Peningkatan Biokompatibilitas Kerangka Nanofiber Polianilin/Asam Polilaktik melalui Kontrol Morphologi Permukaan dengan Doping Asam Anorganik
Abstrak
Kerangka nanofiber konduktif dan terdegradasi memiliki potensi besar dalam mempromosikan pertumbuhan, proliferasi, dan diferensiasi sel di bawah medan listrik eksternal. Meskipun masalah konduktivitas listrik yang rendah dalam cairan tubuh masih ada, nanofiber terdegradasi berbasis polianilin (PANI) dapat mempromosikan adhesi, pertumbuhan, dan proliferasi sel. Untuk mengetahui apakah efek ini disebabkan oleh morfologi PANI, kami memilih tiga asam anorganik sebagai dopan dalam proses polimerisasi oksidatif in situ PANI: asam klorida, asam sulfat, dan asam perklorat. Nanofiber komposit polianilin/asam polilaktik (PANI/PLA) yang dihasilkan dikarakterisasi melalui analisis SEM, FTIR, dan XPS, dan kami mengonfirmasi bahwa nanofiber PLA berhasil dilapisi PANI tanpa perubahan pada struktur poros nanofiber PLA. Properti mekanis in vitro dan degradasi menunjukkan bahwa oksidasi dopan asam harus dipertimbangkan dan kemungkinan besar memiliki efek degradasi oksidasi yang lebih tinggi pada nanofiber PLA. Uji sudut kontak menunjukkan bahwa nanofiber komposit PANI/PLA dengan morfologi permukaan berbeda memiliki basabilitas yang baik, yang menyiratkan bahwa mereka memenuhi persyaratan kerangka teknologi jaringan tulang. Kekasaran permukaan dan kelayakan sel menunjukkan bahwa morfologi PANI yang berbeda pada permukaan dapat mempromosikan proliferasi sel. Semakin kasar kekasaran permukaan PANI, semakin baik biokompatibilitasnya. Akibatnya, morfologi permukaan yang diatur dari nanofiber komposit PANI/PLA melalui dopant asam yang berbeda memiliki efek positif pada biokompatibilitas dalam teknologi jaringan.
Pendahuluan
Matriks selular ekstraseluler (ECM) adalah jenis jaringan makromolekul yang diserap oleh sel ke stroma ekstraseluler. Ini merupakan dasar sel, jaringan, dan organ, diiringi dengan organ, dan ditandai dengan struktur jaring yang kompleks [1, 2]. Selain itu, ini menyediakan tempat yang sesuai untuk kelangsungan hidup dan aktivitas sel, menentukan bentuk mereka, mengontrol diferensiasi mereka, berpartisipasi dalam migrasi dan metabolisme mereka, dan pada akhirnya mempengaruhi kelangsungan hidup, pertumbuhan, dan kematian mereka [3, 4]. Nanofiber electrospinning dapat mensimulasikan tindakan matriks selular ekstraseluler untuk mengatur perilaku sel karena luas permukaan spesifik yang tinggi, properti mekanis yang sesuai, dan biodegradabilitas. Selain itu, nanofiber electrospinning dapat menjadi multifungsi dengan modifikasi permukaan berdasarkan pemeliharaan struktur porosnya. Oleh karena itu, nanofiber electrospinning telah menjadi kandidat bahan yang menjanjikan dalam teknologi jaringan, yang diterapkan secara luas dalam pengiriman obat, regenerasi ortopedik, regenerasi saraf, dan perbaikan [5,6,7,8,9,10].
Polimer konduktif (misalnya polipirrol [PPy], poliotiofen [PTH], dan polianilin [PANI]) memiliki biokompatibilitas in vitro dan in vivo yang baik, yang dapat secara signifikan mempengaruhi adhesi, proliferasi, dan diferensiasi sel serta regenerasi jaringan [11,12,13]. Di antara polimer konduktif ini, PANI dianggap sebagai bahan potensial untuk teknologi jaringan dan medis regeneratif karena kemampuan proses yang baik, konduktivitas yang baik, stabilitas redoks yang baik, dan biokompatibilitas [14, 15]. Di bawah stimulasi listrik, PANI dapat mengatur adhesi, proliferasi, migrasi, dan diferensiasi sel [16, 17]. Faktanya, banyak laporan telah menyimpulkan bahwa nanofiber komposit terdegradasi konduktif berbasis PANI mempromosikan perilaku sel di bawah medan listrik [18,19,20,21]. Namun, ini menimbulkan masalah krusial bahwa konduktivitas PANI dalam lingkungan fisiologis (pH = 7,4) akan melemah karena dedopan PANI, yang, seperti yang telah ditunjukkan oleh studi sebelumnya, mengurangi keuntungan aktivitas listriknya dalam mempromosikan proliferasi dan diferensiasi sel [22]. Sementara ini jelas menunjukkan keterbatasan nanofiber terdegradasi konduktif berbasis PANI dalam teknologi jaringan tulang di bawah stimulasi listrik eksternal, mereka masih dapat mempromosikan proliferasi dan pertumbuhan sel hingga tingkat yang signifikan [23, 24]. Di sini, kami mengasumsikan bahwa morfologi permukaan PANI meningkatkan kekasaran nanofiber komposit, yang menguntungkan untuk adhesi, pertumbuhan, dan proliferasi sel.
