Pembungkaman Gen Target BRAF Synergized Photothermal Effect Menghambat Pertumbuhan Sel Hepatoma Menggunakan Sistem Nano GAL-GNR-siBRAF Baru
Abstrak
Kanker hati adalah salah satu keganasan paling umum di seluruh dunia. Inhibitor RAF kinase efektif dalam pengobatan karsinoma hepatoseluler (HCC); oleh karena itu, penghambatan jalur BRAF/MEK/ERK telah menjadi strategi terapi baru untuk terapi HCC baru. Namun, sistem pengiriman spesifik yang ditargetkan untuk tumor masih merupakan kendala signifikan untuk aplikasi klinis. Galaktosa (GAL) dapat menargetkan reseptor asialoglycoprotein (ASGPR) yang sangat diekspresikan pada sel kanker hati. Dalam penelitian ini, kami merancang nanomaterial multifungsi baru GAL-GNR-siBRAF yang terdiri dari tiga bagian, GAL sebagai bagian penargetan kanker hati, golden nanorods (GNR) yang menawarkan kemampuan fototermal di bawah cahaya inframerah dekat, dan siRNA yang secara khusus membungkam BRAF (siBRAF). ). Nanocarrier GAL-GNR-siBRAF menunjukkan kapasitas pemuatan siRNA yang tinggi dan menghambat degradasi siRNA dalam serum. Dibandingkan dengan nanorod emas telanjang, GAL-GNR-siBRAF memiliki biotoksisitas yang lebih rendah dan kemanjuran pembungkaman gen yang lebih tinggi. Pengobatan dengan GAL-GNR-siBRAF secara signifikan menurunkan regulasi ekspresi BRAF dan gangguan proliferasi, migrasi, dan invasi sel kanker hati. Selain itu, efek fototermal kombinatorial dan knockdown BRAF oleh GAL-GNR-siBRAF secara efektif menimbulkan kematian sel tumor. Oleh karena itu, penelitian kami mengembangkan jenis baru bahan nano multi-fungsi GAL-GNR-siBRAF yang ditargetkan untuk pengobatan kanker hati, yang memberikan ide untuk pengembangan metode pengobatan klinis baru.
Pengantar
Karsinoma hepatoseluler (HCC) merupakan masalah kesehatan global yang utama [1]. Ini adalah kanker paling umum keenam di dunia, dan penyebab utama ketiga kematian terkait kanker [2, 3]. Sebagian besar kasus HCC terjadi di Asia Timur dan Afrika sub-Sahara. Namun, insidennya telah meningkat di beberapa negara maju, termasuk Perancis, Inggris, Jepang, dan Amerika Serikat [4]. Pengobatan standar untuk HCC dini adalah reseksi bedah tumor. Setelah operasi, tingkat kelangsungan hidup 5 tahun dapat berkisar antara 89 hingga 93% [5]. Sayangnya, hanya sebagian kecil pasien HCC (sekitar 20-30%) yang didiagnosis pada tahap awal; sebagian besar pasien HCC (> 70%) ditemukan pada stadium lanjut dan tidak dapat menjalani reseksi bedah. Pilihan pengobatan lain termasuk transplantasi hati, kemoembolisasi arteri transkateter (TACE), dan kemoterapi sistemik [6]. Namun, transplantasi hati dibatasi oleh suplai, dan embolisasi TACE yang tidak lengkap dapat menyebabkan kegagalan pengobatan, dengan efek samping yang signifikan dari kemoterapi sistemik, dan prognosis keseluruhan yang buruk. Oleh karena itu, metode pengobatan baru untuk karsinoma hepatoseluler sangat menuntut secara klinis [7].
Jalur pensinyalan RAS/RAF memainkan peran penting dalam perkembangan kanker hati, dan BRAF adalah salah satu gen penting terkait kanker dalam jalur ini. Perubahan genetik pada gen ini sering mengakibatkan dua gangguan berjenjang. Aktivasi abnormal dari jalur pensinyalan RAS/RAF dikaitkan dengan prognosis yang buruk pada pasien kanker [8]. BRAF adalah gen yang paling sering bermutasi dalam keluarga RAF, dan menargetkan jalur RAS/RAF adalah strategi terapi baru untuk pengobatan HCC [8,9,10]. Sejak RAF kinase inhibitor sorafenib telah terbukti berguna dalam pengobatan HCC, dengan demikian, mutasi BRAF telah menjadi target pilihan untuk terapi HCC [8]. Lebih khusus, mutasi BRAF telah menjadi target yang diinginkan untuk pengobatan HCC lanjut, karena perkembangan klinis dari RAF kinase inhibitor sorafenib telah ditemukan dalam pengobatan HCC di Asia, Eropa, dan Amerika Serikat [11]. Dibandingkan dengan plasebo, sorafenib meningkatkan kelangsungan hidup secara keseluruhan memperpanjang kelangsungan hidup keseluruhan rata-rata pasien dengan HCC lanjut [12,13,14]. Namun, sorafenib memiliki kemampuan penargetan tumor yang buruk, yang dapat menyebabkan efek samping yang merugikan seperti tekanan darah tinggi, rambut rontok, dan mual [15]. Obat yang menargetkan kanker hati dengan spesifisitas tinggi dan memblokir RAF masih harus dieksplorasi lebih lanjut.
