Functionalized Folate-Modified Graphene Oxide/PEI siRNA Nanocomplexes untuk Target Terapi Gen Kanker Ovarium
Abstrak
Terapi gen muncul sebagai metode yang valid untuk pengobatan kanker ovarium, termasuk RNA pengganggu kecil (siRNA). Meskipun sangat kuat, hanya sedikit yang menargetkan sistem pengiriman gen yang efisien secara serius menghambat pengembangan terapi gen. Dalam penelitian ini, kami mensintesis vektor gen baru PEG-GO-PEI-FA oleh graphene oxide (GO), di mana asam folat (FA) dapat secara khusus mengikat reseptor folat (FR), yang diekspresikan secara berlebihan pada kanker ovarium. Karakterisasi nanokompleks dievaluasi dengan hamburan cahaya dinamis (DLS), mikroskop gaya atom (AFM), dan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR). Kemampuan dan stabilitas kondensasi siRNA dinilai dengan elektroforesis gel agarosa. Efisiensi serapan seluler dan kemampuan melarikan diri lisosom dalam sel kanker ovarium diselidiki dengan mikroskop pemindaian laser confocal. Selanjutnya, keamanan hayati seluler dari sistem dan penghambatan tolerabilitas siRNA dievaluasi dengan uji CCK-8. Ukuran nanokompleks PEG-GO-PEI-FA adalah 216,1 ± 2,457 nm, menunjukkan sitotoksisitas ringan pada sel kanker ovarium. Dengan efisiensi serapan yang tinggi, PEG-GO-PEI-FA dapat keluar dari lisosom dengan cepat dan melepaskan gen tersebut. Selain itu, PEG-GO-PEI-FA/siRNA dapat secara efektif menghambat pertumbuhan sel kanker ovarium. Pada umumnya, PEG-GO-PEI-FA/siRNA mungkin menawarkan strategi yang menjanjikan untuk pengiriman siRNA dalam pengobatan karsinoma ovarium FR-positif atau tumor serupa.
Pengantar
Kanker ovarium adalah penyebab kematian ginekologis utama di dunia dan biasanya dikaitkan dengan hasil klinis yang buruk karena kesulitan diagnosis dan terapi dini [1,2,3]. Sayangnya, agen kemoterapi konvensional menunjukkan keterbatasan yang melekat seperti distribusi nonspesifik, bioavailabilitas yang buruk, pembersihan darah yang cepat, dan kelarutan yang buruk dalam lingkungan fisiologis [4]. Selama beberapa dekade terakhir, terapi gen telah diselidiki sebagai pendekatan potensial untuk pengobatan berbagai kelainan genetik, termasuk kanker [5,6,7,8]. Namun, kurangnya pembawa pengiriman gen yang aman, sangat efisien, dan selektif telah menghambat kemajuannya ke utilitas klinis. Saat ini, ada dua kategori vektor gen:vektor virus dan non-virus. Meskipun vektor virus telah menunjukkan efisiensi transfeksi yang tinggi, beberapa kelemahan membatasi aplikasi klinisnya, misalnya, reaksi inflamasi imun yang parah dan risiko rekombinasi dengan virus tipe liar [9, 10]. Sebaliknya, vektor non-virus memiliki kapasitas pengiriman yang luas, imunogenisitas rendah, dan fleksibilitas struktural, menjadikannya alternatif yang sangat baik untuk vektor virus [11,12,13]. Dengan pesatnya perkembangan nanoteknologi, banyak nanopartikel telah dieksplorasi untuk potensi penggunaan sebagai pembawa pengiriman gen [14, 15]. Di sini, karya ini telah merancang vektor non-viral baru PEG-GO-PEI-FA yang dapat dikirimkan secara efisien ke jaringan tumor.
