Sistem Nanos GAL-GNR-siBRAF: Penyapuhan Gen BRAF Terpadu + Terapi Fototermal untuk Menghentikan Pertumbuhan Hepatoma
Abstrak
Kanker hati adalah salah satu malignancy yang paling umum di seluruh dunia. Inhibitor kinasa RAF efektif dalam pengobatan karsinoma sel hepatoseluler (HCC); oleh karena itu, inhibisi jalur BRAF/MEK/ERK telah menjadi strategi terapeutik baru untuk terapi HCC baru. Namun, sistem pengiriman terpadu spesifik untuk tumor masih menjadi hambatan signifikan untuk aplikasi klinis. Galaktosa (GAL) dapat menargetkan reseptor asialoglikoprotein (ASGPR) yang diekspresi tinggi pada sel kanker hati. Dalam studi ini, kami merancang nanomaterial multifungsi baru GAL-GNR-siBRAF yang terdiri dari tiga bagian, GAL sebagai moieti penargetan kanker hati, nanorod emas (GNR) yang menawarkan kemampuan fototermal di bawah cahaya inframerah dekat, dan siRNA yang secara spesifik menyapu BRAF (siBRAF). Nanosir GAL-GNR-siBRAF menunjukkan kapasitas muatan siRNA yang tinggi dan menghambat degradasi siRNA dalam serum. Dibandingkan nanorod emas telanjang, GAL-GNR-siBRAF memiliki biotoksikitas lebih rendah dan efektivitas penyapuhan gen yang lebih tinggi. Pengobatan dengan GAL-GNR-siBRAF secara signifikan menurunkan ekspresi BRAF dan merusak proliferasi, migrasi, dan invasi sel kanker hati. Selain itu, efek fototermal gabungan dan penyapuhan BRAF oleh GAL-GNR-siBRAF secara efektif menyebabkan kematian sel tumor. Oleh karena itu, studi kami mengembangkan jenis nanomaterial multifungsi baru GAL-GNR-siBRAF untuk pengobatan kanker hati, yang memberikan ide untuk pengembangan metode pengobatan klinis baru.
Pendahuluan
Karsinoma sel hepatoseluler (HCC) adalah masalah kesehatan global besar [1]. Ini adalah kanker ke-6 paling umum di dunia, dan penyebab kematian akibat kanker ke-3 [2, 3]. Sebagian besar kasus HCC terjadi di Asia Timur dan Afrika Sub-Sahara. Namun, insidensi telah meningkat di beberapa negara berkembang, termasuk Prancis, Britania Raya, Jepang, dan Amerika Serikat [4]. Pengobatan standar untuk HCC awal adalah resesi bedah tumor. Setelah bedah, tingkat kelangsungan hidup 5 tahun dapat bervariasi dari 89 hingga 93% [5]. Sayangnya, hanya sebagian kecil pasien HCC (sekitar 20–30%) yang didiagnosis pada tahap awal; sebagian besar pasien HCC (> 70%) ditemukan pada tahap lanjut dan tidak dapat dilakukan resesi bedah. Opsi pengobatan lainnya termasuk transplantasi hati, embolokimia arteri transkateter (TACE), dan kemoterapi sistemik [6]. Namun, transplantasi hati terbatas oleh pasokan, dan embolokimia TACE yang tidak sempurna dapat menyebabkan kegagalan pengobatan, dengan efek samping signifikan dari kemoterapi sistemik, dan prognosis keseluruhan yang buruk. Oleh karena itu, metode pengobatan baru untuk karsinoma sel hepatoseluler sangat dibutuhkan secara klinis [7].
Jalur sinyal RAS/RAF memainkan peran penting dalam perkembangan kanker hati, dan BRAF adalah salah satu gen terkait kanker penting dalam jalur ini. Perubahan genetika dalam gen ini sering menghasilkan dua gangguan bertingkat. Aktivasi abnormal jalur sinyal RAS/RAF terkait dengan prognosis buruk pada pasien kanker [8]. BRAF adalah gen yang paling sering bermutasi dalam keluarga RAF, dan penargetan jalur RAS/RAF adalah strategi terapeutik baru untuk pengobatan HCC [8,9,10]. Sejak inhibitor kinasa RAF sorafenib telah terbukti berguna dalam pengobatan HCC, maka mutasi BRAF telah menjadi target yang diutamakan untuk terapi HCC [8]. Lebih spesifik lagi, mutasi BRAF telah menjadi target yang diinginkan untuk pengobatan HCC lanjut, karena pengembangan klinis inhibitor kinasa RAF sorafenib telah ditemukan dalam pengobatan HCC di Asia, Eropa, dan Amerika Serikat [11]. Dibandingkan placebo, sorafenib meningkatkan kelangsungan hidup keseluruhan dengan memperpanjang kelangsungan hidup median pasien dengan HCC lanjut [12,13,14]. Namun, sorafenib memiliki kemampuan penargetan tumor yang buruk, yang dapat menyebabkan efek samping berbahaya seperti tekanan darah tinggi, kerontokan rambut, dan mual [15]. Obat yang menargetkan kanker hati dengan spesifisitas tinggi dan memblokir RAF masih perlu dieksplorasi lebih lanjut.
Reseptor asialoglikoprotein (ASGPR), juga dikenal sebagai reseptor galaktosa hati, adalah lectin tipe C yang diekspresi pada permukaan sinusoidal hepatosit [16]. ASGPR dianggap sebagai target penting untuk nanostruktur hati karena ia memainkan peran penting dalam binding, internalisasi, dan eliminasi zat dengan sisa galaktosa terminal [17]. Beberapa monosakarida (galaktosa, manosa, laktosa, N-asetilgalaktosamin, dan asam sialik) telah dilaporkan berinteraksi dengan ASGPR dengan tingkat yang berbeda, dan galaktosa menunjukkan afinitas yang lebih tinggi untuk ASGPR [18]. Karena ASGPR sangat terpapar pada permukaan sel parenkimatik hati [19], reseptor ini memiliki afinitas yang kuat untuk galaktosa dan prodrog atau sistem pengiriman yang dikonjugasi galaktosa yang menargetkan hati. Nanopartikel galaktosa [20], mikel galaktosa [21], dan liposom galaktosa [22] telah diidentifikasi sebagai sistem pengiriman obat yang menargetkan hati, yang secara spesifik menargetkan sel karsinoid hepatoseluler.