Reseptor asialoglikoprotein (ASGPR), juga dikenal sebagai reseptor galaktosa hati, adalah lektin tipe-C yang diekspresikan pada permukaan sinusoidal hepatosit [16]. ASGPR dianggap sebagai target penting untuk struktur nano hati karena memainkan peran penting dalam mengikat, internalisasi, dan eliminasi zat dengan residu galaktosa terminal [17]. Beberapa monosakarida (galaktosa, manosa, laktosa, N-asetilgalaktosamin, dan asam sialat) telah dilaporkan berinteraksi dengan ASGPR dalam berbagai derajat, dan galaktosa menunjukkan afinitas yang lebih tinggi terhadap ASGPR [18]. Karena ASGPR sangat terpapar pada permukaan sel parenkim hati [19], reseptor memiliki afinitas yang kuat untuk produk galaktosa dan galaktosilasi atau sistem pengiriman yang menargetkan hati. Nanopartikel galaktosa [20], misel galaktosa [21], dan liposom galaktosa [22] telah diidentifikasi sebagai sistem obat penargetan hati, yang menargetkan secara khusus untuk sel karsinoid hepatoseluler.
Gold nanorods (GNR) adalah nanopartikel emas berbentuk batang yang memiliki keunggulan signifikan sebagai nanocarrier [23]. Nanorod emas (GNR) memiliki biokompatibilitas yang sangat baik dan dapat digunakan untuk pengiriman siRNA yang stabil [24]; mereka memiliki luas permukaan spesifik yang besar, yang memungkinkan modifikasi fleksibel dari adaptor penargetan tumor tertentu [25]; resonansi plasmon permukaan terlokalisasi (LSPR) memiliki efisiensi konversi fototermal yang tinggi di bawah iradiasi cahaya inframerah-dekat dan telah menjadi bahan anti-tumor fototermal yang sangat baik [26]. Efisiensi fototermal maksimum dapat dicapai dengan menyesuaikan rasio aspek nanorod emas (GNR). Toksisitas in vitro dan in vivo dari nanopartikel emas tergantung pada ukuran, muatan permukaan, dan lapisan permukaannya [27]. Namun, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) adalah zat aktif penting dalam sintesis nanorod emas, yang memiliki sitotoksisitas yang jelas dan membatasi aplikasi biologis [28].
Interferensi RNA (RNAi) telah menjadi pendekatan yang menjanjikan untuk pengobatan kanker karena secara efektif melumpuhkan atau membungkam gen target dengan RNA pengganggu kecil (siRNA) [29]. Baru-baru ini, molekul siRNA telah memasuki fase percobaan manusia dan dianggap sebagai cara yang menjanjikan untuk mengobati beberapa kanker dan tumor gen mutan [30]. Namun, penerapan siRNA masih menghadapi tantangan besar seperti ketidakstabilan serum (degradasi oleh nuklease di lingkungan ekstraseluler) dan efek di luar target [31]. Selain itu, siRNA bermuatan negatif, yang mencegahnya mengikat membran sel bermuatan negatif [32]. Karena karakteristik ini, siRNA sendiri tidak mungkin dikirim langsung ke sel. Stabilitas siRNA dapat ditingkatkan dengan modifikasi kimia siRNA atau dengan memasukkan loader siRNA ke dalam bahan pembawa pelindung [33].
Dalam penelitian ini, kami baru saja membangun nanocarrier multifungsi GAL-GNR-siBRAF. Sistem ini menggunakan nanorod emas dengan kemampuan menghasilkan panas optik sebagai inti dalam dan GAL (d-galaktosa) yang dimodifikasi secara eksternal dengan penargetan spesifik tumor hati. Sistem ini mengurangi toksisitas biologis CTAB pada permukaan nanorod emas dan menunjukkan kapasitas pemuatan siRNA yang tinggi dan dapat digunakan untuk membungkam gen BRAF pada kanker hati secara efektif. Penerapan GAL-GNR-siBRAF melemahkan proliferasi, invasi, dan migrasi sel kanker hati secara signifikan. Selain itu, GAL-GNR-siBRAF secara bersamaan menginduksi pembungkaman gen BRAF dan efek fototermal yang mencapai kemanjuran sinergis dalam kemampuan membunuh sel tumor, memberikan cara berpikir baru untuk pengembangan pengobatan klinis kanker hati.
Materi dan Metode
Baris Sel
Garis sel karsinoma hepatoseluler tikus Hepa1-6 dibeli dari Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences. Sel dikultur dalam media DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) yang mengandung 10% FBS pada 37 °C dengan 5% CO2 .
Sintesis BRAF siRNA
Urutan untuk siRNA yang menargetkan gen BRAF adalah 5′-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3′ dan disintesis oleh Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). Gen luciferase target siGL2 yang tersedia secara komersial digunakan sebagai siRNA kontrol negatif.
Sintesis CTAB-GNR
Nanorods emas yang larut dalam air disintesis menggunakan jalur pertumbuhan yang dimediasi benih [34]. Larutan benih dibuat sebagai berikut:1 mL cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (0,2 M) (Sinopharm) dicampur dengan lembut dengan 1 mL HAuCl4 (0,5 mM) (Sinofarm). Aduk larutan pada suhu 28 °C, aduk rata dan tambahkan 0,12 mL NaBH dingin4 (0,01 M) (Sinopharm) sampai larutan benih yang diperoleh berubah warna menjadi coklat dan tetap dalam cadangan. Larutan pertumbuhan kemudian disintesis sebagai berikut:50 mL CTAB (0,2 M) dan 50 mL HAuCl4 (1 mM), 2,5 mL AgNO3 (4 mM) (Sinopharm) dicampur ringan pada suhu 28 °C. Setelah pencampuran ringan menyeluruh, 670 μL asam askorbat (0,079 M) ditambahkan ketika warna larutan akan berubah dari kuning tua menjadi tidak berwarna. Seratus dua puluh mikroliter larutan benih ditambahkan dengan pengadukan lembut pada suhu 28 °C, dan warnanya berangsur-angsur menjadi transparan dari ungu menjadi ungu-hitam. Setelah 24 jam pengadukan pada suhu konstan, larutan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit untuk menghilangkan CTAB tambahan dan dikeringkan dengan vakum menjadi bubuk GNR untuk penggunaan selanjutnya.
