Pengiriman siRNA Terarah ke Kanker Ovarium dengan Nanokompleks Grafit Oksida/PEI Fungsional Folat

Abstrak

Terapi gen muncul sebagai metode yang valid untuk pengobatan kanker ovarium, termasuk RNA interferensi kecil (siRNA). Meskipun begitu, sistem pengiriman gen yang efisien dan ditargetkan sangat menghambat perkembangan terapi gen. Dalam studi ini, kami menyintesis vektor gen baru PEG-GO-PEI-FA dengan grafit oksida (GO) yang difungsikan, di mana asam folat (FA) dapat secara spesifik berikatan dengan reseptor folat (FR), yang ekspresinya berlebihan pada kanker ovarium. Karakterisasi nanokompleks dievaluasi dengan pencaharan cahaya dinamis (DLS), mikroskopi gaya atom (AFM), dan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR). Kemampuan kondensasi siRNA dan stabilitas dinilai dengan elektroforesis gel agarosa. Efisiensi penyerapan seluler dan kemampuan pelarian lisosom pada sel kanker ovarium diteliti dengan mikroskopi laser skanning konfokal. Selain itu, biosafety seluler dan toleransi hemmian siRNA dievaluasi dengan uji CCK-8. Ukuran nanokompleks PEG-GO-PEI-FA adalah 216,1 ± 2,457 nm, yang menunjukkan sitotoksitas ringan pada sel kanker ovarium. Dengan efisiensi penyerapan yang tinggi, PEG-GO-PEI-FA dapat melarikan diri dari lisosom dengan cepat dan melepaskan gen. Selain itu, PEG-GO-PEI-FA/siRNA dapat secara efektif menghambat pertumbuhan sel kanker ovarium. Secara keseluruhan, PEG-GO-PEI-FA/siRNA dapat menawarkan strategi yang promising untuk pengiriman siRNA dalam pengobatan karkinoma ovarium positif FR atau tumor serupa.

Pendahuluan

Kanker ovarium adalah penyebab kematian ginekologis terdepan di dunia dan biasanya terkait dengan hasil klinis yang buruk karena kesulitan diagnosis dan pengobatan dini [1,2,3]. Sayangnya, agen kemoterapi konvensional menunjukkan keterbatasan inherent seperti distribusi tidak spesifik, bioavailabilitas rendah, pembersihan darah yang cepat, dan kesulitan larut dalam lingkungan fisiologis [4]. Selama beberapa dekade terakhir, terapi gen telah diteliti sebagai pendekatan potensial untuk pengobatan berbagai gangguan genetik, termasuk kanker [5,6,7,8]. Namun, kurangnya vektor pengiriman gen yang aman, sangat efisien, dan selektif telah menghambat kemajuannya menuju utilitas klinis. Saat ini, ada dua kategori vektor gen: virus dan non-virus. Meskipun vektor virus telah menunjukkan efisiensi transfeksi yang tinggi, beberapa kelemahan membatasi aplikasi klinisnya, misalnya, reaksi imun inflamasi yang parah dan risiko rekombinasi dengan virus tipe liar [9, 10]. Di sisi lain, vektor non-virus memiliki kapasitas pengiriman yang luas, imunogenitas rendah, dan fleksibilitas struktural, menjadikannya alternatif yang baik untuk vektor virus [11,12,13]. Dengan perkembangan cepat nanoteknologi, banyak nanopartikel telah dieksplorasi untuk potensi penggunaan sebagai vektor pengiriman gen [14, 15]. Di sini, karya ini telah merancang vektor non-virus baru PEG-GO-PEI-FA yang dapat dikirim secara efisien ke jaringan tumor.