Nanorod emas (GNR) adalah nanopartikel emas berbentuk batang yang memiliki keuntungan signifikan sebagai nanosir [23]. Nanorod emas (GNR) memiliki kompatibilitas biologis yang baik dan dapat digunakan untuk pengiriman siRNA yang stabil [24]; mereka memiliki luas permukaan spesifik yang besar, yang memungkinkan modifikasi fleksibel dari adaptor penargetan tumor spesifik [25]; resonansi plasmon permukaan terlokalisasi (LSPR) memiliki efisiensi konversi fototermal yang tinggi di bawah sinar inframerah dekat dan telah menjadi materi antitumor fototermal yang unggul [26]. Efisiensi fototermal maksimum dapat dicapai dengan menyesuaikan rasio aspek nanorod emas (GNR). Toksikitas in vitro dan in vivo nanopartikel emas bergantung pada ukuran, muatan permukaan, dan lapisan permukaannya [27]. Namun, bromida setiltrimetilamoniun (CTAB) adalah agen aktif penting dalam sintesis nanorod emas, yang memiliki sitorositas yang jelas dan membatasi aplikasi biologis [28].
Interferensi RNA (RNAi) telah menjadi pendekatan yang menjanjikan untuk pengobatan kanker karena ia secara efektif mengalihkan atau menyapu gen target dengan RNA interferensi kecil (siRNA) [29]. Akhirnya, molekul siRNA telah memasuki fase uji manusia dan dianggap sebagai cara yang menjanjikan untuk mengobati kanker dan tumor dengan gen mutant multipe [30]. Namun, aplikasi siRNA masih menghadapi tantangan besar seperti ketidakstabilan serum (degradasi oleh nuklease di lingkungan ekseluler) dan efek off-target [31]. Selain itu, siRNA memiliki muatan negatif, yang mencegahnya terikat pada membran sel yang bermuatan negatif [32]. Karena karakteristik ini, siRNA itu sendiri kemungkinan besar tidak dapat dikirim langsung ke sel. Stabilitas siRNA dapat ditingkatkan dengan modifikasi kimia siRNA atau dengan memasukkan loader siRNA ke dalam materi pembungkus pelindung [33].
Dalam studi ini, kami telah membangun secara baru nanosir multifungsi GAL-GNR-siBRAF. Sistem ini menggunakan nanorod emas dengan kemampuan pembangkitan panas optik sebagai inti dalam dan secara eksternal dimodifikasi GAL (d-galaktosa) dengan penargetan spesifik tumor hati. Sistem ini mengurangi toksikitas biologis CTAB pada permukaan nanorod emas dan menunjukkan kapasitas muatan siRNA yang tinggi dan dapat digunakan untuk menyapu gen BRAF dalam kanker hati secara efektif. Aplikasi GAL-GNR-siBRAF mereduksi proliferasi, invasi, dan migrasi sel kanker hati secara signifikan. Selain itu, GAL-GNR-siBRAF secara bersamaan menginduksi penyapuhan gen BRAF dan efek fototermal yang mencapai efikasi sinergis dalam kemampuan pembunuhan sel tumor, memberikan cara berpikir baru untuk pengembangan pengobatan klinis kanker hati.
Materi dan Metode
Sel Selular
Baris sel karsinoma sel hepatoseluler tikus Hepa1-6 dibeli dari Bank Sel, Akademi Ilmu Pengetahuan China. Sel dikultur dalam medium DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) yang mengandung 10% FBS pada 37 °C dengan 5% CO2.
Sintesis siRNA BRAF
Sekuen siRNA untuk menargetkan gen BRAF adalah 5′-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3′ dan disintesis oleh Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, Amerika Serikat). siRNA target gen luciferase siGL2 yang tersedia secara komersial digunakan sebagai siRNA kontrol negatif.
Sintesis CTAB-GNR
Nanorod emas larut air disintesis menggunakan jalur pertumbuhan berbentuk biji [34]. Larutan biji dibuat sebagai berikut: 1 mL bromida setiltrimetilamoniun (CTAB) (0,2 M) (Sinopharm) dicampur perlahan dengan 1 mL HAuCl4 (0,5 mM) (Sinopharm). Diaduk larutan pada 28 °C, dicampur merata dan ditambahkan 0,12 mL NaBH4 dingin (0,01 M) (Sinopharm) hingga larutan biji yang dihasilkan berwarna coklat dan disimpan dalam cadangan. Larutan pertumbuhan kemudian disintesis sebagai berikut: 50 mL CTAB (0,2 M) dan 50 mL HAuCl4 (1 mM), 2,5 mL AgNO3 (4 mM) (Sinopharm) dicampur perlahan pada 28 °C. Setelah diaduk secara merata dan halus, 670 μL asam askorbat (0,079 M) ditambahkan ketika warna larutan akan berubah dari kuning gelap menjadi warna tidak berwarna. 120 mikroliter larutan biji ditambahkan di bawah pengadukan lembut pada 28 °C, dan warna secara bertahap menjadi transparan dari ungu menjadi ungu-hitam. Setelah diaduk selama 24 jam pada suhu konstan, larutan disenterifikasi pada 12.000 rpm selama 10 menit untuk menghapus CTAB tambahan dan dikeringkan beku vakum menjadi serbuk GNR untuk digunakan di masa depan.