Sintesis MUA-PEI dan GAL-PEI-MUA
Asam merkaptondekanoat (MUA; 654 mg) dilarutkan dalam 30 mL kloroform (CHCl3 ) dan kemudian diinkubasi dengan 100 mmol 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimida hidroklorida (EDC) dan 100 mmol N-hidroksisuksinimida (NHS) selama 15 menit pada suhu kamar. Selanjutnya, 100 mmol polyethyleneimine (PEI) ditambahkan ke dalam larutan di atas. Setelah reaksi 24 jam pada suhu kamar, volume air deionisasi yang sama digunakan untuk mengekstrak PEI-MUA yang larut dalam air. Metode yang sama digunakan untuk menyelesaikan aktivasi d-galaktosa dalam larutan berair. Kemudian, kelebihan d-galaktosa teraktivasi (500 mmol) ditambahkan ke larutan PEI-MUA yang larut dalam air di atas, dan reaksi cukup dilakukan pada suhu kamar selama 24 jam untuk mendapatkan GAL-PEI-MUA yang larut dalam air. kompleks.
Sintesis GAL-PEI-MUA-GNR (GAL-GNR) dan PEI-MUA-GNR (PEI-GNR)
Serbuk CTAB-GNR beku-kering (10 mg) disuspensikan dalam 10 mL kompleks PEI-MUA atau GAL-PEI-MUA yang larut dalam air. CTAB digantikan oleh ikatan Au–S ketika diaduk pada suhu kamar selama 24 jam. Solusinya disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit untuk menghilangkan kelebihan supernatan, dan endapan dicuci tiga kali dengan air suling. Serbuk PEI-GNR atau GAL-GNR dibuat dengan pengeringan beku, ditimbang dan dilarutkan dalam air non-ribozim, dan kemudian efek resonansi plasma diamati dengan penganalisis enzim multifungsi (Spectra Max M5e, MD, USA).
Mikroskop Transmisi Elektron
GNR atau GAL-GNR disuspensikan dalam air suling, dan resuspensi ditempatkan pada kisi tembaga. Setelah sampel pada kasa tembaga benar-benar dikeringkan di udara selama 30 menit, kasa tembaga dicitrakan menggunakan mikroskop elektron transmisi (LIBRA 120, Carl Zeiss, Jerman).
Analisis yang Terlihat Ultraviolet
GNR, PEI-GNR, atau GAL-GNR disuspensikan dalam air suling. Efek resonansi plasmon permukaan bahan nano dalam rentang panjang gelombang 600 hingga 900 nm diperiksa menggunakan pembaca pelat mikro multi-fungsi (SpectraMax M5e, MD, USA).
Analisis Potensi Zeta dan Diameter Hidrodinamik
GNR, PEI-GNR, atau GAL-GNR disuspensikan dalam air suling, dan kemudian potensial zeta dan diameter hidrodinamik nanomaterial diukur pada Zetasizer Nano ZS.
Analisis Resonansi Magnetik Nuklir
Bubuk terliofilisasi GAL-GNR dilarutkan dalam air berat (99%, Sigma) untuk membuat suspensi yang homogen, dan suspensi tersebut kemudian dipindahkan ke tabung sampel NMR. Komposisi GAL-GNR ditentukan oleh resonansi magnetik nuklir (NMR) (Bruker, 600mhz, Jerman).
Uji Pergeseran Gel
GAL-GNR dan siBRAF dicampur sesuai dengan rasio massa (0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1). Setelah inkubasi pada suhu kamar selama 30 menit, buffer pemuatan DNA ditambahkan ke dalam campuran. Semua sampel ditambahkan ke gel agarosa 2% yang mengandung 0,01% Goldview (Bioshop, USA) dan kemudian dielektroforesis pada 90 V selama 30 min. Tingkat pembungkus siBRAF divisualisasikan pada sistem pencitraan gel.
Stabilitas siRNA dalam Serum
Campuran GAL-GNR-siBRAF (6:1) diinkubasi dalam serum murine segar pada suhu 37 °C masing-masing selama 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, dan 48 h. SiBRAF telanjang ditambah kelompok serum murine segar diperlakukan dalam kondisi yang sama. Volume yang sama dari 2% natrium dodesil sulfat (SDS) ditambahkan ke larutan GAL-GNR-siBRAF. Setelah inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar, buffer pemuatan DNA ditambahkan, dan semua sampel dimasukkan ke dalam gel agarosa 2% (mengandung 0,02% Goldview (Bioshop, USA)) dan dielektroforesis pada 90 V selama 30 menit. Kecerahan strip siBRAF divisualisasikan pada sistem pencitraan gel.
Uji Inhibisi Kompetitif GAL-GNR-siBRAF
2 × 10
5
Sel Hepa1-6 dikultur dalam pelat mikro 12-sumur semalaman. Kemudian, sel-sel diperlakukan sebelumnya dengan asam Lactobionic selama 12 h dan kemudian ditransfeksi dengan GAL-GNR--siBRAF (berlabel Cy3) selama 30 min. Intensitas fluoresensi intraseluler ditentukan dengan mikroskop fluoresensi (bilah skala =200 μm).