Grafit oksida (GO) adalah turunan grafit yang dihasilkan oleh oksidasi multi-tahap, ultrasonik, dan pemurnian grafit [16]. Permukaan GO mengandung grup epoksi, hidroksil, dan karboksil [17]. Grup fungsional oksigen pada permukaannya memberikan GO biokompatibilitas yang sangat baik yang memungkinkannya membentuk suspensi stabil dalam air dan pelarut organik, memfasilitasi modifikasi kimia dan fungsionalisasi [18, 19]. Jadi, GO banyak digunakan untuk terapi fototermal kanker, pengiriman obat dan gen, dan biosensor [20,21,22]. Polietilena glikol (PEG) adalah bahan yang aman, non-toksik, dan terdegradasi biologis; ia telah disetujui oleh Badan Pangan dan Obat AS sebagai pembawa obat hidrofilik [23]. Fungsionalisasi GO dengan PEG dapat meningkatkan stabilitas di bawah kondisi fisiologis, memperpanjang siklus waktu nanomaterial GO dalam tubuh, dan meningkatkan farmakokinetika nanomaterial GO untuk penargetan tumor yang lebih baik [24, 25]. Polietilenaimina (PEI) telah menjadi standar emas vektor non-virus karena efisiensi transfeksi yang tinggi pada berbagai baris sel [26]. Namun, PEI menunjukkan sitotoksitas parah dan biokompatibilitas buruk, sehingga membatasi aplikasi klinisnya. Dalam studi ini, kami mengamati penurunan signifikan dalam sitotoksitas ketika PEI diangkat ke permukaan GO. Reseptor folat ekspresi berlebihan pada permukaan berbagai sel kanker, terutama pada sel kanker ovarium baik sebelum maupun setelah kemoterapi [27]. Untuk pengiriman gen yang ditargetkan, molekul asam folat dikovalen dengan GO untuk menargetkan reseptor folat.

Secara keseluruhan, tujuan utama studi saat ini adalah untuk mengeksplorasi sistem pengiriman gen berbasis GO yang ditargetkan baru untuk meningkatkan utilitas terapi gen berbasis siRNA untuk kanker ovarium. Vektor positif PEG-GO-PEI-FA yang dihasilkan dapat dimuat dengan siRNA untuk pengiriman gen. Sintesis yang berhasil, karakterisasi, internalisasi seluler yang efektif, dan efek anticancer in vitro dianalisis menggunakan berbagai teknik. Selain itu, keamanan sistem ini juga dievaluasi in vitro.

Bahan dan Metode

Bahan

Grafit oksida diperoleh dari Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, China). Asam folat (FA), N-hidroxisuksinimida (NHS), dan fluoresenin isotiocianat (FITC) dibeli dari Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, China). PEI terurai 25K, PEG (MW = 2000), agarosa, dan 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil karbodiimida hidroklorida (EDC·HCL) dibeli dari Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Larutan penyangga fosfat (PBS), larutan penyangga fosfat Dulbecco (DPBS), dan semua kimia lainnya dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Semua kimia lainnya adalah kelas reagen. Medium RPMI-1640 (Gibco), serum fetal sapi (FBS) (Gibco), tripsin (Gibco), dan larutan TAE 20× dibeli dari Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China). Kit perhitungan sel 8 (CCK-8) dibeli dari Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, China). LysoTrackerRed, paraformaldehida 4%, 4′-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), dan reagen transaksi Lipofectamine 2000 dibeli dari Invitrogen Co. Ltd. (China). Sonde fluorescensi Dil (Cat number: C1036) dibeli dari Beyotime Co. Ltd. RNA interferensi pendek anti-PLK1 (PLK1-homo-581) (siRNA) disintesis oleh Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Persiapan PEG-GO-PEI-FA

Sintesis PEG-GO-PEI-FA adalah sesuai dengan strategi yang ditunjukkan pada Gambar S2 (A). Pertama, 10 mL suspensi air GO (1000 μg/mL) secara terus-menerus di-sonikasi dalam bak pada 50 W selama 2 jam. Kemudian, 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) dan NHC (5000 μg/mL) ditambahkan dan secara sesekali di-sonikasi selama 30 menit pada 100 W, diikuti dengan penambahan PEG (10 mg) di-sonikasi selama 30 menit dan diaduk pada pengaduk magnetik selama 6 jam pada 0 °C. Untuk menghilangkan reagen yang tidak bereaksi dan mendapatkan larutan GO-PEG, campuran dialisis selama 24 jam dalam air tisu dengan membran dialisis (MWCO, 3500 Da). Kemudian, larutan GO-PEG di-sonikasi selama 30 menit, 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) dan NHC (5000 μg/mL) ditambahkan dan di-sonikasi selama 30 menit lagi, diikuti dengan penambahan PEI 25K (5000 μg/mL) 2 mL. Campuran di-sonikasi selama 30 menit dan diaduk selama 6 jam pada 0 °C. Selanjutnya, untuk mendapatkan PEG-GO-PEI, campuran dialisis selama 24 jam dalam air tisu dengan membran dialisis (MWCO, 3500 Da) lagi. Larutan PEG-GO-PEI di-sonikasi selama 60 menit, 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) dan NHC (5000 μg/mL) ditambahkan dan di-sonikasi selama 30 menit lagi, diikuti dengan penambahan 10 mg FA ke dalam larutan. Larutan di-sonikasi selama 30 menit dan diaduk selama 12 jam pada 0 °C dan dialisis selama 48 jam untuk mendapatkan PEG-GO-PEI-FA sesuai dengan prosedur di atas. Larutan nanokompleks dikeringkan dengan free dryer vakum (Biosafer-10D).