Sintesis MUA-PEI dan GAL-PEI-MUA
Asam merkaptoundesanoat (MUA; 654 mg) dilarutkan dalam 30 mL kloroform (CHCl3) kemudian diinkubasi dengan 100 mmol 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimida hidroklorida (EDC) dan 100 mmol N-hidroksisuksinimid (NHS) selama 15 menit pada suhu kamar. Selanjutnya, 100 mmol polietilenimina (PEI) ditambahkan ke dalam larutan di atas. Setelah reaksi selama 24 jam pada suhu kamar, volume air deion yang sama digunakan untuk mengekstrak PEI-MUA yang larut air. Metode yang sama digunakan untuk menyelesaikan aktivasi d-galaktosa dalam larutan air. Kemudian, d-galaktosa yang diaktifkan berlebih (500 mmol) ditambahkan ke dalam larutan PEI-MUA yang larut air di atas, dan reaksi dilakukan secara cukup pada suhu kamar selama 24 jam untuk mendapatkan kompleks GAL-PEI-MUA yang larut air.
Sintesis GAL-PEI-MUA-GNR (GAL-GNR) dan PEI-MUA-GNR (PEI-GNR)
Serbuk CTAB-GNR yang dikeringkan beku (10 mg) disuspendasi dalam 10 mL kompleks PEI-MUA atau GAL-PEI-MUA yang larut air. CTAB digantikan oleh ikatan Au–S saat diaduk pada suhu kamar selama 24 jam. Larutan disenterifikasi pada 12.000 rpm selama 15 menit untuk menghapus sobrenatan berlebih, dan endapan dicuci tiga kali dengan air tisu. Serbuk PEI-GNR atau GAL-GNR disiapkan dengan pengeringan beku, ditimbang dan dilarutkan dalam air non-ribozima, kemudian efek resonansi plasma diamati oleh analyzer enzim multifungsi (Spectra Max M5e, MD, Amerika Serikat).
Mikroskopi Elektron Transmisi
GNR atau GAL-GNR disuspendasi dalam air tisu, dan suspensi ditempatkan pada grid tembaga. Setelah sampel pada mesh tembaga dikeringkan sepenuhnya di udara selama 30 menit, mesh tembaga diimaging menggunakan mikroskop elektron transmisi (LIBRA 120, Carl Zeiss, Jerman).
Analisis Ultraviolet-Visible
GNR, PEI-GNR, atau GAL-GNR disuspendasi dalam air tisu. Efek resonansi plasma permukaan nanomaterial dalam rentang panjang gelombang 600 hingga 900 nm diperiksa menggunakan pembaca multi-fungsi (SpectraMax M5e, MD, Amerika Serikat).
Analisis Potensi Zeta dan Diameter Hidrodinamik
GNR, PEI-GNR, atau GAL-GNR disuspendasi dalam air tisu, dan kemudian potensi zeta dan diameter hidrodinamik nanomaterial diukur pada Zetasizer Nano ZS.
Analisis Resonansi Magnet Nuklir
Serbuk liofilisasi GAL-GNR dilarutkan dalam air berat (99%, Sigma) untuk membuat suspensi homogen, dan suspensi kemudian dipindahkan ke tab sampel NMR. Komposisi GAL-GNR ditentukan oleh resonansi magnet nuklir (NMR) (Bruker, 600 mHz, Jerman).
Assay Pergeseran Gel
GAL-GNR dan siBRAF dicampur sesuai dengan rasio massa (0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1). Setelah diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit, buffer loading DNA ditambahkan ke dalam campuran. Semua sampel ditambahkan ke gel agarosa 2% yang mengandung 0,01% Goldview (Bioshop, AS) dan kemudian dielektroforesis pada 90 V selama 30 menit. Tingkat pembungkusan siBRAF divisualisasikan pada sistem imaging gel.
Stabilitas siRNA dalam Serum
Campuran GAL-GNR-siBRAF (6:1) diinkubasi dalam serum tikus segar pada 37 °C selama 0 jam, 3 jam, 6 jam, 12 jam, 24 jam, dan 48 jam masing-masing. Grup siRNA telanjang ditambah serum tikus segar diobati dalam kondisi yang sama. Volume yang sama natrium lauril sulfat (SDS) 2% ditambahkan ke dalam larutan GAL-GNR-siBRAF. Setelah diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar, buffer loading DNA ditambahkan, dan semua sampel dimuat ke dalam gel agarosa 2% (yang mengandung 0,02% Goldview (Bioshop, AS)) dan dielektroforesis pada 90 V selama 30 menit. Kecerahan strip siBRAF divisualisasikan pada sistem imaging gel.
Assay Hambatan Kompetitif GAL-GNR-siBRAF
2 × 105 sel Hepa1-6 dikultur dalam mikrolelangka 12 sumur selama semalam. Kemudian, sel diobati terlebih dahulu oleh asam laktobionik selama 12 jam dan kemudian transfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF (dilabeli Cy3) selama 30 menit. Intensitas fluresensi selular ditentukan oleh mikroskop fluresensi (skala bar = 200 μm).
Kemampuan Pengiriman Terpadu Kanker Hati GAL-GNR-siBRAF
Satu mikrogram siBRAF dilabeli cy3 diinkubasi dengan PEI-GNR (30 μg/mL), GAL-GNR (30 μg/mL) selama 20 menit pada suhu kamar, dan kemudian ditambahkan ke medium sel Hepa1-6. Setelah diinkubasi selama 30 menit, sel dicuci dengan 50% FBS selama tiga kali, dan intensitas fluresensi dalam sel diukur di bawah mikroskop fluresensi.
Efek Fototermal
Dua puluh, 40, 60, 80, dan 100 μg GAL-GNR dan 100 μg serbuk liofilisasi GNR secara menyeluruh dilarutkan dalam 1 mL air tisu. Larutan ditambahkan ke mikrolelangka 24 sumur dan secara berkelanjutan diekspos dengan sumber laser inframerah dekat 803 nm (2 W/cm2) selama 15 menit. Suhu setiap kelompok dicatat dengan termometer inframerah setiap 0,5 menit selama 5 menit pertama, dan kemudian suhu ditandai setiap 1 menit.