Kemampuan Pengiriman Bertarget Kanker Hati dari GAL-GNR-siBRAF
Satu mikrogram siBRAF berlabel cy3 diinkubasi dengan PEI-GNR (30 μg/mL), GAL-GNR (30 μg/mL) selama 20 min pada suhu kamar, dan kemudian ditambahkan ke media sel Hepa1-6. Setelah inkubasi selama 30 menit, sel dicuci dengan 50% FBS selama tiga kali, dan intensitas fluoresensi dalam sel diukur di bawah mikroskop fluoresensi.
Efek Fototermal
Dua puluh, 40, 60, 80, dan 100 μg GAL-GNR dan 100 μg bubuk lyophilized GNR dilarutkan secara menyeluruh dalam 1 mL air suling. Solusinya ditambahkan ke pelat 24-sumur dan terus disinari dengan sumber laser inframerah-dekat 803 nm (2 W/cm
2
) selama 15 menit. Suhu masing-masing kelompok dicatat dengan termometer inframerah setiap 0,5 menit selama 5 menit pertama, dan kemudian suhu ditandai setiap 1menit.
Pengujian MTT
Dua ratus mikroliter sel (3,5 × 10
4
/mL) dikultur dalam 96-sumur mikro selama 24 h dan kemudian dikultur dengan konsentrasi yang berbeda dari GNR atau GAL-GNR (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 μg/mL). Setelah inkubasi 24 atau 48 jam, 20 μL MTT ditambahkan ke sistem kultur dan diinkubasi selama 4 jam tambahan. Kristal ungu dilarutkan dalam 150 μL DMSO, diikuti dengan analisis spektrofotometri pada 490 nm menggunakan referensi 650 nm dalam pembaca lempeng mikro (SpectraMax M5e, MD, USA).
Uji Pewarnaan Calcein-AM dan PI
Sel Hepa1-6 (1,5 × 10
5
) disimpan semalaman di piring 12-sumur dan dirawat dengan PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg), GAL-GNR-siGL2 (30 μg/mL:1 μg) + laser atau GAL -GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg) + laser selama 4 h, lalu disinari dengan cahaya inframerah dekat (808 nm, 2 W/cm
2
) selama 15 menit. Sitotoksisitas GAL-GNR dideteksi dengan eksperimen pewarnaan calcein-AM (sel hidup) dan PI (sel mati). Fluoresensi hijau calcein-AM dan fluoresensi merah PI difoto di bawah mikroskop fluoresensi.
PCR Kuantitatif Waktu Nyata
Total RNA seluler diekstraksi menggunakan Trizol (reagen Trizol, Invitrogen) dan digunakan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA. Q-PCR dilakukan menggunakan primer maju dan mundur spesifik-gen (masing-masing 0,5 μL × 10 μM) dalam sistem qRT-PCR Stratagene Mx3000P (Agilent Technologies, Lexington, MA, USA). SYBR green PCR MasterMix (Life Technologies) digunakan sesuai dengan skema pabrikan. Gen rumah tangga -aktin digunakan sebagai referensi internal. Urutan primernya adalah -aktin:5′AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′ (maju) dan 5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′ (mundur); BRAF:5′-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3′ (maju) dan 5′-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3 (mundur). Perbedaan ekspresi gen dihitung dan ditampilkan dengan 2
−∆∆Ct
metode.
Western Blot
Protein total sel Hepa1-6 diperoleh dengan buffer RIPA (Pensinyalan sel, Pickering, Ontario, Kanada) dan diukur dengan asam bicinchoninic (BCA). Protein dipisahkan dalam 12% SDS-PAGE dan dipindahkan ke Polyvinylidene fluoride (PVDF). Gen housekeeping -actin digunakan sebagai referensi internal untuk mendeteksi ekspresi protein BRAF. Pita protein dan referensi internal dari protein target dideteksi oleh chemiluminescence ECL.
Uji Gores
Hepa1-6(1,7 × 10
5
yang ditransfeksikan /mL) sel diunggulkan ke dalam pelat 12-sumur semalaman. Sel yang benar-benar menempel pada pelat digores dengan ujung pipet 10 L. Sel-sel dicuci dua kali dengan PBS dan diganti dengan media yang mengandung 2% FBS. Rata-rata garis luka diamati di bawah mikroskop setelah 0, 24, dan 48 h. Setiap tes awal dilakukan dalam rangkap tiga.
Pengujian Transwell untuk Migrasi dan Invasi
Ruang transwell delapan mikrometer (Corning Life Science) digunakan untuk menilai migrasi dan invasi sel. Hepa1-6 yang tersuspensi dalam 200 μL medium bebas serum ditambahkan ke ruang atas dengan kepadatan 1,7 × 10
5
mL sel/sumur, kemudian 500 μL medium yang mengandung 12% FBS ditambahkan ke ruang bawah. Setelah inkubasi selama 24-48 jam, sel difiksasi dengan larutan paraformaldehyde 4% selama 30 menit, dan kemudian sel diwarnai dengan larutan kristal violet 1% selama 30 menit. Akhirnya, sel-sel difoto dan dihitung di bawah mikroskop terbalik. Untuk pengujian invasi sel, eksperimen invasi sel memerlukan pelapisan gel ECM, dan langkah-langkah selanjutnya konsisten.