Graphene oxide (GO) adalah turunan dari grafit yang dihasilkan oleh oksidasi multi-langkah, ultrasonik, dan pemurnian grafit [16]. Permukaan GO mengandung gugus epoksi, hidroksil, dan karboksil [17]. Gugus fungsi oksigen pada permukaannya memberi GO biokompatibilitas yang sangat baik yang memungkinkannya membentuk suspensi stabil dalam air dan pelarut organik, memfasilitasi modifikasi dan fungsionalisasi kimia [18, 19]. Jadi, GO telah banyak digunakan untuk terapi kanker fototermal, pengiriman obat dan gen, dan biosensor [20,21,22]. Polyethylene glycol (PEG) adalah bahan yang aman, tidak beracun, dan dapat terurai secara hayati; itu telah disetujui oleh US Food and Drug Administration sebagai pembawa obat hidrofilik [23]. Fungsionalisasi GO dengan PEG dapat meningkatkan stabilitas dalam kondisi fisiologis, memperpanjang waktu siklus GO nanomaterial dalam tubuh, dan meningkatkan farmakokinetik GO nanomaterial untuk penargetan tumor yang lebih baik [24, 25]. Polyethyleneimine (PEI) telah menjadi standar emas vektor non-virus karena efisiensi transfeksinya yang tinggi di berbagai lini sel [26]. Namun, PEI menunjukkan sitotoksisitas yang parah dan biokompatibilitas yang buruk, sehingga membatasi aplikasi klinisnya. Dalam penelitian ini, kami mengamati penurunan sitotoksisitas yang signifikan ketika PEI dicangkokkan ke permukaan GO. Reseptor folat diekspresikan secara berlebihan pada berbagai permukaan sel kanker, terutama pada sel kanker ovarium baik sebelum maupun setelah kemoterapi. Untuk pengiriman gen yang ditargetkan, molekul asam folat terikat secara kovalen dengan GO untuk menargetkan reseptor folat.
Secara keseluruhan, tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengeksplorasi sistem pengiriman gen berbasis GO penargetan baru untuk meningkatkan kegunaan terapi gen berbasis siRNA untuk kanker ovarium. PEG-GO-PEI-FA bermuatan positif yang diperoleh dapat dimuat dengan siRNA untuk pengiriman gen. Sintesis, karakterisasi, internalisasi seluler yang efektif, dan efek antikanker in vitro yang berhasil dianalisis menggunakan berbagai teknik. Selain itu, keamanan sistem ini juga dievaluasi secara in vitro.
Bahan dan Metode
Materi
Grafena oksida diperoleh dari Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, Cina). Asam folat (FA), N -hydroxysuccinimide (NHS), dan fluorescein isothiocyanate (FITC) dibeli dari Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, Cina). Cabang PEI 25K, PEG (MW =2000), agarosa, dan 1-(3-dimethylaminopropy l)-3-etil karbodiimida hidroklorida (EDC·HCL) dibeli dari Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Cina). Larutan buffer fosfat (PBS), saline buffer fosfat Dulbecco (DPBS), dan semua bahan kimia lainnya dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Cina). Semua bahan kimia lainnya adalah kelas reagen. Medium RPMI-1640 (Gibco), serum janin sapi (FBS) (Gibco), tripsin (Gibco), dan buffer 20× TAE dibeli dari Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China). Kit penghitung sel8 (CCK-8) dibeli dari Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, China). LysoTrackerRed, 4% paraformaldehyde, 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), dan reagen transfeksi Lipofectamine 2000 dibeli dari Invitrogen Co. Ltd. (Cina). Probe fluoresensi dil (Nomor Cat:C1036) dibeli dari Beyotime Co. Ltd. Anti-PLK1 (PLK1-homo-581) short interfering RNA (siRNA) disintesis oleh Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).
Persiapan PEG-GO-PEI-FA
Sintesis PEG-GO-PEI-FA sesuai dengan strategi yang ditunjukkan pada Gambar S2 (A). Pertama, suspensi berair 10 mL GO (1000 μg/mL) terus menerus disonikasi pada 50 W selama 2 h. Kemudian ditambahkan 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) dan NHC (5000 μg/mL) dan disonikasi sebentar-sebentar selama 30 mnt pada 100 W, diikuti dengan menambahkan PEG (10 mg) yang disonikasi selama 30 mnt dan diaduk pada magnet pengaduk selama 6 jam pada 0 °C. Untuk menghilangkan reagen yang tidak bereaksi dan mendapatkan larutan GO-PEG, campuran didialisis selama 24 h dalam air suling dengan membran dialisis (MWCO, 3500 Da). Kemudian, larutan GO-PEG disonikasi selama 30 mnt, 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) dan NHC (5000 μg/mL) ditambahkan dan disonikasi lagi selama 30 mnt, diikuti dengan menambahkan PEI 25K (5000 μg/mL ) 2 mL. Campuran disonikasi selama 30 menit dan diaduk selama 6 jam pada 0°C. Selanjutnya, untuk mendapatkan PEG-GO-PEI, campuran didialisis selama 24 jam dalam akuades dengan membran dialisis (MWCO, 3500 Da) lagi. Solusi PEG-GO-PEI disonikasi selama 60 mnt, 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) dan NHC (5000 μg/mL) ditambahkan dan disonikasi selama 30 mnt lagi, diikuti dengan menambahkan 10 mg FA ke dalam larutan . Solusinya disonikasi selama 30 menit dan diaduk selama 12 jam pada 0 ° C dan didialisis selama 48 jam untuk mendapatkan PEG-GO-PEI-FA sesuai dengan prosedur yang disebutkan di atas. Larutan nanokompleks dikeringkan dengan pengering beku vakum (Biosafer-10D).