Assay MTT
Dua ratus mikroliter sel (3,5 × 104/mL) dikultur dalam mikrolelangka 96 sumur selama 24 jam dan kemudian dikultur dengan konsentrasi berbeda GNR atau GAL-GNR (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 μg/mL). Setelah 24 atau 48 jam inkubasi, 20 μL MTT ditambahkan ke dalam sistem kultur dan diinkubasi selama 4 jam tambahan. Kristal ungu dilarutkan dalam 150 μL DMSO, diikuti oleh analisis spektrofotometri pada 490 nm menggunakan referensi 650 nm dalam pembaca mikrolelangka (Spectra Max M5e, MD, AS).
Uji Staining Calcein-AM dan PI
Sel Hepa1-6 (1,5 × 105) disimpan selama semalam dalam mikrolelangka 12 sumur dan diobati dengan PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg), GAL-GNR-siGL2 (30 μg/mL:1 μg) + laser atau GAL-GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg) + laser selama 4 jam, dan kemudian diekspose oleh cahaya inframerah dekat (808 nm, 2 W/cm2) selama 15 menit. Toksikitas sel GAL-GNR terdeteksi oleh uji staining calcein-AM (sel hidup) dan PI (sel mati). Fluresensi hijau calcein-AM dan fluresensi merah PI difoto di bawah mikroskop fluresensi.
Real-Time Quantitative PCR
RNA sel total diekstrak menggunakan Trizol (reagen Trizol, Invitrogen) dan digunakan sebagai templat untuk sintesis cDNA. Q-PCR dilakukan menggunakan primer forward dan reverse spesifik gen (0,5 μL × 10 μM masing-masing) dalam sistem Stratagene Mx3000P qRT-PCR (Agilent Technologies, Lexington, MA, AS). SYBR green PCR MasterMix (Life Technologies) digunakan sesuai skema produsen. Gen pengendali β-actin digunakan sebagai referensi internal. Sekuen primer adalah β-actin: 5′AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′ (forward) dan 5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′ (reverse); BRAF: 5′-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3′ (forward) dan 5′-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3′ (reverse). Perbedaan ekspresi gen dihitung dan ditampilkan dengan metode 2−∆∆Ct.
Western Blot
Protein total sel Hepa1-6 diperoleh oleh buffer RIPA (Cell signaling, Pickering, Ontario, Kanada) dan dikuantifikasi oleh asam bisionikotinat (BCA). Protein dipisahkan dalam SDS-PAGE 12% dan ditransfer ke Polyvinylidenida fluorida (PVDF). Gen pengendali β-actin digunakan sebagai referensi internal untuk mendeteksi ekspresi protein BRAF. Strip protein dan referensi internal dari protein target dideteksi oleh kemiluminesensi ECL.
Uji Garis Panduan
Sel Hepa1-6 yang ditransfeksi (1,7 × 105/mL) ditanam ke dalam mikrolelangka 12 sumur selama semalam. Sel yang telah menempel sepenuhnya pada lelangka digores dengan ujung pipet 10 μL. Sel dicuci dua kali dengan PBS dan diganti dengan medium yang mengandung 2% FBS. Rata-rata garis luka diamati di bawah mikroskop setelah 0, 24, dan 48 jam. Setiap uji garis panduan dilakukan tiga kali.
Assay Transwell untuk Migrasi dan Invasi
Kamber transwell delapan mikrometer (Corning Life Science) digunakan untuk menilai migrasi dan invasi sel. Hepa1-6 yang disuspendasi dalam 200 μL medium bebas serum ditambahkan ke kamber atas dengan densitas 1,7 × 105 mL sel/lelangka, dan kemudian 500 μL medium yang mengandung 12% FBS ditambahkan ke kamber bawah. Setelah diinkubasi selama 24–48 jam, sel diperbaiki dengan larutan paraformaldehida 4% selama 30 menit, dan kemudian sel diwarnai dengan larutan kristal violet 1% selama 30 menit. Akhirnya, sel difoto dan dihitung di bawah mikroskop terbalik. Untuk uji invasi sel, uji invasi sel membutuhkan pelapisan gel ECM, dan langkah-langkah lainnya sama.
Statistika
Semua eksperimen dilakukan tiga kali. Data dinyatakan sebagai mean ± SD dan uji Student’s t (dua sisi) digunakan untuk menentukan perbedaan antara dua metode. Uji one-way ANOVA digunakan untuk perbandingan beberapa grup. Data dianggap signifikan secara statistik pada p < 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).
Hasil
Sintesis dan Karakterisasi Nanosir GAL-GNR-siBRAF
Kami merancang nanosir baru GAL-GNR yang mampu mengirimkan RNA interferensi kecil (siRNA) ke sel hati dan mempertahankan efek fototermal nanorod emas secara bersamaan. Prosedur sintesis GAL-GNR ditunjukkan dalam Skema 1. Sistem penargetan hati ini terdiri dari tiga komponen fungsional. Pertama, bagian dasar GAL-GNR adalah kerangka GNR, yang berukuran sekitar 30 nm panjang dan 10 nm diameter, seperti yang ditunjukkan dalam citra TEM (Gambar 1a) dan GNR yang dikonjugasi kimia (GAL-GNR) tidak menunjukkan perubahan ukuran yang signifikan dan masih memiliki dispersibilitas yang baik (Gambar 1b). Data ukuran partikel menunjukkan bahwa ukuran rata-rata GNR adalah 30,23 nm yang konsisten dengan hasil mikroskop elektron, dan ukuran GAL-GNR (50 nm) dan PEI-GNR (42,35 nm) lebih besar dari GNR karena konjugasi GAL dan PEI meningkatkan hidrasi antara partikel (Gambar 1c). Kedua, CTAB yang biotoksik pada permukaan GNR digantikan oleh MUA-PEI yang bermuatan positif yang dapat dimuat dengan siRNA yang bermuatan negatif. Pengukuran potensi zeta menunjukkan bahwa muatan permukaan GNR meningkat dari 35,6 menjadi 42,7 mV atau 41,8 mV ketika GNR dimodifikasi dengan PEI atau GAL-PEI masing-masing, menunjukkan bahwa GAL-GNR memiliki kemampuan kuat untuk mengikat siRNA (Gambar 1d). Ketiga, kami menerapkan GAL sebagai molekul penunjuk untuk mengonjugasi nanosir GNR, yang dapat digunakan untuk homing spesifik karsinoma sel hepatoseluler. Spektroskopi absorpsi UV-Vis digunakan untuk mendeteksi struktur GNR yang dimodifikasi secara awal. Panjang gelombang spektrum absorpsi awal GNR yang tidak dimodifikasi adalah 763 nm; pergeseran panjang gelombang 7 nm diamati pada awalnya dengan modifikasi MUA-PEI, dan pergeseran 8 nm lagi diamati pada akhir sintesis, ketika modifikasi GNR dengan GAL berhasil (Gambar 1e). Untuk mengonfirmasi GAL dalam sistem nano, citra NMR digunakan untuk menganalisis grup kimia. Hasil menunjukkan bahwa sinyal H galaktosa hanya ditemukan dalam spektrum GAL-GNR pada spektrum hidrogen NMR, yaitu δ: 3,60, 3,65, 3,70, 3,78, 3,90, 4,53. Spektra NMR mengonfirmasi struktur kimia GAL, di mana GAL berhasil dikonjugasi pada permukaan GNR (Gambar 1f).