Karakterisasi

Potensi zeta permukaan dan ukuran partikel rata-rata nanokompleks dalam larutan air diukur dengan pencaharan cahaya dinamis (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, UK). Morfologi nanokompleks diamati menggunakan mikroskop gaya atom dalam atmosfer (AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Jerman). Spektra spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) diperoleh dengan spektrograf Thermo Nicolet 6700 FTIR, menggunakan tablet KBr pada rentang 400–4000 cm⁻¹. Spektrum penyerapan UV-Vis nanokompleks diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (UV, EV300, AS). Raman nanokompleks diukur dengan mikroskop Raman dispersif (Senterra R200-L, Jerman) dengan panjang gelombang excitasi 532 nm.

Uji Biosafety In Vitro

Sel kanker ovarium manusia SKOV3 dibeli dari Keygen (China). Sel dipertahankan dalam medium RPMI-1640, dilengkapi dengan 10% FBS, 100 U/mL penicilin, 100 g/mL streptomisin, dan dikultur pada 37 °C di bawah atmosfer yang lembab yang mengandung 5% CO₂. Dalam studi ini, sitotoksitas bahan dianalisis pada sel SKOV3 dengan uji CCK-8. Secara singkat, sel ditanam pada plate 96-lubang dengan kepadatan 6 × 10³ sel/lubang dalam 100 μL medium 1640 yang mengandung 10% FBS dan kemudian diinkubasi pada 37 °C selama 12 jam di bawah atmosfer yang lembab yang mengandung 5% CO₂. Kemudian, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI, dan PEG-GO-PEI-FA ditambahkan pada konsentrasi akhir bervariasi dari 10 hingga 1000 μg/mL dan diinkubasi dengan sel selama 12 jam tambahan. Selain itu, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI, dan PEG-GO-PEI-FA diinkubasi dengan waktu yang berbeda dari 4 hingga 24 jam pada konsentrasi 100 μg/m5. Selanjutnya, 10 μL CCK-8 ditambahkan ke setiap lubang dan diinkubasi selama 3 jam tambahan pada 37 °C. Setelah itu, absorbansi pada 450 nm diukur pada pembaca mikroplate. Setiap eksperimen kelompok diulang tiga kali. Kelangsungan sel relatif (%) yang terkait dengan sel kontrol yang dikultur dalam medium dihitung sebagai (absorbansi sampel − absorbansi kosong)/(absorbansi kontrol − absorbansi kosong) × 100%.

Uji Penahanan Gel Agarosa

Larutan penyangga TAE 20× dicairkan dengan air yang telah dirawat DEPC untuk membuat larutan agarosa 1%. Kemudian, larutan dipanaskan selama 5 menit dengan oven microwave untuk mencairkan agarosa sepenuhnya. Ketika suhu larutan agarosa turun ke 55 °C, larutan etidium bromida (EB, 0,5 μg/mL) dalam rasio volume 10.000:1 ditambahkan dan dicampur secara merata, kemudian larutan agarosa didinginkan untuk membentuk gel agarosa. Campuran PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA, dan siRNA pada berbagai rasio bobot ditambahkan ke dalam lubang. Gel dijalankan pada 110 V dan 40 mA selama sekitar 60 menit, kemudian diamati dan dianalisis dengan pengitra ultraviolet.