Karakterisasi
Potensi zeta permukaan dan ukuran partikel rata-rata dari nanokompleks pada larutan air diukur dengan hamburan cahaya dinamis (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, UK). Morfologi nanokompleks diamati menggunakan mikroskop gaya atom di atmosfer (AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Jerman). Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) diperoleh dengan spektrograf FTIR Thermo Nicolet 6700, menggunakan pelet KBr pada kisaran 400–4000 cm
−1
. Spektrum serapan UV-Vis dari nanokompleks diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (UV, EV300, USA). Raman dari nanokompleks diukur dengan mikroskop Raman dispersif (Senterra R200-L, Jerman) dengan panjang gelombang eksitasi pada 532 nm.
Pengujian Biosekuriti In Vitro
SKOV3 (sel kanker ovarium manusia) dibeli dari Keygen (China). Sel dipelihara dalam media RPMI-1640, dilengkapi dengan 10% FBS, 100 U/mL penisilin, 100 g/mL streptomisin, dan dikultur pada 37 °C di bawah atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5% CO2 . Dalam penelitian ini, sitotoksisitas bahan dianalisis dalam sel SKOV3 dengan uji CCK-8. Secara singkat, sel-sel diunggulkan di piring 96-sumur dengan kepadatan 6 × 10
3
sel/sumur dalam media 100 μL 1640 yang mengandung 10% FBS dan kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 12 h dalam suasana lembab yang mengandung 5% CO2 . Kemudian, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI, dan PEG-GO-PEI-FA ditambahkan pada konsentrasi akhir mulai dari 10 hingga 1000 μg/mL dan diinkubasi dengan sel selama 12 jam tambahan. Lain, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI, dan PEG-GO-PEI-FA diinkubasi dengan waktu yang berbeda dari 4 sampai 24 h pada konsentrasi 100 μg/mL. Selanjutnya, 10 μL CCK-8 ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi lagi selama 3 h pada suhu 37 °C. Setelah itu, absorbansi pada 450 nm diukur pada pembaca pelat mikro. Setiap kelompok percobaan diulang tiga kali. Viabilitas sel relatif (%) yang terkait dengan sel kontrol yang dikultur dalam media dihitung sebagai (absorbansi sampel absorbansi blanko)/(absorbansi kontrol absorbansi blanko) × 100%.
Uji Retardasi Gel Agarosa
Larutan buffer TAE 20x diencerkan dengan air yang diolah DEPC untuk membuat larutan agarosa 1%. Kemudian, larutan dipanaskan selama 5 menit dengan oven microwave untuk melarutkan agarosa sepenuhnya. Ketika suhu larutan agarosa turun hingga 55 °C, ditambahkan larutan etidium bromida (EB, 0,5 μg/mL) dengan perbandingan volume 10.000:1 dan diaduk merata, selanjutnya larutan agarosa dengan pendinginan hingga membentuk gel agarosa. . Campuran PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA, dan siRNA pada rasio berat yang berbeda ditambahkan ke lubang. Gel dijalankan pada 110 V dan 40 mA selama sekitar 60 menit, kemudian diamati dan dianalisis dengan ultraviolet imager.
Studi Serapan Sel PEG-GO-PEI-FA
Untuk menyelidiki serapan sel, nanokompleks diberi label dengan FITC menurut metode yang dijelaskan sebelumnya dengan sedikit modifikasi [28]. Secara singkat, larutan nanokompleks (sekitar 1 mg/mL, 2,0 mL) dicampur dengan 0,2 mL FITC (26 mM) yang dilarutkan dalam DMSO dan kemudian diaduk semalaman pada suhu kamar. Campuran yang dihasilkan didialisis melalui membran 5000 MWCO untuk menghilangkan FITC yang tidak berlabel dan kemudian diliofilisasi. Sel-sel disemai di piring 6-sumur (berisi kaca penutup) dengan kepadatan 2 × 10
5
sel/well dalam medium 2 mL 1640 yang mengandung 10% FBS kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 12 h dalam inkubator kultur sel. Kemudian, media di setiap sumur diganti dengan media 1640 bebas serum. Selanjutnya, sel-sel diperlakukan dengan nanokompleks / FITC yang berbeda. Sel diperlakukan tanpa nanocomplexes adalah kelompok kontrol, dan sel-sel diperlakukan dengan PEI 25 K adalah kelompok kontrol paralel. Setelah inkubasi selama 4 h pada 37 °C dalam suasana lembab yang mengandung 5% CO2 , cairan cawan kultur dihilangkan, sel dicuci dua kali dengan DPBS dingin (pH =7,4), kemudian 20 μL DAPI dan 5 μL Dil (pewarna sitomembran) ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi 20 min pada 37 °C di bawah kegelapan. Selanjutnya, DAPI dan Dil dari media kultur dikeluarkan dan dicuci dua kali dengan DPBS dingin (pH =7,4), dan penutup sel dikeluarkan dan difiksasi pada kaca objek dengan Media Pemasangan Permount TM. Setelah itu, sinyal fluoresensi dari slide sel diamati oleh Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) dan menganalisis serapan sel dari nanokompleks.