Prosedur sintesis GAL-GNR. a Proses sintesis MUA-PEI. b Aktivasi d-galaktosa dan reaksi kimia dengan MUA-PEI. c Produk sintesis akhir GAL-GNR
Karakterisasi GNR dan GAL-GNR. a Citra mikro TEM GNR (skala = 0,5 μm/50 nm). b Citra mikro TEM GAL-GNR (skala = 0,5 μm /50 nm). c Analisis ukuran partikel berbagai GNR yang dimodifikasi. d Analisis potensi zeta berbagai GNR yang dimodifikasi (GAL-GNR). e Spektra absorpsi UV–Vis ternormalisasi berbagai GNR yang dimodifikasi dan air. f Spektra absorpsi NMR GAL-GNR
Kemampuan Enkapsulasi siRNA dan Stabilitas GAL-GNR
Kerangka nano GAL-GNR dimodifikasi oleh PEI yang bermuatan positif, yang dapat dikombinasikan dengan siRNA yang bermuatan negatif melalui interaksi elektrostatik. Kami menggunakan assay pergeseran gel untuk mengevaluasi kemampuan pengikatan siRNA GAL-GNR. siRNA bebas dapat bergerak melalui lorong gel sementara siRNA yang terikat melambat atau terhenti sepenuhnya. Selain itu, siRNA yang terikat tidak akan lagi terikat efektif pada bromida, dan oleh karena itu intensitas fluresensi akan menurun sesuai. Hasil elektroforesis gel menunjukkan bahwa rasio optimal untuk memenuhi GAL-GNR dengan siBRAF adalah 6:1 (w/w) (Gambar 2a).
Assay pergeseran gel. a Kapasitas muatan siRNA GAL-GNR. Satu mikrogram siRNA dicampur dalam volume yang sama dengan berbagai rasio massa GAL-GNR. Setelah diinkubasi selama 30 menit, assay migrasi gel digunakan untuk menilai kapasitas muatan siRNA GAL-GNR. b Stabilitas siRNA dalam serum tikus. Satu mikrogram siRNA BARF diinkulasikan dengan GAL-GNR pada rasio massa 1:6 dan kemudian ditambahkan ke serum tikus segar. Setelah reaksi 0, 3, 6, 12, 24, dan 48 jam pada 37 °C, siRNA dari GAL-GNR-siBARF diekstrak oleh 2% SDS dan divisualisasikan dengan Bromida Etidium
siRNA telanjang sangat mudah degradasi, terutama in vivo. Fungsi penting dari sistem pengiriman adalah melindungi siRNA dari degradasi. Oleh karena itu, kami menguji efek pelindung nanosir GAL-GNR pada siRNA dalam serum segar secara berkelanjutan. Dibandingkan siRNA telanjang, siRNA yang terikat disimpan dalam serum untuk waktu yang lebih lama. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2b, siRNA telanjang dapat ada dalam serum hingga 12 jam sementara siRNA yang terikat masih melimpah setelah 48 jam. Hasil ini menunjukkan bahwa GAL-GNR dapat secara efektif mencegah siRNA dari degradasi dalam serum, memastikan pengiriman terpadu in vivo.
Toksikitas Nanomaterial
Toksikitas biologis rendah adalah properti penting lainnya dari nanomaterial, yang memungkinkannya digunakan dalam pengobatan kanker. Untuk mengevaluasi kompatibilitas biologis nanostruktur GAL-GNR baru ini, kami menguji toksikitasnya. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 3, sel mati Hepa1-6 dalam grup yang diobati GNR tidak dimodifikasi diamati pada awalnya pada konsentrasi rendah 30 μg/mL. Setelah diinkubasi dengan 75 μg/mL GNR selama 24 jam, tingkat kematian sel mencapai 56,09%, dan mortalitas meningkat menjadi 75,5% setelah diinkubasi selama 48 jam. Sebaliknya, modifikasi GAL mengurangi toksikitas secara signifikan. Setelah diinkubasi GAL-GNR selama 48 jam, lebih dari 80% sel masih hidup bahkan pada konsentrasi tinggi (105 μg/mL). Data ini menunjukkan bahwa nanosir GAL-GNR memiliki kompatibilitas biologis yang tinggi dibandingkan GNR, memastikan keamanan aplikasi.
