GS/si→Lip); (c) Apt‑GS/siRNA bersamaan dengan liposom (A‑GS/si+Lip). Setelah tambahan 40 jam, aktivitas luciferase diukur dengan sistem uji luciferase. Data disajikan sebagai rata‑rata ± SEM (tiga kali).

Hasil dan Pembahasan

Sintesis dan Karakterisasi Kompleks GS‑AS1411/siRNA

Gambar TEM (Gambar 1) mengonfirmasi bahwa baik nanogel GS kosong maupun Apt‑GS membentuk partikel bola seragam dengan diameter 170–200 nm. Image fluoresensi menunjukkan konjugasi AS1411 dan siRNA yang berhasil. Kuantisasi menunjukkan sekitar 0,65 µmol g⁻¹ aptamer pada GS. Ukuran hidrodinamik meningkat dari 162,3 nm (GS) menjadi 216,5 nm (Apt‑GS) dan 234,9 nm (Apt‑GS/siRNA), mencerminkan fungsionalisasi permukaan. Potensial zeta bergeser dari +40,1 mV (GS) menjadi +33,9 mV (Apt‑GS) dan –24,9 mV (Apt‑GS/siRNA), mengindikasikan penurunan muatan permukaan yang diharapkan akan mengurangi ikatan protein non‑spesifik dan sitotoksisitas.

Muatan dan Pelupusan siRNA

Elektroforesis gel menunjukkan muatan siRNA yang efisien pada kompleks Apt‑GS/siRNA, seperti yang ditunjukkan oleh mobilitas yang berkurang (jalur 10–11). Setelah diinkubasi dengan 10 mM GSH, siRNA dilepaskan dalam 2 jam (jalur 6–7), mengonfirmasi terurai yang dipicu redoks. Kapasitas muatan diperkirakan pada 3:1 hingga 2:1 pmol siRNA per µg nanogel. Penjebalan fisik (pencampuran siRNA bebas dengan GS) menunjukkan retensi yang lebih lemah, menekankan keuntungan dari penitipan kovalen.

Sitotoksisitas dan Targeting Nukleolin

Uji MTT (Gambar 4) mengungkapkan >80 % viabilitas untuk GS, Apt‑GS, dan Apt‑GS/siRNA pada 100–600 µg mL⁻¹, menunjukkan biocompatibilitas yang luar biasa. Viabilitas yang sedikit berkurang pada Apt‑GS disebabkan oleh inhibisi NF‑κB yang diinduksi AS1411 dan gangguan organel. Mikroskopi fluoresensi dan sitometri aliran (Gambar 5 & 6) mengonfirmasi penyerapan selektif: Apt‑GS menunjukkan penyerapan 96 % pada sel A549 versus 52 % pada fibroblast 3T3. Kompetisi dengan AS1411 bebas mengurangi penyerapan sebesar 50 % (fluoresensi) dan 30 % (persentase sel positif), mengonfirmasi endositosis yang diinduksi nukleolin.

Interferensi RNA

Uji penggenenan luciferase (Gambar 7a) menunjukkan penurunan 4,6 kali dalam sel A549 dengan Apt‑GS/siRNA, dibandingkan hanya 6 % pada sel NIH 3T3, menekankan spesifikitas tumor. Penambahan liposom (A‑GS/si→Lip) tidak meningkatkan penggenenan secara signifikan (30,4 %) relatif terhadap Apt‑GS/siRNA saja, sedangkan perlakuan liposom bersamaan (A‑GS/si+Lip) meningkatkan penggenenan menjadi 41,6 %. Penggenenan tertinggi (≈ 2,7 kali di atas 3T3) dicapai pada 80 µg mL⁻¹, dengan efisiensi yang berkurang pada 120 µg mL⁻¹ kemungkinan karena sitotoksisitas yang meningkat.

Kesimpulan

Kami telah merancang platform nanogel respons redoks dan targeting nukleolin yang melindungi siRNA yang dimodifikasi deoksinukleotida dan melepaskannya secara spesifik dalam sitosol tumor kaya GSH. Nanogel Apt‑GS/siRNA sekitar 200 nm, bermuatan positif, mencapai penggenenan gen spesifik tumor yang kuat (perbaikan sekitar 5 kali dalam sel A549) sambil mempertahankan sitotoksisitas rendah. Temuan ini memvalidasi strategi penggabungan kimia linker disulfida dengan targeting aptamer untuk pengiriman siRNA yang efisien dan mewakili langkah yang menjanjikan menuju terapi RNAi klinis.