Escape Endosomal dan Penetrasi ke Inti
Untuk memvisualisasikan distribusi seluler, pelepasan endosom, dan penetrasi nanokompleks, sel SKOV3 diunggulkan dalam pelat 12-sumur (berisi kaca penutup) dengan kepadatan 1 × 10
5
sel/well dalam medium 2 mL 1640 yang mengandung 10% FBS kemudian diinkubasi selama 12 h (37 °C, 5% CO2 ). Kemudian, media di setiap sumur diganti dengan media 1640 bebas serum 1 mL/well. Selanjutnya, berbagai nanokompleks (100 μg/mL) yang diberi label oleh FITC ditambahkan dalam pelat 12-sumur untuk 1 mL/sumur. Setelah 6 h, cairan dihilangkan, sel dicuci dua kali dengan DPBS dingin (pH =7,4), dan pelat 12-sumur ditambahkan LysoTracker Red (5 μg/mL) untuk 50 μL/sumur. Setelah inkubasi selama 15 menit pada 37 °C dalam suasana lembab yang mengandung 5% CO2 , cairan pelat 12-sumur dihilangkan, sel-sel dicuci dua kali dengan DPBS dingin (pH =7,4), kemudian 20 μL DAPI ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 20 min pada 4 °C di bawah gelap. Selanjutnya, cairan DAPI dihilangkan dan dicuci dua kali dengan DPBS dingin (PH =7,4). Setelah itu, dengan paraformaldehida 4% difiksasi 15 menit pada suhu kamar, dan kaca penutup dikeluarkan dan dipasang pada kaca objek dengan Media Pemasangan Permount TM. Sinyal fluoresensi dari slide diamati dengan mikroskop pemindaian laser confocal dan menganalisis pelepasan lisosom dan penetrasi ke dalam nukleus nanokompleks [29].
Analisis Penghambatan Cyto
Kami menganalisis efek penghambatan sel PEG-GO-PEI/siRNA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA menggunakan uji CCK-8. Tak lama, sel-sel diunggulkan di piring 96-sumur dengan kepadatan 6 × 10
3
sel/sumur dalam media 100 μL 1640 yang mengandung 10% FBS dan kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 12 h dalam suasana lembab yang mengandung 5% CO2 . Kemudian, PEG-GO-PEI dan PEG-GO-PEI-FA ditambahkan pada konsentrasi akhir mulai dari 10 hingga 500 μg/mL dan diinkubasi dengan sel selama 12 dan 24 jam tambahan. Kemudian, PEG-GO-PEI/siRNA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA diinkubasi dengan sel dari 4 hingga 48 h pada konsentrasi 100 μg/mL. SiRNA ditransfeksi dengan Lipofectamine 2000 dan tidak diobati sebagai kelompok kontrol. Selanjutnya, 10 μL CCK-8 ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi lagi selama 3 h pada suhu 37 °C. Absorbansi diukur pada 450 nm. Setiap kelompok percobaan diulang tiga kali. Laju penghambatan (%) dihitung sebagai 1 (absorbansi sampel absorbansi blanko)/(absorbansi kontrol absorbansi blanko) × 100%.
Statistik
Setiap percobaan pengujian diulang sebanyak tiga kali, dan data dianalisis menggunakan software SPSS 17.0. Tes ANOVA satu arah untuk analisis kelompok ganda dan t . Siswa yang tidak berpasangan tes untuk analisis dua kelompok digunakan untuk perbandingan. Data dinyatakan sebagai mean dan standar deviasi (SD), dan signifikansi statistik ditetapkan pada p <0,05.