Toksikitas GAL-GNR. Sel Hepa1-6 diobati dengan GNR (CTAB-GNR) atau GAL-GNR pada konsentrasi yang ditunjukkan selama 24 atau 48 jam. Kehidupan sel diukur dengan assay MTT (n = 5)
Pengiriman Terpadu siRNA dan Penyapuhan Gen BRAF In Vitro pada Sel Hepatoma
Kemampuan untuk mengirimkan siRNA ke sel kanker adalah salah satu fungsi terpenting dari nanomaterial. Untuk menyelidiki potensi GAL-GNR dalam pengiriman siRNA, kami mendeteksi efikasi penyapuhan gen menggunakan siBRAF yang dimuat oleh GAL-GNR pada sel Hepa1-6. Dibandingkan grup kosong, ekspresi BRAF dalam sel yang ditransfeksi GAL-GNR-siGL2 (kontrol negatif) tidak berubah sementara sel yang ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF menunjukkan penurunan yang signifikan (Gambar 4a). Selain itu, efek penyapuhan bergantung pada dosis, yang berkaitan dengan peningkatan konsentrasi GAL-GNR. Hasil qPCR menunjukkan bahwa konsentrasi ideal GAL-GNR-siBRAF adalah 30 μg/mL, dan efisiensi penyapuhan dapat mencapai 90,29% yang serupa dengan grup lipofectamine 2000 (kontrol positif). Hasil western blot konsisten dengan qPCR, dan ekspresi protein BRAF diturunkan setelah transfeksi 48 jam (Gambar 4b).
Pengiriman terpadu siRNA pada sel hepatoma dan penyapuhan gen BRAF in vitro. a Ekspresi mRNA BRAF setelah transfeksi GAL-GNR-siBRAF. Sel Hepa1-6 ditransfeksi dengan berbagai konsentrasi GA-GNR yang membawa jumlah BRAF siRNA yang sama (1 μg) selama 24 jam. Ekspresi mRNA BRAF ditentukan oleh qPCR. Bar kesalahan mewakili deviasi standar dari tiga eksperimen (***p < 0,001). b Ekspresi protein BRAF dalam Hepa1-6 setelah transfeksi GAL-GNR-siBRAF. Sel Hepa1-6 ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2, atau PBS selama 48 jam, level BRAF dan β-actin ditentukan oleh Western blot. c dan d Kemampuan pengiriman terpadu kanker hati GAL-GNR-siBRAF. Satu mikrogram siBRAF dilabeli cy3 diinkubasi dengan lip2000, PEI-GNR (30 μg/mL), GAL-GNR (30 μg/mL) selama 20 menit pada suhu kamar dan kemudian ditambahkan ke medium sel Hepa1-6. Untuk assay hambatan kompetitif, sel Hepa1-6 diobati terlebih dahulu dengan asam laktobionik selama semalam. Intensitas fluresensi selular diamati di bawah mikroskop fluresensi (skala bar = 200 μm), dan ekspresi mRNA BRAF dikuantifikasi oleh q-PCR. Bar kesalahan mewakili deviasi standar dari tiga eksperimen (*p < 0,05)
Asam laktobionik memiliki struktur yang mirip dengan GAL yang dapat secara kompetitif terikat pada reseptor asialoglikoprotein (ASGPR) yang diekspresi pada permukaan membran sel karsinoma sel hepatoseluler [35]. Untuk mengonfirmasi efisiensi penargetan spesifik GAL-GNR, sel Hepa1-6 diobati terlebih dahulu dengan asam laktobionik dan kemudian ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF. Sel yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol kosong, dan reagen transfeksi klasik lipofectamine 2000 digunakan sebagai kontrol positif. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 4c, intensitas fluresensi merah sel yang ditransfeksi GAL-GNR mirip dengan grup kontrol positif, sementara intensitas fluresensi sel yang ditransfeksi PEI-GNR berkurang secara signifikan. Di sisi lain, sel yang ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF sendiri diamati fluresensi merah Cy3 yang lebih kuat dibandingkan sel Hepa1-6 yang diobati terlebih dahulu dengan asam laktobionik (Gambar 4c), dan hasil qPCR konsisten dengan hasil fluresensi merah (Gambar 4d). Hasil ini lebih mengilustrasikan bahwa GAL secara efektif mempromosikan endositosis siRNA oleh sel Hepa1-6 dan dapat diterapkan sebagai moieti penargetan HCC.
Dampak GAL-GNR-siBRAF pada Proliferasi, Migrasi, dan Invasi Sel Hepa1-6
BRAF memainkan peran penting dalam jalur MAPK, yang bertanggung jawab untuk mengatur proliferasi, migrasi, dan invasi sel [36]. Untuk menilai dampak GAL-GNR-siBRAF pada sel karsinoma sel hepatoseluler, kami menganalisis proliferasi sel dengan assay MTT terlebih dahulu. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 5a, proliferasi sel hepa1-6 yang ditransfeksi GAL-GNR-siBRAF berkurang secara signifikan dibandingkan sel yang diobati GAL-GNR-siGL2 (kontrol negatif) atau PBS. Selanjutnya, kami menyelidiki efek GAL-GNR-siBRAF pada migrasi sel dengan assay gores dan transwell. Dibandingkan sel kontrol negatif, kemampuan migrasi sel Hepa1-6 yang ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF berkurang secara jelas (Gambar 5b–d).
Dampak penyapuhan gen BRAF pada sel Hepa1-6 oleh GAL-GNR-siBRAF. a Proliferasi Sel Hepa1-6. Sel Hepa1-6 ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2, atau PBS, dan proliferasi sel diukur dengan assay MTT (n = 5). Bar kesalahan mewakili deviasi standar dari tiga eksperimen (*p < 0,05). b Uji gores sel Hepa1-6. Sel Hepa1-6 ditransfeksi selama 24 jam seperti yang dijelaskan di atas dan kemudian digores dengan ujung pipet 10 μL. Citra gores sel diambil pada berbagai titik waktu (skala bar = 200 μm). c dan e Migrasi dan invasi sel Hepa1-6. Sel Hepa1-6 ditransfeksi selama 24 jam seperti yang dijelaskan di atas. Kemampuan migrasi dan invasi sel ditentukan oleh assay transwell, dan citra diambil pada berbagai titik waktu (skala bar = 200 μm). d dan f Analisis statistik kolom kemampuan migrasi dan invasi sel (***p < 0,001)
Untuk menyelidiki lebih lanjut potensi GAL-GNR-siBRAF pada invasi, assay transwell dilakukan. Hasil menunjukkan bahwa sel hepa1-6 yang ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF telah secara signifikan mengurangi invasi Hepal-6, dibandingkan dengan GAL-GNR-siGL2 atau PBS (Gambar 5e dan f). Hasil di atas menyiratkan bahwa knockdown gen BRAF menggunakan kompleks GAL-GNR-siBRAF dapat secara efektif mengurangi migrasi dan invasi sel karsinoma sel hepatoseluler.