PANI yang didope dengan asam anorganik umumnya memiliki konduktivitas listrik yang baik. Namun, anion yang diperkenalkan oleh berbagai dopan asam anorganik akan mempengaruhi konduktivitas dan struktur polianilin [25,26,27]. Dalam paper ini, tiga asam anorganik umum, yaitu asam klorida (HCl, HA), asam sulfat (H2SO4, SA), dan asam perklorat (HClO4, PA), dipilih sebagai dopan dalam polimerisasi oksidatif in situ PANI. Kemudian, properti mekanis, basabilitas, morfologi permukaan, biokompatibilitas, dan adhesi sel nanofiber PANI/asam polilaktik (PLA) diselidiki di bawah berbagai dopan asam. Hasilnya menunjukkan bahwa semakin kasar kekasaran permukaan PANI, semakin baik proliferasi sel, sehingga menunjukkan biokompatibilitas yang lebih baik.
Metode/Eksperimen
Bahan Kimia
Anilin (AN) dibeli dari Sigma, PLA (Mw = 60.000) dibeli dari Solarbio, diklorometana (DCM) dibeli dari Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., dan N, N-dimetilformamida (DMF) dibeli dari Macklin. Sementara itu, persulfat amonium (APS) dibeli dari Aladdin, HCl dan H2SO4 dibeli dari Guangzhou Chemical Co., Ltd., dan HClO4 dibeli dari Macklin.
Persiapan Nanofiber Polianilin/Asam Polilaktik
Pembuatan Nanofiber Asam Polilaktik Elektrospinning
Partikel PLA dengan massa tertentu ditambahkan ke dalam larutan campuran DCM dan DMF (rasio volume 7:3) sebelum diaduk hingga larut, dan larutan campuran 10% PLA diperoleh. Larutan PLA kemudian dimasukkan ke dalam seringi dan dihubungkan dengan sumber daya tegangan tinggi. Mesin electrospinning (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) diatur dengan tegangan 15 kV dan jarak 15 cm. Nanofiber PLA yang dihasilkan dikeringkan dalam vacum selama semalaman pada 40 °C.
Persiapan Nanofiber Polianilin/Asam Polilaktik yang Didope dengan Berbagai Asam Anorganik
Nanofiber PLA ditempatkan dalam kamar mesin pembersih plasma (PCE-6, MTI Corporation, AS) dan diberi daya selama 2 menit pada daya RF 30 W. Dalam paper ini, tiga asam anorganik umum, yaitu HCl, H2SO4, dan HClO4, digunakan sebagai dopan untuk polimerisasi oksidatif in situ dalam persiapan nanofiber PANI/PLA [24], dan nanofiber PANI yang sesuai ditandai sebagai PANI-HA, PANI-SA, dan PANI-PA, masing-masing, sementara nanofiber komposit PANI/PLA diberi label PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, dan PANI/PLA-PA, masing-masing. Proses persiapan nanofiber komposit PLA dan PANI/PLA ditunjukkan pada Gambar 1.
Skema yang menggambarkan proses persiapan nanofiber PLA dan PANI/PLA komposit
Nanofiber komposit PANI/PLA disiapkan dalam kondisi mandi es [16, 28]. APS dan AN ditambahkan ke dalam larutan asam 1 M sesuai rasio molar 1:1. Di sini, kami mengambil HCl sebagai contoh untuk mengilustrasikan proses persiapan nanofiber PANI/PLA. Dalam kondisi mandi es, AN (930 mg, 0,01 mol) ditetapkan secara titik ke dalam APS (2.280 mg, 0,01 mol) dan dilarutkan dalam 50 mL HCl 1 M. Segera, membran nanofiber PLA yang telah diperlakukan plasma direndam dalam larutan dan diaduk selama 2 jam pada 0 °C. Setelah reaksi, membran nanofiber PLA dibersihkan beberapa kali dengan HCl dan etanol untuk menghilangkan PANI yang tidak melekat sebelum dikeringkan selama semalaman pada 40 °C untuk mendapatkan nanofiber PANI/PLA-HA, yang disisihkan untuk digunakan nanti. Nanofiber komposit PANI/PLA-SA dan PANI/PLA-PA diperoleh dengan pendekatan yang serupa.