Hasil dan Diskusi
Sintesis PEG-GO-PEI-FA
Ekspresi FR pertama kali dianalisis dalam garis sel kanker yang berbeda berdasarkan Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; http://portals.broadinstitute.org/ccle) database [30] dan jaringan ovarium yang berbeda berdasarkan Gene Expression Profiling Interactive Analisis (GEPIA2; http://gepia2.cancer-pku.cn) database [31]. Hasilnya konsisten dengan penelitian sebelumnya (Gambar S1). Oleh karena itu, kami memilih FA sebagai ligan penargetan untuk pengiriman gen.
Grafena oksida tentu saja mengandung banyak gugus yang mengandung oksigen antara lain gugus karboksil pada tepi, hidroksil, dan gugus epoksi pada bidang basal yang dihasilkan oleh proses oksidasi [32]. Untuk mendapatkan GO skala nano (NGO), GO terus-menerus retak dengan sonikasi mandi pada 50 W selama 2 h dan kemudian diikuti oleh ikatan kovalen PEG/PEI/FA ke GO menggunakan kimia EDC/NHS, seperti yang diilustrasikan pada Gambar S2(A). Gambar S2(B) menunjukkan rute pengobatan PEG-GO-PEI-FA/siRNA. Analisis konjugasi kimia dilakukan dengan teknologi spektra diferensial FTIR untuk mendapatkan puncak serapan spektral [33]. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1a, keberadaan OH (3425 cm
−1
), C=O (1719 cm
−1
), dan C=H (1350 cm
−1
) gugus fungsi ditemukan pada GO dan menunjukkan adanya hidroksil dan karboksil pada permukaan GO. CH (2885 cm
−1
) regangan pita getaran dapat ditemukan ketika PEG bereaksi dengan GO melalui ikatan kovalen yang stabil; ini menunjukkan PEG telah dicangkokkan ke GO, dan efisiensi konjugasi PEG sekitar 6%. Setelah PEI dan FA direaksikan dengan GO, NH (1590 cm
−1
), C–N (1420 cm
−1
) regangan pita getaran diamati, menunjukkan PEI dan FA telah dicangkokkan ke GO melalui esterifikasi. Hasil ini menunjukkan bahwa konjugasi PEG-GO-PEI-FA telah berhasil disintesis.
Keberhasilan analisis sintetik PEG-GO-PEI-FA menggunakan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) dan spektrofotometer UV-Vis. a Spektrum FTIR GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI, dan PEG-GO-PEI-FA. b Spektrum serapan UV-Vis GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI, dan PEG-GO-PEI-FA
Gambar 1b menunjukkan spektrum serapan UV-Vis GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI, dan PEG-GO-PEI-FA. GO memiliki puncak penyerapan 223 nm. FA memiliki puncak penyerapan 275 nm. GO-PEG menunjukkan kurva yang mulus, menunjukkan bahwa PEG telah terkonjugasi dengan GO dan membuat gunung GO lebih mulus. PEG-GO-PEI memiliki puncak penyerapan di 219 nm, menggambarkan PEI telah dicangkokkan ke permukaan GO-PEG. PEG-GO-PEI-FA memiliki puncak penyerapan pada 219 nm dan 275 nm, menunjukkan FA telah dicangkokkan ke PEG-GO-PEI. Semua hasil ini selanjutnya menunjukkan keberhasilan sintesis PEG-GO-PEI-FA.
Karakterisasi PEG-GO-PEI-FA
Data yang diberikan pada Tabel 1 menunjukkan ukuran partikel dan potensi zeta dari nanokompleks. Ukuran partikel nanokompleks secara bertahap meningkat menjadi 218.4 nm sementara PEG, PEI, dan FA dicangkokkan secara progresif ke permukaan GO. Potensi zeta berubah dari 16,5 menjadi + 17,5 mv ketika PEI terhubung ke GO, yang memfasilitasi kemampuan untuk menyerap DNA atau RNA bermuatan negatif melalui interaksi elektrostatik dan serapan seluler. Potensi zeta dari PEG-GO-PEI-FA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA masing-masing adalah + 14,7 mv dan + 14,5 mv. Potensi zeta mengungkapkan bahwa PEG-GO-PEI-FA atau PEG-GO-PEI-FA/siRNA lebih kecil dari PEG-GO-PEI karena muatan negatif FA dan siRNA. Hal ini menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI-FA/siRNA dapat diadsorbsi ke permukaan sel melalui interaksi muatan dan digunakan oleh endositosis yang diperantarai reseptor pada sitomembran [34].