Pengobatan Kombinasi dengan Efek Fototermal dan Penyapuhan Gen GAL-GNR-siBRAF
Studi kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa nanomaterial emas dapat menghasilkan energi termal di bawah radiasi inframerah dekat [37]; fenomena ini disebut efek fototermal karena properti LSPR GNR. Hasil kami menunjukkan bahwa, seiring bertambahnya konsentrasi GAL-GNR, kapasitas pembangkitan panas GAL-GNR ditingkatkan. Ketika konsentrasi GAL-GNR adalah 100 μg/mL, suhu dengan cepat naik dari 24 hingga lebih dari 60 °C. Selain itu, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam kapasitas pembangkitan panas antara GNR dan GAL-GNR (Gambar 6a).
Efek fototermal yang diinduksi oleh GAL-GNR dan pengobatan kombinasi efek fototermal dan penyapuhan gen pada sel kanker hati. a Sumber laser inframerah dekat 803 nm (2 W/cm2) digunakan untuk menindih larutan GNR, GAL-GNR, atau air tisu (kontrol kosong) selama 15 menit. Suhu terdeteksi oleh termometer inframerah pada berbagai titik waktu. b Sel Hepa1-6 diobati dengan PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 + Laser, atau GAL-GNR-siBRAF + Laser, masing-masing. Fluresensi hijau calcein AM (sel hidup) dan fluresensi merah PI (sel mati) diamati di bawah mikroskop fluresensi
Sistem nano baru GAL-GNR-siBRAF memiliki tiga karakteristik individual: penargetan spesifik kanker hati, penyapuhan gen berbasis siRNA BRAF, dan efek fototermal yang ditawarkan GNR. Oleh karena itu, kami lebih lanjut menyelidiki efek terapeutik sinergis GAL-GNR-siBRAF dalam pengobatan anti-tumor. Sel Hepa1-6 tanpa GAL-GNR mempertahankan kelangsungan hidup yang lebih tinggi bahkan di bawah radiasi inframerah dekat, menunjukkan bahwa laser itu sendiri tidak memiliki efek yang signifikan pada sel tumor. Setelah radiasi laser dilakukan berdasarkan pengobatan GAL-GNR-siGL2, efek fototermal menunjukkan kemampuan pembunuhan yang kuat pada sel Hepa1-6. Meskipun penyapuhan gen BRAF sendiri menginduksi kematian sel, efeknya tidak konklusif. Pengobatan sel dengan nanomaterial GAL-GNR-siGL2 ditambah radiasi laser menghasilkan kemampuan pembunuhan sel yang jauh lebih kuat dibandingkan penyapuhan gen BRAF individu (Gambar 6b). Data ini menunjukkan bahwa penyapuhan gen BRAF dan efek fototermal dapat sinergis meningkatkan potensi pembunuhan sel tumor.
Pembahasan
Kesulitan dalam pengiriman terpadu tumor adalah hambatan utama dalam pengobatan klinis tumor. Studi ini menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa kami telah mengembangkan nanosir multifungsi baru GAL-GNR-siBRAF, dan memiliki banyak keuntungan. GAL-GNR yang dimodifikasi tidak hanya memiliki kompatibilitas biologis yang baik tetapi juga mempertahankan fenomena LSPR kerangka GNR dan masih memiliki kemampuan konversi fototermal yang unggul. GNR yang dimodifikasi dengan GAL dapat menargetkan sel karsinoma sel hepatoseluler melalui ASGPR, yang memiliki potensi besar dalam terapi molekuler terpadu karsinoma sel hepatoseluler. Studi lebih lanjut menunjukkan bahwa penyapuhan gen BRAF menghambat proliferasi, migrasi, dan invasi sel hepatoma. Perlu dicatat bahwa GAL-GNR-siBRAF menunjukkan kemampuan pembunuhan sel yang lebih kuat dalam kombinasi efek fototermal dan penyapuhan gen BRAF.
Interferensi RNA (RNAi) telah menarik perhatian banyak pihak karena peran krusialnya dalam ekspresi dan regulasi gen. Penggunaan siRNA untuk menyapu gen spesifik sekuensi dalam sel kanker untuk terapi gen adalah terapi gen target yang efektif dan spesifik, dan telah menjadi alat terapeutik baru untuk banyak penyakit termasuk kanker [29, 31]. Namun, stabilitas rendah dalam serum dan penyerapan sel yang buruk membatasi siRNA dalam aplikasi klinis [38]. Di sisi lain, siRNA memiliki muatan negatif yang mencegahnya terikat pada membran sel yang bermuatan negatif, dan siRNA itu sendiri kemungkinan besar tidak dapat dikirim langsung ke dalam sel [32, 39]. Selain itu, ada masalah terkait efisiensi transfeksi rendah dan internalisasi sel yang buruk dalam terapi siRNA [40]. Hambatan ini menghambat pengiriman siRNA ke sel target. Untuk meningkatkan stabilitas siRNA dan memperkuat efikasi penyapuhan gen, kami menyintesis nanosir baru, GAL-GNR-siBRAF, yang terdiri dari tiga komponen (Skema 1). Nanosir ini memiliki ukuran molekuler kecil (sekitar 30-nm panjang dan 10-nm diameter) dan dispersibilitas yang baik (Gambar 1). Selain itu, GAL-GNR-siBRAF dapat secara efektif memuat sejumlah besar siRNA pada konsentrasi rendah (Gambar 2a) dan melindungi degradasi siRNA oleh RNase dalam serum; siRNA terbukti stabil selama setidaknya dua hari pada 37 °C dalam kehadiran serum tikus segar (Gambar 2b).