Studi Penyerapan Seluler PEG-GO-PEI-FA

Untuk menyelidiki penyerapan sel, nanokompleks diberi label FITC sesuai dengan metode yang sebelumnya dijelaskan dengan sedikit modifikasi [28]. Secara singkat, larutan nanokompleks (sekitar 1 mg/mL, 2,0 mL) dicampur dengan 0,2 mL FITC (26 mM) yang dilarutkan dalam DMSO dan kemudian diaduk selama semalaman pada suhu ruang. Campuran yang dihasilkan dialisis melalui membran 5000 MWCO untuk menghilangkan FITC yang tidak diberi label dan kemudian diobat dengan pendingin. Sel ditanam pada plate 6-lubang (yang berisi coverslip) dengan kepadatan 2 × 10⁵ sel/lubang dalam 2 mL medium 1640 yang mengandung 10% FBS dan kemudian diinkubasi pada 37 °C selama 12 jam di dalam inkubator kultur sel. Kemudian, medium di setiap lubang diganti dengan medium 1640 bebas serum. Selanjutnya, sel dirawat dengan berbagai nanokompleks/FITC. Sel yang dirawat tanpa nanokompleks adalah kelompok kontrol, dan sel yang dirawat dengan PEI 25 K adalah kelompok kontrol paralel. Setelah diinkubasi selama 4 jam pada 37 °C di dalam atmosfer yang lembab yang mengandung 5% CO₂, cairan plate kultur dikeluarkan, sel dicuci dua kali dengan DPBS dingin (pH = 7,4), kemudian 20 μL DAPI dan 5 μL Dil (penyeberi sel) ditambahkan ke setiap lubang dan diinkubasi selama 20 menit pada 37 °C dalam kegelapan. Selanjutnya, DAPI dan Dil dari medium kultur dikeluarkan dan dicuci dua kali dengan DPBS dingin (pH = 7,4), dan coverslip sel dieluarkan dan ditempel pada gelas objek dengan Permount TM Mounting Medium. Kemudian, sinyal fluoresensi slide sel diamati dengan Mikroskopi Laser Skanning Konfokal (CLSM) dan dianalisis penyerapan sel nanokompleks.

Pelarian Endosom dan Penetrasi ke Nukleus

Untuk memvisualisasikan distribusi seluler, pelarian endosom, dan penetrasi nanokompleks, sel SKOV3 ditanam pada plate 12-lubang (yang berisi coverslip) dengan kepadatan 1 × 10⁵ sel/lubang dalam 2 mL medium 1640 yang mengandung 10% FBS dan kemudian diinkubasi selama 12 jam (37 °C, 5% CO₂). Kemudian, medium di setiap lubang diganti dengan 1 mL/lubang medium 1640 bebas serum. Selanjutnya, berbagai nanokompleks (100 μg/mL) yang diberi label FITC ditambahkan pada plate 12-lubang untuk 1 mL/lubang. Setelah 6 jam, cairan dikeluarkan, sel dicuci dua kali dengan DPBS dingin (pH = 7,4), dan plate 12-lubang ditambahkan LysoTracker Red (5 μg/mL) untuk 50 μL/lubang. Setelah diinkubasi selama 15 menit pada 37 °C di dalam atmosfer yang lembab yang mengandung 5% CO₂, cairan plate 12-lubang dikeluarkan, sel dicuci dua kali dengan DPBS dingin (pH = 7,4), kemudian 20 μL DAPI ditambahkan ke setiap lubang dan diinkubasi selama 20 menit pada 4 °C dalam kegelapan. Selanjutnya, cairan DAPI dikeluarkan dan dicuci dua kali dengan DPBS dingin (pH = 7,4). Kemudian, dengan paraformaldehida 4% fixed 15 menit pada suhu ruang, dan coverslip dieluarkan dan ditempel pada gelas objek dengan Permount TM Mounting Medium. Sinyal fluoresensi slide diamati dengan mikroskopi laser skanning konfokal dan dianalisis pelarian lisosom dan penetrasi ke nukleus nanokompleks [29].

Analisis Inhibisi Sel

Kami menganalisis efek inhibisi sel PEG-GO-PEI/siRNA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA menggunakan uji CCK-8. Secara singkat, sel ditanam pada plate 96-lubang dengan kepadatan 6 × 10³ sel/lubang dalam 100 μL medium 1640 yang mengandung 10% FBS dan kemudian diinkubasi pada 37 °C selama 12 jam di dalam atmosfer yang lembab yang mengandung 5% CO₂. Kemudian, PEG-GO-PEI dan PEG-GO-PEI-FA ditambahkan pada konsentrasi akhir bervariasi dari 10 hingga 500 μg/mL dan diinkubasi dengan sel selama 12 dan 24 jam tambahan. Kemudian, PEG-GO-PEI/siRNA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA diinkubasi dengan sel dari 4 hingga 48 jam pada konsentrasi 100 μg/mL. siRNA ditransfeksi dengan Lipofectamine 2000 dan tidak diobati sebagai kelompok kontrol. Selanjutnya, 10 μL CCK-8 ditambahkan ke setiap lubang dan diinkubasi selama 3 jam tambahan pada 37 °C. Absorbansi diukur pada 450 nm. Setiap eksperimen kelompok diulang tiga kali. Tingkat inhibisi (%) dihitung sebagai 1 − (absorbansi sampel − absorbansi kosong)/(absorbansi kontrol − absorbansi kosong) × 100%.