Morfologi permukaan dan ukuran partikel nanocarrier juga diukur dengan AFM dan DLS. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2a, GO menunjukkan permukaan halus dan struktur lembaran dengan ukuran partikel 192,1 nm. Setelah pencangkokan PEG, PEI, dan FA ke permukaan GO, ukuran partikel PEG-GO-PEI-FA meningkat menjadi 216,1 nm, dan banyak tonjolan diamati pada permukaan PEG-GO-PEI-FA (Gbr. 2b ), menunjukkan bahwa sejumlah besar dekorasi dilumpuhkan ke lembar GO. Pada saat yang sama, ketinggian PEG-GO-PEI-FA lebih tinggi dari GO, terutama karena menempelnya PEG, PEI, dan FA pada kedua bidang lembar GO.
Karakterisasi sistem pengiriman skala nano. Mikroskop gaya atom (AFM) dan hamburan cahaya dinamis (DLS) digunakan untuk mengkarakterisasi morfologi dan distribusi ukuran:a PERGI dan b PEG-GO-PEI-FA. Spektrum Raman untuk analisis permukaan oksida graphene yang dihasilkan dari GO, GO-PEG, dan PEG-GO-PEI c
Spektroskopi Raman adalah salah satu yang paling umum digunakan untuk mengukur karakterisasi dan sifat struktural bahan nanokarbon [35]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2c, spektrum Raman GO menunjukkan pita getaran pada 1600 cm
−1
(G-band) dan 1354 cm
−1
(D band), dan rasio area ID/IG adalah 1,0385, menunjukkan bahwa bagian SP
2
hibridisasi GO telah terputus dan terbentuk hidroksil dan karboksil. GO-PEG dan PEG-GO-PEI menunjukkan pita getaran pada 1595 cm
−1
(G band) dan 1352 cm
−1
(D band), dan rasio luas ID/IG adalah 0,7737 dan 0,5238. Rasio area ID/IG secara bertahap berkurang mengikuti reaksi PEG dan PEI dengan GO; ini menunjukkan PEG dan PEI telah dicangkokkan ke permukaan GO.
Analisis Biosekuriti In Vitro dari Berbagai LSM Fungsional
Masalah biosekuriti dari vektor gen non-virus tetap menjadi tantangan yang signifikan untuk aplikasi klinis. Muatan positif yang tinggi tidak hanya membawa kapasitas yang sangat baik untuk memadatkan dan melindungi gen tetapi juga menyebabkan sitotoksisitas yang parah [36, 37]. Untuk menguji sitotoksisitas nanokompleks siRNA bebas, uji CCK-8 dilakukan dengan sel SKOV3 yang telah diinkubasi selama 4, 8, 12, dan 24 h dengan nanokompleks bebas pada konsentrasi yang berbeda (dari 10 hingga 1000 μg/mL). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S3, nanokompleks masih memiliki viabilitas sel yang tinggi pada kanker ovarium pada 1000 μg/mL dan 24 h. Sitotoksisitas semua nanokompleks ditampilkan dengan cara yang bergantung pada waktu dan konsentrasi (viabilitas sel SKOV3:lebih besar dari atau sama dengan 84,38% untuk semua nanokompleks dalam 1000 μg/mL, dan lebih besar dari atau sama dengan 94,21% untuk semua nanokompleks pada 24 h dengan sel SKOV3). Hasil ini menunjukkan bahwa nanokompleks menunjukkan sitotoksisitas yang dapat diabaikan dan dapat berfungsi sebagai vektor gen yang biokompatibel.
Analisis Nanokompleks yang Dikombinasikan dengan siRNA
Serapan seluler dari molekul RNA bebas biasanya rumit karena muatan negatif substansial yang mereka bawa [38]. Pemuatan biomolekul bermuatan negatif oleh polimer kationik secara luas diadopsi untuk memecahkan masalah [39]. Dalam makalah ini, pemuatan siRNA pada vektor PEG-GO-PEI-FA dicapai dengan mencampurkan siRNA dan PEG-GO-PEI-FA dalam larutan berair. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, potensi zeta PEG-GO-PEI-FA adalah + 14,7 mV, menunjukkan bahwa siRNA dapat diadsorpsi ke permukaan PEG-GO-PEI-FA melalui interaksi elektrostatik. Dalam penelitian ini, kemampuan kondensasi gen dari nanokompleks dinilai dengan elektroforesis gel agarosa [40]. Gambar 3a menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI memiliki kemampuan kondensasi yang jelas terhadap siRNA pada rasio berat 10, sedangkan retardasi lengkap PEG-GO-PEI-FA dari migrasi siRNA diamati ketika rasio berat mencapai 20 (Gbr. 3b). Jadi, PEG-GO-PEI-FA dapat melindungi siRNA dari degradasi tetapi, pada saat yang sama, membutuhkan lebih banyak nanokompleks untuk menunjukkan kemampuan pengikatan yang baik. Hal ini mungkin terkait dengan potensi zeta PEG-GO-PEI-FA yang tidak terlalu tinggi. Hasil ini menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI dan PEG-GO-PEI-FA memiliki kemampuan pengiriman yang cukup, terutama PEG-GO-PEI-FA, yang selanjutnya menunjukkan potensinya sebagai vektor yang valid untuk pengiriman gen yang efisien dan aman.