Karakterisasi
Uji tarik uniaksial untuk nanofiber PLA dan nanofiber komposit PANI/PLA dilakukan melalui uji tegang–tekan (Shimadzu AGX-PLUS, Jepang). Di sini, spesimen dipotong menjadi bentuk gantung dumbbell, dengan kecepatan tarik dipertahankan konstan 3 mm/min. Modulus Young dihitung dari wilayah linier tegang–tekan 0–15% pada kurva tegang–tekan, dan kekuatan tarik serta tingkat tarik keruntuhan kurva ditentukan dari keruntuhan membran nanofiber.
Morfologi rangka nanofiber dikarakterisasi melalui mikroskop elektron skan emissi lapangan (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Jepang) untuk mengamati morfologi berbeda PANI yang didope dengan berbagai asam anorganik. Sebelum observasi SEM, sampel nanofiber dihembuskan emas selama 60 detik untuk memungkinkan observasi morfologi yang lebih jelas. Sementara itu, kekasaran permukaan nanofiber komposit PANI/PLA diukur menggunakan mikroskop gaya atom (AFM, Bruker Dimension Edge). Untuk mengonfirmasi bahwa PANI sepenuhnya dimuat pada nanofiber PLA, spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) digunakan untuk mengukur perubahan panjang gelombang 2000 ~ 500 cm−1. Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS; Thermo ESCALAB 250) dan Al-Kα digunakan sebagai sumber emisi sinar-X untuk menentukan lebih lanjut komposisi permukaan nanofiber PANI/PLA, sementara basabilitas mereka diukur dalam hal sudut kontak tetes air pada suhu ruangan melalui analisis sudut kontak (OCA 15 plus, Jerman). Degradasi nanofiber dievaluasi menggunakan metode kehilangan massa [29, 30]. Membran nanofiber dipotong menjadi cakram 16 mm dan ditempatkan dalam 20 mL larutan penyangga fosfat (PBS) dengan pH 7,4 sebelum rangka diinkubasi pada 37 °C selama 7, 14, dan 21 hari dan dikeringkan hingga berat konstan.
Dalam paper ini, biokompatibilitas rangka nanofiber komposit PANI/PLA dikarakterisasi dengan eksperimen aktivitas sel osteosarcoma manusia (HOS). Sel HOS dibeli dari bank sel Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok, Shanghai. Sel HOS dikultur dalam media Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) rendah glukosa yang mengandung 10% serum sapi janin, 100 U/mL penicilin, dan 100 U/mL streptomycin sebelum diinkubasi pada 37 °C dan 5% CO2. Saat pertumbuhan sel mencapai tingkat fuasi 90%, sel dialihkan dengan rasio 1:3.
Sel HOS harus ditanam pada nanofiber PANI/PLA sebelum uji proliferasi sel. Di sini, nanofiber ditempatkan pada piring 96-lubang sehingga mereka sepenuhnya menutupi dasar piring sebelum diesterilkan dengan UV selama 30 menit dan dengan larutan etanol 75% selama 30 menit. Kemudian mereka dicuci dengan PBS. Nanofiber kemudian diinisialkan dengan densitas tanam 1 × 104 per lubang, sementara kelompok kosong dan kelompok kontrol disiapkan secara bersamaan. Sel kemudian diinkubasi dalam inkubator sel pada 37 °C selama satu, tiga, dan lima hari, dengan media disegarkan setiap dua hari.
Kelayakan sel nanofiber PANI/PLA dievaluasi menggunakan uji 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazolium bromida (MTT). Setelah diinkubasi selama satu, tiga, dan lima hari, media dihilangkan dari piring 96-lubang dan dicuci dengan PBS tiga kali sebelum 1 mL DMEM yang mengandung 10% 5 mg/mL MTT ditambahkan. Media kemudian diinkubasi pada 37 °C selama 4 jam dan kemudian dihilangkan sebelum DMSO ditambahkan untuk melarutkan metilprednisolon. Media digetar selama 10 menit, dan kemudian, absorbansi ditentukan (BioTek Synergy HTX, AS).