Statistika

Setiap eksperimen pengujian diulang tiga kali, dan data dianalisis menggunakan perangkat lunak SPSS 17.0. Uji satu arah ANOVA untuk analisis kelompok ganda dan uji t Student yang tidak terpasang untuk analisis dua kelompok digunakan untuk perbandingan. Data diekspresikan sebagai mean dan deviasi standar (SD), dan signifikansi statistik ditetapkan pada p < 0,05.

Hasil dan Pembahasan

Sintesis PEG-GO-PEI-FA

Ekspresi FR pertama kali dianalisis pada berbagai baris sel kanker berdasarkan database Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; https://portals.broadinstitute. org/ccle) [30] dan berbagai jaringan ovarium berdasarkan database Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA2; https://gepia2.cancer-pku.cn) [31]. Hasilnya konsisten dengan penelitian sebelumnya (Gambar S1). Oleh karena itu, kami memilih FA sebagai ligan target untuk pengiriman gen.

Grafit oksida tentu saja membawa banyak grup yang mengandung oksigen termasuk karboksil di tepi, hidroksil, dan grup epoksi pada bidang dasar yang dihasilkan oleh proses oksidasi [32]. Untuk mendapatkan GO skala nano (NGO), GO secara terus-menerus diretak dengan sonikasi bak pada 50 W selama 2 jam dan kemudian diikuti dengan penautan kovalen PEG/PEI/FA ke GO menggunakan kimia EDC/NHS, seperti diilustrasikan pada Gambar S2(A). Gambar S2(B) menunjukkan rute perawatan PEG-GO-PEI-FA/siRNA. Analisis penautan kimia dilakukan dengan teknologi spektrum beda FTIR untuk mendapatkan puncak serapan spektrum [33]. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1a, keberadaan grup fungsional OH (3425 cm⁻¹), C=O (1719 cm⁻¹), dan C=H (1350 cm⁻¹) ditemukan dalam GO dan menunjukkan keberadaan hidroksil dan karboksil pada permukaan GO. Pita getaran CH (2885 cm⁻¹) dapat ditemukan ketika PEG bereaksi dengan GO melalui ikatan kovalen yang stabil; ini menunjukkan PEG telah diangkat ke GO, dan efisiensi konjugasi PEG sekitar 6%. Setelah PEI dan FA bereaksi dengan GO, pita getaran NH (1590 cm⁻¹), C–N (1420 cm⁻¹) diamati, menunjukkan PEI dan FA telah diangkat ke GO melalui esterifikasi. Hasil ini menunjukkan bahwa konjugasi PEG-GO-PEI-FA telah berhasil disintesis.

Analisis sintesis yang berhasil PEG-GO-PEI-FA menggunakan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) dan spektrofotometer UV-Vis. a Spektra FTIR dari GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI, dan PEG-GO-PEI-FA. b Spektrum penyerapan UV-Vis dari GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI, dan PEG-GO-PEI-FA

Gambar 1b menunjukkan spektrum penyerapan UV-Vis dari GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI, dan PEG-GO-PEI-FA. GO memiliki puncak penyerapan pada 223 nm. FA memiliki puncak penyerapan pada 275 nm. GO-PEG menunjukkan kurva halus, yang mengindikasikan bahwa PEG telah dikonjugasi dengan GO dan membuat gunung GO lebih halus. PEG-GO-PEI memiliki puncak penyerapan pada 219 nm, yang menggambarkan PEI telah diangkat ke permukaan GO-PEG. PEG-GO-PEI-FA memiliki puncak penyerapan pada 219 nm dan 275 nm, yang mengungkapkan FA telah diangkat ke PEG-GO-PEI. Semua hasil ini lebih lanjut menunjukkan sintesis yang berhasil PEG-GO-PEI-FA.

Karakterisasi PEG-GO-PEI-FA

Data yang diberikan dalam Tabel 1 menunjukkan ukuran partikel dan potensi zeta nanokompleks. Ukuran partikel nanokompleks secara bertahap meningkat menjadi 218,4 nm sementara PEG, PEI, dan FA secara bertahap diangkat ke permukaan GO. Potensi zeta berubah dari −16,5 menjadi +17,5 mv ketika PEI terhubung ke GO, yang memfasilitasi kemampuan untuk menyerap DNA atau RNA yang bermuatan negatif melalui interaksi elektrostatis dan penyerapan seluler. Potensi zeta PEG-GO-PEI-FA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA adalah +14,7 mv dan +14,5 mv, masing-masing. Potensi zeta mengungkapkan bahwa PEG-GO-PEI-FA atau PEG-GO-PEI-FA/siRNA lebih kecil daripada PEG-GO-PEI karena muatan negatif FA dan siRNA. Ini menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI-FA/siRNA dapat terserap ke permukaan sel melalui interaksi muatan dan dapat digunakan oleh endositosi yang dimediasi reseptor pada sel [34].