Statistik
Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Data dinyatakan sebagai mean ± SD dan t . Siswa test (two-tailed) untuk mengetahui perbedaan antara kedua metode. Tes ANOVA satu arah digunakan untuk perbandingan beberapa kelompok. Data dianggap signifikan secara statistik pada p <0,05 (*p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001.
Hasil
Sintesis dan Karakterisasi Nanocarrier GAL-GNR-siBRAF
Kami merancang GAL-GNR nanocarrier baru yang mampu mengirimkan RNA pengganggu kecil (siRNA) ke sel hati dan mempertahankan efek fototermal nanorod emas secara bersamaan. Prosedur sintesis GAL-GNR ditunjukkan pada Skema 1. Sistem target hati ini mengandung tiga komponen fungsional. Pertama, bagian dasar dari GAL-GNR adalah kerangka GNR, yang panjangnya sekitar 30 nm dan diameter 10 nm, seperti yang ditunjukkan pada gambar TEM (Gbr. 1a) dan GNR terkonjugasi secara kimia (GAL-GNR) tidak menunjukkan hasil yang signifikan. perubahan dimensi dan masih memiliki dispersibilitas yang baik (Gbr. 1b). Data ukuran partikel menunjukkan bahwa ukuran rata-rata GNR adalah 30,23 nm yang sesuai dengan hasil mikroskop elektron, dan ukuran GAL-GNR (50 nm) dan PEI-GNR (42,35 nm) lebih besar dari GNR karena konjugasi GAL dan PEI meningkatkan hidrasi antar partikel (Gbr. 1c). Kedua, CTAB toksik biologis pada permukaan GNR digantikan oleh MUA-PEI bermuatan positif yang dapat dimuat dengan siRNA bermuatan negatif. Pengukuran potensial zeta menunjukkan bahwa muatan permukaan GNR meningkat dari 35,6 menjadi 42,7 mV atau 41,8 mV ketika GNR masing-masing dimodifikasi dengan PEI atau GAL-PEI, yang menunjukkan bahwa GAL-GNR memiliki kemampuan yang kuat untuk mengikat siRNA (Gbr. 1d). Ketiga, kami menerapkan GAL sebagai molekul pemandu untuk mengkonjugasikan nanocarrier GNR, yang dapat digunakan untuk homing spesifik karsinoma hepatoseluler. Spektroskopi serapan UV-Vis digunakan untuk mendeteksi struktur GNR yang dimodifikasi terlebih dahulu. Panjang gelombang spektrum serapan awal dari GNR yang tidak dimodifikasi adalah 763 nm; pergeseran panjang gelombang 7 nm diamati pada awalnya dengan modifikasi MUA-PEI, dan pergeseran 8 nm lainnya diamati pada akhir sintesis, ketika modifikasi GNR dengan GAL berhasil (Gbr. 1e). Untuk mengkonfirmasi GAL dalam sistem nano, gambar NMR digunakan untuk menganalisis kelompok kimia. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sinyal H galaktosa hanya terdapat pada spektrum GAL-GNR pada spektrum hidrogen NMR, yaitu :3.60, 3.65, 3.70, 3.78, 3.90, 4.53. Spektrum NMR mengkonfirmasi struktur kimia GAL, di mana GAL berhasil terkonjugasi ke permukaan GNR (Gbr. 1f).
Prosedur sintetis GAL-GNR. a Proses sintetik MUA-PEI. b Aktivasi d-galaktosa dan reaksi kimia dengan MUA-PEI. c Produk sintetis akhir GAL-GNR
Karakterisasi GNR dan GAL-GNR. a Mikrograf TEM GNR (skala =0,5 μm/50 nm). b Mikrograf TEM GAL-GNR (skala =0,5 μm / 50 nm). c Analisis ukuran partikel dari GNR termodifikasi yang berbeda. d Analisis potensi Zeta dari GNR yang dimodifikasi berbeda (GAL-GNR). e Spektrum penyerapan UV-Vis yang dinormalisasi dari GNR dan air termodifikasi yang berbeda. f Spektrum serapan NMR dari GAL-GNR
Kemampuan Enkapsulasi siRNA dan Stabilitas GAL-GNR
Kerangka nano GAL-GNR dimodifikasi oleh PEI bermuatan positif, yang dapat dikombinasikan dengan siRNA bermuatan negatif melalui interaksi elektrostatik. Kami menggunakan uji pergeseran gel untuk mengevaluasi kemampuan pengikatan siRNA dari GAL-GNR. SiRNA bebas dapat bergerak di sepanjang jalur gel sementara siRNA yang terikat diperlambat atau dihentikan sama sekali. Selain itu, siRNA yang terikat tidak akan lagi mengikat secara efektif ke bromida, dan dengan demikian, intensitas fluoresensi akan berkurang. Hasil elektroforesis gel menunjukkan bahwa rasio optimal untuk penjenuhan GAL-GNR dengan siBRAF adalah 6:1 (b/b) (Gbr. 2a).