Kompatibilitas biologis yang baik sangat penting untuk nanomaterial yang digunakan dalam bidang bioterapi. CTAB adalah reagen aktif penting dalam sintesis nanorod meski memiliki sitorositas yang jelas yang membatasi aplikasi biologisnya [41]. Untuk mengurangi sitorositas materi, kami memanipulasi GNR dengan modifikasi eksternal PEI yang bermuatan positif dan adaptor penargetan GAL (d-galaktosa). Hasil kami menunjukkan bahwa, dibandingkan GNR yang tidak difungsionalkan, GNR yang dimodifikasi GAL memiliki kompatibilitas biologis yang lebih baik. Kehidupan sel dipertahankan lebih dari 80% bahkan pada konsentrasi sangat tinggi (105 μg/mL) GAL-GNR selama 48 jam (Gambar 3). Selain itu, ukuran molekul kecil dan bentuk silinder nanorod memfasilitasi penetrasi melalui membran sel ke dalam sel [37, 38, 42]. Fenomena ini sangat jelas dalam terapi terpadu sel kanker. Nano-konstruk yang dimodifikasi dengan moieti penargetan galaktosa menghasilkan akumulasi tinggi GAL-GNR-siBRAF dalam sel tumor, menginduksi regulasi turun yang efektif dari ekspresi gen BRAF (Gambar 4). Selain itu, sesuai eksperimen hambatan kompetitif, kami menemukan bahwa GAL-GNR masuk ke sel terutama melalui reseptor permukaan ASGPR sel Hepa1-6 (Gambar 4c).
Telah dilaporkan bahwa HCC dengan ekspresi tinggi BRAF dan RAF1 cenderung memiliki proliferasi dan pertumbuhan yang cepat [41, 43, 44]. B-Raf dan Raf1 terutama bertindak pada downstream jalur ERK/MAPK, mengatur faktor nuklir melalui amplifikasi bertingkat. Aktivasi jalur ini mempercepat proliferasi dan diferensiasi sel HCC secara abnormal [41, 44, 45]. Gen RAF juga dapat mempromosikan ekspresi proteinase matriks metaloproteinase (MMP), yang dapat mengubah adhesi sel tumor, mengurangi matriks selular ekstraseluler (ECM) dan membrana basement, dan mempromosikan invasi dan metastas tumor [44, 45]. Kinase BRAF mengatur jalur RAS-RAF-MEK-ERK, yang mempromosikan proliferasi, invasi, dan metastas sel tumor, dan memungkinkan kematian sel melalui apoptosis [5, 46, 47]. Dalam pekerjaan sebelumnya, kami menemukan bahwa gen BRAF diekspresi tinggi dalam sel Hepa1-6 (data tidak ditunjukkan). Diduga bahwa penurunan ekspresi BRAF dalam Hepa1-6 akan memblokir jalur RAS-RAF-MEK-ERK dan mengakibatkan perubahan biologis Hepa1-6. Untuk memverifikasi hipotesis kami, kami mentransfeksi sel karsinoma sel hepatoseluler dengan GAL-GNR-siBRAF dan menemukan bahwa ia dapat secara signifikan menahan proliferasi, migrasi, dan invasi sel (Gambar 5), menyediakan strategi baru untuk pengobatan klinis karsinoma sel hepatoseluler.
Keuntungan penting lainnya dari GNR adalah memiliki resonansi plasmon permukaan terlokalisasi (LSPR), yang dapat mengubah energi cahaya yang terserap menjadi energi panas di bawah radiasi inframerah dekat, sehingga membunuh dan merusak sel [42]. Kemudian, kami mengeksplorasi kemampuan konversi cahaya-ke-panas GAL-GNR, dan hasil menunjukkan bahwa GAL-GNR yang dimodifikasi dapat secara efektif menginduksi energi panas di bawah radiasi inframerah dekat (Gambar 6a). Selanjutnya, kami lebih lanjut menyelidiki efek sinergis GAL-GNR-siBRAF. Meskipun penyapuhan gen BRAF menunjukkan sitorositas terbatas, pengobatan GAL-GNR-siGL2 + laser memiliki kemampuan pembunuhan yang jauh lebih kuat pada sel tumor. Pada saat yang sama, kombinasi hipotermi fototermal dan penyapuhan gen BRAF dapat menyebabkan lebih dari 85% kematian sel (Gambar 6b) yang menunjukkan bahwa sinergi GAL-GNR-siBRAF dan efek fototermal dapat menjadi strategi ideal untuk menghambat kanker hati.
Kesimpulan
Studi ini menunjukkan bahwa GAL-GNR-siBRAF mengatasi hambatan degradasi siRNA, secara efektif meningkatkan stabilitas siRNA dalam serum in vitro. Selain itu, GAL-GNR-siBRAF dapat secara terpadu mengirimkan siRNA ke sel karsinoma sel hepatoseluler dan menyapu ekspresi BRAF serta menghambat proliferasi, invasi, dan migrasi sel secara signifikan. Yang lebih penting, GAL-GNR-siBRAF, sebagai nanosir multifungsi baru, dapat sangat meningkatkan kemampuan pembunuhan sel tumor ketika dikombinasikan dengan cahaya inframerah dekat. Kesimpulannya, GAL-GNR-siBRAF memiliki potensi besar dalam pengobatan karsinoma sel hepatoseluler dan memberikan ide baru untuk aplikasi klinis kanker hati.
Ketersediaan Data dan Bahan
Semua data dan bahan yang dihasilkan dan digunakan dalam studi ini disertakan dalam naskah dan berkas tambahan yang sesuai.