Morfologi permukaan dan ukuran partikel nanokarier juga diukur dengan AFM dan DLS. Seperti ditunjukkan pada Gambar 2a, GO menunjukkan permukaan yang halus dan struktur lembar dengan ukuran partikel 192,1 nm. Setelah PEG, PEI, dan FA diangkat ke permukaan GO, ukuran partikel PEG-GO-PEI-FA meningkat menjadi 216,1 nm, dan banyak proteksi diamati pada permukaan PEG-GO-PEI-FA (Gambar 2b), yang mengindikasikan bahwa sejumlah besar hiasan diimobilkan pada lembar GO. Pada saat yang sama, tinggi PEG-GO-PEI-FA lebih tinggi daripada GO, yang terutama disebabkan oleh penambahan PEG, PEI, dan FA pada kedua bidang lembar GO.

Karakterisasi sistem pengiriman skala nano. Mikroskopi gaya atom (AFM) dan pencaharan cahaya dinamis (DLS) digunakan untuk mengkarakterisasi morfologi dan distribusi ukuran: a GO dan b PEG-GO-PEI-FA. Spektra Raman untuk analisis permukaan grafit oksida yang dihasilkan dari GO, GO-PEG, dan PEG-GO-PEI c

Spektroskopi Raman adalah salah satu yang paling banyak digunakan untuk mengukur karakterisasi dan properti struktural material karbon nano [35]. Seperti ditunjukkan pada Gambar 2c, spektrum Raman GO menunjukkan pita getaran pada 1600 cm⁻¹ (pita G) dan 1354 cm⁻¹ (pita D), dan rasio area ID/IG adalah 1,0385, yang mengindikasikan bahwa bagian hibridisasi SP² GO telah terpecah dan terbentuk hidroksil dan karboksil. GO-PEG dan PEG-GO-PEI menunjukkan pita getaran pada 1595 cm⁻¹ (pita G) dan 1352 cm⁻¹ (pita D), dan rasio area ID/IG adalah 0,7737 dan 0,5238. Rasio area ID/IG secara bertahap berkurang mengikuti reaksi PEG dan PEI dengan GO; ini menunjukkan bahwa PEG dan PEI telah diangkat ke permukaan GO.

Analisis Biosafety In Vitro dari Berbagai Fungsional NGO

Masalah biosafety vektor gen non-virus telah tetap menjadi tantangan signifikan untuk aplikasi klinis. Muatan positif tinggi tidak hanya membawa kapasitas yang luar biasa untuk mengkondensasi dan melindungi gen tetapi juga menyebabkan sitotoksitas parah [36, 37]. Untuk menguji sitotoksitas nanokompleks siRNA bebas, uji CCK-8 dilakukan dengan sel SKOV3 yang telah diinkubasi selama 4, 8, 12, dan 24 jam dengan nanokompleks bebas pada berbagai konsentrasi (dari 10 hingga 1000 μg/mL). Seperti ditunjukkan pada Gambar S3, nanokompleks masih memiliki kelangsungan sel yang tinggi pada kanker ovarium pada 1000 μg/mL dan 24 jam. Sitotoksitas semua nanokompleks menunjukkan cara yang bergantung pada waktu dan konsentrasi (kelangsungan sel SKOV3: lebih dari atau sama dengan 84,38% untuk semua nanokompleks pada 1000 μg/mL, dan lebih dari atau sama dengan 94,21% untuk semua nanokompleks pada 24 jam dengan sel SKOV3). Hasil ini menunjukkan bahwa nanokompleks menunjukkan sitotoksitas yang bisa diabaikan dan dapat berfungsi sebagai vektor gen yang biokompatibel.