Tes pergeseran gel. a kapasitas pemuatan siRNA dari GAL-GNR. Satu mikrogram siRNA dicampur dalam volume yang sama dengan rasio massa GAL-GNR yang berbeda. Setelah inkubasi selama 30 menit, uji migrasi gel digunakan untuk menilai kapasitas pemuatan siRNA dari GAL-GNR. b Stabilitas siRNA dalam serum tikus. Satu mikrogram BARF siRNA diinokulasi dengan GAL-GNR pada rasio massa 1:6 dan kemudian ditambahkan ke serum murine segar. Setelah reaksi 0, 3, 6, 12, 24, dan 48 h pada 37 °C, siRNA dari GAL-GNR-siBARF diekstraksi dengan 2% SDS dan divisualisasikan dengan Ethidium Bromide
SiRNA telanjang sangat mudah terdegradasi, terutama in vivo. Fungsi penting dari sistem pengiriman adalah untuk melindungi siRNA dari degradasi. Dengan demikian, kami menguji efek perlindungan nanocarrier GAL-GNR pada siRNA dalam serum segar sebagai akibatnya. Dibandingkan dengan siRNA telanjang, siRNA terikat disimpan dalam serum untuk jangka waktu yang lebih lama. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2b, siRNA telanjang bisa ada dalam serum hingga 12 jam sementara siRNA terikat masih berlimpah setelah 48 jam. Hasilnya menunjukkan bahwa GAL-GNR dapat secara efektif mencegah siRNA terdegradasi dalam serum, memastikan pengiriman yang ditargetkan secara in vivo.
Sitotoksisitas Nanomaterial
Toksisitas biologis yang rendah adalah sifat penting lain dari nanomaterial, yang memungkinkan mereka untuk digunakan dalam pengobatan kanker. Untuk mengevaluasi biokompatibilitas struktur nano GAL-GNR baru ini, kami menguji sitotoksisitasnya. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, sel-sel mati Hepa1-6 pada kelompok yang diobati dengan GNR yang tidak dimodifikasi diamati pada awalnya pada konsentrasi rendah 30 μg/mL. Setelah inkubasi dengan 75 μg/mL GNR selama 24 jam, tingkat kematian sel naik menjadi 56,09%, dan kematian meningkat menjadi 75,5% setelah inkubasi selama 48 jam. Sebaliknya, modifikasi GAL mengurangi sitotoksisitas secara signifikan. Setelah menginkubasi GAL-GNR selama 48 h, lebih dari 80% sel masih hidup bahkan pada konsentrasi tinggi (105 μg/mL). Data ini menunjukkan bahwa nanocarrier GAL-GNR memiliki biokompatibilitas tinggi dibandingkan dengan GNR, memastikan keamanan aplikasi.
Toksisitas GAL-GNR. Sel Hepa1-6 diobati dengan GNR (CTAB-GNR) atau GAL-GNR selama 24 atau 48 h pada konsentrasi yang ditunjukkan. Viabilitas sel diukur dengan uji MTT (n =5)
Pengiriman siRNA yang Ditargetkan Sel Hepatoma dan Pembungkaman Gen BRAF In Vitro
Kapasitas untuk mengirimkan siRNA ke dalam sel kanker adalah salah satu fungsi terpenting dari bahan nano. Untuk menyelidiki potensi GAL-GNR dalam pengiriman siRNA, kami mendeteksi kemanjuran pembungkaman gen menggunakan siBRAF yang dimuat oleh GAL-GNR dalam sel Hepa1-6. Dibandingkan dengan kelompok kosong, ekspresi BRAF dalam sel yang ditransfeksi GAL-GNR-siGL2 (kontrol negatif) tidak mengalami perubahan sedangkan sel yang ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF mengalami penurunan yang signifikan (Gbr. 4a). Selain itu, efek pembungkaman bergantung pada dosis, yang berkorelasi dengan peningkatan konsentrasi GAL-GNR. Hasil qPCR menunjukkan bahwa konsentrasi ideal transfeksi GAL-GNR-siBRAF adalah 30 μg/mL, dan efisiensi peredaman dapat mencapai 90,29% yang serupa dengan kelompok lipofectamine 2000 (kontrol positif). Hasil western blot konsisten dengan qPCR, dan ekspresi protein BRAF diturunkan regulasinya setelah transfeksi 48 jam (Gbr. 4b).
Pengiriman siRNA yang ditargetkan sel hepatoma dan pembungkaman gen BRAF in vitro a MRNA ekspresi BRAF setelah transfeksi GAL-GNR-siBRAF. Sel Hepa1-6 ditransfeksi dengan berbagai konsentrasi GA-GNR yang membawa jumlah BRAF siRNA (1 μg) yang sama selama 24 h. Ekspresi BRAF mRNA ditentukan dengan qPCR. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari tiga eksperimen (***p <0,001). b Ekspresi protein BRAF dalam Hepa1-6 setelah transfeksi GAL-GNR-siBRAF. Sel Hepa1-6 ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2, atau PBS selama 48 h, kadar BRAF dan -aktin ditentukan oleh Western blot. c dan d Kemampuan pengiriman GAL-GNR-siBRAF yang ditargetkan untuk kanker hati. Satu mikrogram siBRAF berlabel cy3 diinkubasi dengan lip2000, PEI-GNR (30 μg/mL), GAL-GNR (30 μg/mL) selama 20 min pada suhu kamar dan kemudian ditambahkan ke media sel Hepa1-6. Untuk uji penghambatan kompetitif, sel Hepa1-6 diberi pra-perawatan dengan asam Lactobionic semalaman. Intensitas fluoresensi intraseluler diamati di bawah mikroskop fluoresensi (bilah skala =200 μm), dan ekspresi mRNA BRAF dikuantifikasi dengan q-PCR. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari tiga percobaan (*p <0,05)
Asam laktobionat mirip dengan GAL dalam struktur yang dapat secara kompetitif dikombinasikan dengan reseptor asialoglycoprotein (ASGPR) yang diekspresikan pada permukaan membran sel karsinoma hepatoseluler [35]. Untuk mengkonfirmasi efisiensi penargetan spesifik GAL-GNR, sel Hepa1-6 diinkubasi sebelumnya dengan asam laktobionat dan kemudian ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF. Sel yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol kosong, dan reagen transfeksi klasik lipofectamine 2000 digunakan sebagai kontrol positif. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4c, intensitas fluoresensi merah sel yang ditransfeksi GAL-GNR mirip dengan kelompok kontrol positif, sedangkan intensitas fluoresensi sel yang ditransfeksi PEI-GNR berkurang secara signifikan. Di sisi lain, sel yang ditransfeksi dengan GAL-GNR-siBRAF saja diamati fluoresensi merah Cy3 yang lebih kuat daripada sel Hepa1-6 yang diberi asam laktobionat (Gbr. 4c), dan hasil qPCR konsisten dengan hasil fluoresensi merah ( Gambar 4d). Hasil ini lebih lanjut menggambarkan bahwa GAL secara efektif mempromosikan endositosis siRNA oleh sel Hepa1-6 dan dapat diterapkan sebagai bagian HCC yang ditargetkan.