Kemampuan memuat siRNA pada rasio bobot yang berbeda. Uji keterbelakangan gel agarosa dilakukan untuk mengevaluasi interaksi antara siRNA dan nanocarrier. a PEG-GO-PEI dan b PEG-GO-PEI-FA pada berbagai rasio berat (bahan/siRNA)
Analisis Serapan Seluler
Sangat penting jika pembawa dapat secara khusus menargetkan tumor untuk pengiriman gen. Untuk mengkonfirmasi apakah pembawa PEG-GO-PEI-FA dapat dengan mudah memasuki sel, kami menggunakan FITC sebagai probe fluoresen untuk pencitraan intraseluler. Pada saat yang sama, inti diwarnai dengan DAPI, dan sitomembran diwarnai dengan Dil. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, kelompok kontrol dan kelompok PEG-GO-PEI tidak menunjukkan sinyal fluoresensi hijau di sekitar inti dan sitomembran. Ini menyiratkan bahwa PEG-GO-PEI tidak masuk ke dalam sel. PEI 25K dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA muncul sebagai sinyal fluoresensi hijau di sekitar inti, yang dengan jelas menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI-FA dapat menembus membran sel dan memasuki sel. Nanokompleks PEG-GO-PEI-FA menunjukkan serapan seluler paling aktif, mungkin yang dikaitkan dengan FA dapat secara khusus mengikat FR yang diekspresikan secara berlebihan di permukaan sel SKOV3. Hasil ini menunjukkan bahwa FA memainkan peran penting dalam memediasi penyerapan seluler yang efisien dari nanokompleks PEG-GO-PEI-FA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA. Lebih penting lagi, kemampuan FA untuk mengikat reseptornya tidak terpengaruh oleh ikatan amida kovalen, dan endositosis yang dimediasi reseptor tidak terhalang.
Serapan seluler dari berbagai nanokompleks. Gambar mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) dari serapan seluler dari berbagai nanokompleks berlabel FITC dalam sel SKOV3 kanker ovarium manusia setelah inkubasi selama 4 jam. Biru, inti (berlabel DAPI); merah, sitomembran (berlabel Dil); hijau, nanokompleks (berlabel FITC). Bilah skala mewakili 100 μm, tetapi bilah skala adalah 10 μm dalam satu sel
Analisis Pelarian Lisosom
Untuk sistem pengiriman siRNA, mereka harus keluar dari endosom atau lisosom yang terbentuk. Namun, jika tidak, siRNA akan terdegradasi atau terkuras keluar sel [41,42,43]. Kami mengevaluasi kemampuan melarikan diri endosom dengan lokalisasi intraseluler dari nanokompleks menggunakan CLSM. Karena banyak laporan telah menunjukkan bahwa PEI 25K dapat mendukung pelepasan endosom atau lisosom melalui “efek spons proton” [44], maka PEI 25K digunakan sebagai kontrol. Dalam penelitian ini, nanokompleks diberi label dengan FITC. Pertama, kami memperkirakan nanokompleks masuk ke dalam lisosom dengan sinyal kuning bahwa sinyal fluoresen hijau FITC tumpang tindih dengan sinyal fluoresen merah Lyto Tracker Red. PEI 25K muncul sebagai sinyal kuning setelah inkubasi selama 4 jam dengan sel dan bahan lain muncul sebagai sinyal kuning setelah inkubasi selama 2 jam dengan sel, menyiratkan bahan telah masuk ke dalam sel (Gbr. 5). Apakah nanokompleks lolos dari lisosom atau tidak oleh sinyal sian cerah, sinyal fluoresen hijau FITC bergabung dengan sinyal fluoresen biru DAPI. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5a, sinyal hijau diamati dalam akumulasi dalam inti, dan ada sinyal cyan terang setelah inkubasi PEI/siRNA selama 8 h dengan sel, menunjukkan bahwa PEI/siRNA telah lolos dari lisosom. Namun, PEG-GO-PEI-FA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA memiliki beberapa sinyal hijau lemah untuk menembus inti sedini 2 h, dan sinyal hijau terakumulasi dalam inti seiring dengan peningkatan waktu inkubasi. Dan ada sinyal cyan terang ketika PEG-GO-PEI-FA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA diinkubasi selama 4 jam dengan sel (Gbr. 5b, c). Ini menunjukkan bahwa bahan telah lolos dari lisosom begitu awal. Singkatnya, hasil ini menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI-FA dan PEG-GO-PEI-FA/siRNA tetap merupakan kemampuan pelepasan endosom atau lisosom yang sangat baik dan dapat secara efisien memfasilitasi pelepasan lisosom dan transfeksi gen in vitro.