Analisis Nanokompleks yang Digabungkan dengan siRNA

Penyerapan seluler molekül RNA bebas biasanya sulit karena muatan negatif yang signifikan yang mereka bawa [38]. Pemuatan biomolekul yang bermuatan negatif oleh polimer kation adalah metode yang banyak diadopsi untuk memecahkan masalah ini [39]. Dalam kertas ini, pemuatan siRNA pada vektor PEG-GO-PEI-FA dilakukan dengan mencampur siRNA dan PEG-GO-PEI-FA dalam larutan air. Seperti ditunjukkan pada Tabel 1, potensi zeta PEG-GO-PEI-FA adalah +14,7 mV, yang menunjukkan bahwa siRNA dapat terserap ke permukaan PEG-GO-PEI-FA melalui interaksi elektrostatis. Dalam studi ini, kemampuan kondensasi gen nanokompleks dievaluasi dengan elektroforesis gel agarosa [40]. Gambar 3a menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI memiliki kemampuan kondensasi yang jelas terhadap siRNA pada rasio bobot 10, sementara penahanan lengkap migrasi siRNA PEG-GO-PEI-FA diamati ketika rasio bobot mencapai 20 (Gambar 3b). Jadi, PEG-GO-PEI-FA dapat melindungi siRNA dari degradasi tetapi, pada saat yang sama, membutuhkan sedikit lebih banyak nanokompleks untuk menunjukkan kemampuan ikatan yang baik. Ini mungkin terkait dengan potensi zeta PEG-GO-PEI-FA yang tidak begitu tinggi. Hasil ini menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI dan PEG-GO-PEI-FA memiliki kemampuan pengiriman yang cukup, terutama PEG-GO-PEI-FA, yang lebih lanjut menunjukkan potensinya sebagai vektor yang valid untuk pengiriman gen yang efisien dan aman.

Kemampuan pemuatan siRNA pada berbagai rasio bobot. Elektroforesis gel agarosa penahanan dilakukan untuk mengevaluasi interaksi antara siRNA dan nanokarier. a PEG-GO-PEI dan b PEG-GO-PEI-FA pada berbagai rasio bobot (bahan/siRNA)

Analisis Penyerapan Seluler

Sangat penting jika vektor dapat secara spesifik menargetkan tumor untuk pengiriman gen. Untuk mengonfirmasi apakah vektor PEG-GO-PEI-FA dapat dengan mudah masuk ke sel, kami menggunakan FITC sebagai sonde fluorescensi untuk citra intracelular. Pada saat yang sama, nukleus diwarnai dengan DAPI, dan sel diwarnai dengan Dil. Seperti ditunjukkan pada Gambar 4, kelompok kontrol dan kelompok PEG-GO-PEI tidak menunjukkan sinyal fluorescensi hijau di sekitar nukleus dan sel. Ini mengindikasikan bahwa PEG-GO-PEI tidak masuk ke sel. PEI 25K dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA muncul sebagai sinyal fluorescensi hijau di sekitar inti, yang jelas menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI-FA dapat menembus sel dan masuk ke sel. Nanokompleks PEG-GO-PEI-FA menunjukkan penyerapan seluler yang paling aktif, mungkin disebabkan oleh FA yang dapat secara spesifik berikatan dengan FR yang ekspresi berlebihan pada permukaan sel SKOV3. Hasil ini menunjukkan bahwa FA memainkan peran krusial dalam memediasi penyerapan seluler yang efisien dari nanokompleks PEG-GO-PEI-FA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA. Lebih penting lagi, kemampuan FA untuk berikatan dengan reseptornya tidak terpengaruh oleh ikatan amida kovalen, dan endositosi yang dimediasi reseptor tidak terhalang.

Penyerapan seluler berbagai nanokompleks. Gambar CLSM penyerapan seluler berbagai nanokompleks yang diberi label FITC pada sel kanker ovarium manusia SKOV3 setelah diinkubasi selama 4 jam. Biru, nukleus (terlabel DAPI); merah, sel (terlabel Dil); hijau, nanokompleks (terlabel FITC). Skala batang mewakili 100 μm, tetapi skala batang adalah 10 μm pada satu sel