Dampak GAL-GNR-siBRAF pada Proliferasi, Migrasi, dan Invasi sel Hepa1-6
BRAF memainkan peran penting dalam jalur MAPK, yang bertanggung jawab untuk mengatur proliferasi sel, migrasi, dan invasi [36]. Untuk menilai dampak GAL-GNR-siBRAF pada sel karsinoma hepatoseluler, kami menganalisis proliferasi sel dengan uji MTT terlebih dahulu. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, proliferasi sel hepa1-6 yang ditransfeksi GAL-GNR-siBRAF secara signifikan menurun dibandingkan dengan sel yang diberi perlakuan GAL-GNR-siGL2 (kontrol negatif) atau PBS. Next, we investigated the effect of GAL-GNR-siBRAF on cell migration by scratch and transwell assays. Compared with negative control cells, the migration ability of Hepa1-6 cells that transfected with GAL-GNR-siBRAF was evidently reduced (Fig. 5b–d).
The impact of silencing BRAF gene on Hepa1-6 cells by GAL-GNR-siBRAF. a Proliferation of Hepa1-6 Cells. Hepa1-6 cells were transfected with GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2, or PBS, and the cell proliferation was measured by MTT assay (n =5). The error bar represents the standard deviation of three experiments (*p <0,05). b Scratch test of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above and then scraped with a 10 μL tip. The cell scratch images were taken at different time points (scale bar =200 μm). c dan e Migration and invasion of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above. Cell migration and invasion ability was determined by transwell assay, and imagines were taken at different time points (scale bar =200 μm). d dan f Columnar statistical analysis of cell migration and invasive capacity (***p <0.001)
To further investigate the potential of GAL-GNR-siBRAF on the invasion, transwell assays were performed. The results showed that hepa1-6 cells transfected with GAL-GNR-siBRAF haven significantly decreased the invasion of Hepal-6, as compared with GAL-GNR-siGL2 or PBS (Fig. 5e and f). The above results implied that knockdown of BRAF gene using GAL-GNR-siBRAF complexes can effectively reduce migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.
Combination Treatment with Photothermal Effect and Gene Silencing of GAL-GNR-siBRAF
Our previous studies have demonstrated that gold nanomaterials can generate thermal energy under near infrared radiation [37]; this phenomenon is called photothermal effect due to LSPR properties of the GNR. Our results showed that, with the increase of GAL-GNR concentration, the heat production capacity of GAL-GNR was enhanced. When the concentration of GAL-GNR is 100 μg/mL, the temperature quickly rises from 24 to over 60 °C. In addition, there was no significant difference in heat production capacity between GNR and GAL-GNR (Fig. 6a).
Photothermal effect induced by GAL-GNR and combination treatment of photothermal effect and gene silencing on liver cancer cells. a 803 nm near-infrared laser source (2 W/cm
2
) was used to irradiate the solution of GNR, GAL-GNR, or distilled water (blank control) for 15 min. The temperature was detected by infrared thermometer at different time point. b Hepa1-6 cells were treated with PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 + Laser, or GAL-GNR-siBRAF + Laser, respectively. Green fluorescence of calcein AM (live cells) and red fluorescence of PI (dead cells) were observed under fluorescence microscope
The novel nano-system GAL-GNR-siBRAF possesses three individual characteristics:specific targeting of liver cancer, siRNA-based gene silencing of BRAF, and GNR-offered photothermal effects. Thus, we further study the synergistic therapeutic effect of GAL-GNR-siBRAF in anti-tumor treatment. Hepa1-6 cells without GAL-GNR kept higher viability even under near infrared radiation, suggesting laser itself had no significant effect on tumor cells. Once the laser irradiation was carried out on the basis of GAL-GNR-siGL2 treatment, the photothermal effect showed powerful killing ability on Hepa1-6 cells. Although BRAF gene silencing alone induced cell death, the effect was not conclusive. The treatment of cells with the nano-material GAL-GNR-siGL2 plus laser irradiation resulted in much stronger cell-killing ability than BRAF gene silencing individual (Fig. 6b). These data indicates that the BRAF gene silencing and photothermal effect can synergistically increase the potential of killing tumor cells.
Discussion
Difficulties in tumor-targeted delivery are major obstacles in the clinical treatment of tumors. This study demonstrated for the first time that we have developed a novel multifunctional nanocarrier GAL-GNR-siBRAF, and it was provided with many advantages. The modified GAL-GNR not only possessed good biocompatibility but also maintained the LSPR phenomena of GNR skeleton and still has excellent photothermal conversion ability. GNR modified with GAL can home hepatocellular carcinoma cells through ASGPR, which has great potential in targeted molecular therapy of hepatocellular carcinoma. Further studies showed that BRAF gene silencing inhibited the proliferation, migration, and invasion of hepatoma cells. It is worth noting that GAL-GNR-siBRAF shows a stronger cell killing ability in the combination of photothermal effect and gene silencing of BRAF.