Internalisasi seluler dan pelepasan lisosom dari PEG-GO-PEI-FA yang diamati oleh CLSM. Sel kanker ovarium SKOV3 diinkubasi dengan a PEI, b PEG-GO-PEI-FA, dan c PEG-GO-PEI-FA untuk 0,5, 1, 2, 4, dan 8 h. Yang berwarna biru adalah inti yang diwarnai dengan DAPI, hijau adalah nanokompleks yang diberi label dengan FITC, dan yang berwarna merah mewakili endosom dan fluoresensi lisosom setelah diwarnai dengan LysoTracker merah. Bilah skala mewakili 100 μm, tetapi bilah skala adalah 10 μm dalam satu sel
Evaluasi Penghambatan Sel PEG-GO-PEI-FA/siRNA
Dalam kasus saat ini, efek terapeutik PEG-GO-PEI-FA/siRNA diperiksa dengan uji CCK-8 pada sel SKOV3 in vitro. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, kami tidak menemukan pengaruh yang signifikan pada tingkat kelangsungan hidup sel tumor pada konsentrasi yang berbeda (10-100 μg/mL) dan titik waktu yang berbeda (12 dan 24 h) di PEG-GO-PEI- grup FA. Meskipun konsentrasinya lebih dari 100 μg/mL, tingkat kelangsungan hidup sel tumor masih lebih dari 80%. Jadi, kami memilih 100 μg/mL untuk studi penghambatan seluler berikutnya. Sitotoksisitas yang lebih lemah ditunjukkan pada kelompok PEG-GO-PEI/siRNA dan Lipo2000/siRNA (tingkat penghambatan kurang dari 20%). Dibandingkan dengan PEG-GO-PEI/siRNA dan Lipo2000/siRNA, PEG-GO-PEI-FA/siRNA memiliki efek penghambatan yang signifikan pada pertumbuhan sel tumor SKOV3. PEG-GO-PEI-FA/siRNA menghambat sel SKOV3 dengan cara yang bergantung pada waktu (Gbr. 6b). Hasil ini menunjukkan bahwa PEG-GO-PEI-FA/siRNA memiliki efek penghambatan terbaik untuk peningkatan sel tumor dan kami dapat menggunakan PEG-GO-PEI-FA sebagai nanocarrier yang ideal untuk pengiriman gen.
In vitro cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA in ovarian cancer SKOV3 cells via CCK-8 assay. a SKOV3 cells were treated with PEG-GO-PEI and PEG-GO-PEI-FA at different concentrations (10–500 μg/mL) at 12 and 24 h to get the optimal dose of nanocarrier. b The cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, and Lipo2000/siRNA were measured in different time points (4–48 h) at 100 μg/mL. Error bars represent ± SD; *p <0.05 (Student’s t test)
Conclusions
In this study, we successfully synthesized a novel gene delivery system, PEG-GO-PEI-FA. The not cytotoxic by itself and excellent biological compatibility of PEG-GO-PEI-FA guaranteed its prospects as a safe and effective gene delivery vector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA nanocomplexes exhibited outstanding physicochemical properties for gene targeting delivery. Moreover, PEG-GO-PEI-FA/siRNA could readily enter SKOV3 ovarian cancer cells and escape from the lysosomes. Cytotoxicity assay demonstrated that PEG-GO-PEI-FA/siRNA had a good inhibition effect on ovarian cancer cells in a time-dependent manner, and it exhibited a higher cytotoxicity effect compared to other groups. On the basis of aforementioned results, PEG-GO-PEI-FA may provide good anticipation as a gene vector for targeted gene delivery and more effective strategy in ovarian carcinoma treatments.
Ketersediaan Data dan Materi
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel yang diterbitkan ini dan file informasi tambahannya.