Analisis Pelarian Lisosom

Untuk sistem pengiriman siRNA, mereka harus melarikan diri dari endosom atau terbentuk lisosom. Namun, jika tidak, siRNA akan degradasi atau keluar dari sel [41,42,43]. Kami mengevaluasi kemampuan pelarian endosom dengan lokalisasi intrakelular nanokompleks menggunakan CLSM. Karena banyak laporan telah membuktikan bahwa PEI 25K dapat mendukung pelarian endosom atau lisosom melalui efek "spon proton" [44], jadi PEI 25K digunakan sebagai kontrol. Dalam studi ini, nanokompleks diberi label FITC. Pertama, kami memperkirakan nanokompleks masuk ke lisosom oleh sinyal kuning yang sinyal fluorescensi hijau FITC bertumpuk dengan sinyal fluorescensi merah Lyso Tracker Red. PEI 25K muncul sebagai sinyal kuning setelah diinkubasi selama 4 jam dengan sel dan bahan lainnya muncul sebagai sinyal kuning setelah diinkubasi selama 2 jam dengan sel, yang mengindikasikan bahwa bahan telah masuk ke sel (Gambar 5). Apakah nanokompleks melarikan diri dari lisosom oleh sinyal biru cerah, sinyal fluorescensi hijau FITC bertumpuk dengan sinyal fluorescensi biru DAPI. Seperti ditunjukkan pada Gambar 5a, sinyal hijau diamati dalam akumulasi di nukleus, dan ada sinyal biru cerah setelah inkubasi PEI/siRNA selama 8 jam dengan sel, yang mengindikasikan bahwa PEI/siRNA telah melarikan diri dari lisosom. Namun, PEG-GO-PEI-FA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA memiliki sinyal hijau lemah untuk menembus nukleus sejak awal 2 jam, dan sinyal hijau lebih terakumulasi di nukleus seiring peningkatan waktu inkubasi. Dan ada sinyal biru cerah ketika PEG-GO-PEI-FA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA diinkubasi selama 4 jam dengan sel (Gambar 5b, c). Ini mengindikasikan bahwa bahan telah melarikan diri dari lisosom sejak awal. Dalam kata lain, hasil ini menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI-FA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA tetap memiliki kemampuan pelarian endosom atau lisosom yang sangat baik dan dapat secara efisien memfasilitasi pelarian lisosom dan transaksi gen in vitro.

Internalisasi seluler dan pelarian lisosom PEG-GO-PEI-FA yang diamati oleh CLSM. Sel kanker ovarium SKOV3 diinkubasi dengan a PEI, b PEG-GO-PEI-FA, dan c PEG-GO-PEI-FA selama 0,5, 1, 2, 4, dan 8 jam. Yang berwarna biru adalah nukleus yang diwarnai dengan DAPI, yang hijau adalah nanokompleks yang diberi label FITC, dan yang merah mewakili fluoresensi endosom dan lisosom setelah pewarnaan dengan LysoTracker red. Skala batang mewakili 100 μm, tetapi skala batang adalah 10 μm pada satu sel

Evaluasi Inhibisi Sel PEG-GO-PEI-FA/siRNA

Dalam kasus saat ini, efek terapeutik PEG-GO-PEI-FA/siRNA diperiksa dengan uji CCK-8 pada sel SKOV3 in vitro. Seperti ditunjukkan pada Gambar 6a, kami tidak menemukan pengaruh yang signifikan pada tingkat kelangsungan sel tumor pada berbagai konsentrasi (10–100 μg/mL) dan berbagai titik waktu (12 dan 24 jam) dalam kelompok PEG-GO-PEI-FA. Bahkan konsentrasi di atas 100 μg/mL, tingkat kelangsungan sel tumor masih lebih dari 80%. Jadi, kami memilih 100 μg/mL untuk studi inhibisi sel berikutnya. Sitotoksitas yang lebih lemah ditampilkan dalam kelompok PEG-GO-PEI/siRNA dan Lipo2000/siRNA (tingkat inhibisi kurang dari 20%). Dibandingkan dengan PEG-GO-PEI/siRNA dan Lipo2000/siRNA, PEG-GO-PEI-FA/siRNA memiliki efek inhibisi yang signifikan terhadap pertumbuhan sel tumor SKOV3. PEG-GO-PEI-FA/siRNA menghambat sel SKOV3 secara bergantung pada waktu (Gambar 6b). Hasil ini menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI-FA/siRNA memiliki efek inhibisi terbaik untuk peningkatan sel tumor dan kami dapat menggunakan PEG-GO-PEI-FA sebagai nanokarier yang ideal untuk pengiriman gen.

Sitotoksitas in vitro PEG-GO-PEI-FA/siRNA pada sel kanker ovarium SKOV3 melalui uji CCK-8. a Sel SKOV3 dirawat dengan PEG-GO-PEI dan PEG-GO-PEI-FA pada berbagai konsentrasi (10–500 μg/mL) pada 12 dan 24 jam untuk mendapatkan dosis nanokarier optimal. b Sitotoksitas PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, dan Lipo2000/siRNA diukur pada titik waktu yang berbeda (4–48 jam) pada 100 μg/mL. Batang kesalahan mewakili ± SD; *p < 0,05 (uji t Student)