RNA interference (RNAi) has attracted much attention due to its crucial role in gene expression and regulation. Using siRNA to knock down sequence-specific genes in cancer cells for gene therapy is an effective and specific targeted gene therapy, and which has become a new therapeutic tool for many diseases including cancer [29, 31]. However, low stability in serum and poor cell uptake limit siRNA in clinical application [38]. On the other hand, siRNA possess negative charge that prevents it from binding negatively charged cell membranes, and siRNA itself is unlikely to be delivered directly into cells [32, 39]. In addition, there are problems associated with low transfection efficiency and poor cell internalization in siRNA therapy [40]. These barriers impede the delivery of siRNA to target cells. To enhance siRNA stability and to strengthen gene silencing efficacy, we synthesized a novel nanocarrier, GAL-GNR-siBRAF, which includes three components (Scheme 1). This nanocarrier has low molecular size (about 30-nm longitude and 10-nm diameter) and good dispersibility (Fig. 1). Additionally, GAL-GNR-siBRAF could effectively load large amount of siRNA at low concentration (Fig. 2a) and protect siRNA degradation from RNase in serum; the siRNA was evidenced by stability for at least two days at 37 °C in the presence of fresh murine serum (Fig. 2b).
Good biocompatibility is essential for nanomaterials used in the field of biotherapy. CTAB is an essential active reagent in the synthesis of gold nanorods although it has apparent cytotoxicity that limits its biological application [41]. In order to reduce the cytotoxicity of the material, we manipulated the GNR by external modification of positive charge PEI and targeting adaptor GAL (d-galactose). Our results showed that, compared with unfunctionalized GNR, GAL-modified GNR has a better biocompatibility. The cell viabilities maintained over 80% even at very high concentrations (105 μg/mL) of GAL-GNR for 48 h (Fig. 3). In addition, the small molecular size and cylindrical shape of the nanorod facilitate its penetration through the cell membrane into the cell [37, 38, 42]. This phenomenon is particularly evident in targeted therapy of cancer cells. Nano-construct modified with the galactose-targeting moieties resulted in high accumulation of GAL-GNR-siBRAF in tumor cells, inducing effective downregulation of BRAF gene expression (Fig. 4). Moreover, according to the competitive inhibition experiments, we found that GAL-GNR entered cells mainly through ASGPR surface receptors of Hepa1-6 cells (Fig. 4c).
It was reported that HCC with high expression of BRAF and RAF1 tends to have rapid proliferation and growth [41, 43, 44]. B-Raf and Raf1 mainly act on the downstream of ERK/MAPK pathway, regulating nuclear factors through cascade amplification. Activation of this pathway accelerates the proliferation and differentiation of HCC cells abnormally [41, 44, 45]. RAF gene can also promote the expression of matrix metalloproteinases (MMPs), which can change the adhesion of tumor cells, degrade extracellular matrix (ECM) and basement membrane, and promote the invasion and metastasis of tumors [44, 45]. BRAF kinase regulates the RAS-RAF-MEK-ERK pathway, which promotes tumor cell proliferation, invasion and metastasis, and allows cell death through apoptosis [5, 46, 47]. In previous work, we found that BRAF gene was highly expressed in Hepa1-6 cells (data were not shown). It is speculated that the knock down of BRAF expression in Hepa1-6 will block the RAS-RAF-MEK-ERK pathway and lead biological changes of Hepa1-6. To verify our hypothesis, we transfected hepatocellular carcinoma cells with GAL-GNR-siBRAF and found that it can restrain the cell proliferation, migration, and invasion significantly (Fig. 5), providing a new strategy for clinical treatment of hepatocellular carcinoma.
Another important advantage of GNR is that it possesses local surface plasmon resonance (LSPR), which can convert absorbed light energy into heat energy under near infrared light irradiation, thereby killing and destroying cells [42]. Then, we explored the light-to-heat conversion ability of GAL-GNR, and the results showed that the modified GAL-GNR can induce heat energy effectively under the irradiation of near infrared light (Fig. 6a). Next, we further investigated the synergistic effects of GAL-GNR-siBRAF. Whereas BRAF gene silencing showed limited cytotoxicity, the treatment of GAL-GNR-siGL2 + laser had a much stronger killing ability on tumor cells. At the same time, the combination of photothermal hyperthermia and BRAF gene silencing could cause more than 85% cell death (Fig. 6b) which indicates that the synergy of GAL-GNR-siBRAF and photothermal effects could be an ideal strategy to inhibit liver cancer.
Conclusion
This study showed that GAL-GNR-siBRAF overcome the obstacle of siRNA degradation, effectively increased the stability of siRNA in serum in vitro. In addition, GAL-GNR-siBRAF can target deliver siRNA to hepatocellular carcinoma cells and knockdown the expression of BRAF and inhibit the cell proliferation, invasion, and migration significantly. More importantly, GAL-GNR-siBRAF, as a new multifunctional nanocarrier, can greatly enhance the ability of killing tumor cells when combined with near-infrared light. In conclusion, GAL-GNR-siBRAF has great potential in treatment of hepatocellular carcinoma and provides new ideas for clinical application of liver cancer.
Ketersediaan Data dan Materi
All data generated and materials used in this study are included in the manuscript and corresponding additional files.