Pewarnaan Imunostaining Fluoresens
Sel HOS diinkubasi dalam inkubator nanofiber PANI/PLA selama 24 jam dan dicuci dengan PBS tiga kali. Kemudian, sel dikonfirmasi dengan paraformaldehide 4% selama 10 menit pada suhu ruangan. Sel yang dikonfirmasi dicuci dengan PBS tiga kali (10 menit setiap kali) dan 10 μL peptid 100 nM yang dilabeli FITC ditambahkan sebelum sel diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan dan kemudian dicuci dengan PBS tiga kali (5 menit setiap kali). Aktin ekstraseluler sel HOS diwarnai, dengan mikroskop konfokal (Tipe A1, Nikon, Jepang) digunakan untuk mengamati pewarnaan sel pada pembesaran 20 ×.
Adhesi Sel
Adhesi sel HOS pada rangka nanofiber komposit PANI/PLA diamati melalui SEM. Di sini, media kultur dihilangkan setelah kultur sel HOS nanofiber PANI/PLA selama 24 jam dan kemudian dicuci dengan PBS tiga kali sebelum penambahan 4% PFA. Media dikonfirmasi selama semalaman pada 4 °C, dicuci dengan PBS tiga kali, didesidratkan dengan larutan etanol bertingkat (30%, 50%, 70%, 85%, 90%, dan 100%, masing-masing; 20 menit setiap kali), dan kemudian dikeringkan beku selama 24 jam. Sebelum observasi SEM, nanofiber dihembuskan platinum selama 120 detik untuk memungkinkan observasi yang lebih baik.
Aktivitas Fosfatase Kaprat (ALP)
ALP adalah salah satu penanda diferensiasi osteoblast awal yang umum digunakan yang bergantung pada ekspresi enzim fosfatase kaprat. Di sini, aktivitas ALP dilakukan menggunakan ALP Assay Kit (Beyotime Biotechnology, P0321S). Sel HOS dikultur pada rangka komposit PANI/PLA yang berbeda selama 7 hari yang ditetapkan. Sel dilisis menggunakan 50 μL Tris–HCl (0,1 M, pH 8) dengan 0,1% (v/v) triton X-100. Aktivitas ALP dianalisis dengan mengukur konsentrasi fenol nitro dari fosfat fenol nitro (PNPP), yang diperkirakan dengan mencatat absorbansi pada 405 nm. Persentase aktivitas ALP sel yang dikultur sepanjang nanofiber PANI/PLA dihitung dengan membandingkan aktivitas ALP sel yang dikultur pada nanofiber PLA asli.
Analisis Statistik
Signifikansi statistik hasil dievaluasi melalui analisis variansi satu arah (ANOVA) menggunakan GraphPad Prism (versi 8.02). Di sini, perbedaan properti mekanis, biodegradabilitas in vitro, dan kelayakan sel di antara rangka nanofiber komposit PANI/PLA yang berbeda dianalisis. Hasil dianggap signifikan ketika p < 0,05 (∗) dan sangat signifikan ketika p < 0,005 (∗∗).
Hasil dan Pembahasan
Properti mekanis rangka teknologi jaringan adalah indikator penting dalam evaluasi apakah rangka dapat menahan dinamika fluida. Keberadaan asam anorganik dapat mempengaruhi properti fisik dan kimia matriks PLA nanofiber komposit PANI/PLA dalam proses polimerisasi oksidatif kimia in situ PANI. Oleh karena itu, menjelajahi properti mekanis nanofiber komposit PANI/PLA yang didope dengan asam anorganik adalah perlu. Di sini, properti mekanis nanofiber komposit PANI/PLA dievaluasi melalui uji tarik, seperti ditunjukkan pada Gambar 2, termasuk tegang–tekan, modulus Young, kekuatan tarik, dan perelongasi pada keruntuhan. Seperti ditunjukkan pada Gambar 2a, nanofiber PLA menunjukkan perilaku elastis linier, dan nanofiber komposit PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-SA menunjukkan perilaku leleh yang jelas, sementara nanofiber komposit PANI/PLA-PA patah segera setelah deformasi elastis. Modulus Young (Gambar 2b) nanofiber komposit PANI/PLA lebih tinggi daripada nanofiber PLA. Dibandingkan dengan PLA, peningkatan modulus elastis PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, dan PANI/PLA-PA adalah 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47, dan 28,43 ± 8,34 MPa, masing-masing. Dalam hal kekuatan tarik (Gambar 2c) dan rasio tarik keruntuhan (Gambar 2d), kekuatan tarik PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-PA menurun, sementara PANI/PLA-SA sedikit meningkat; kekuatan tarik dan perelongasi pada keruntuhan PANI/PLA-PA adalah yang terendah. Dibandingkan dengan nanofiber PLA, kekuatan tarik PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-PA menurun sebesar 0,15 ± 0,01 dan 0,64 ± 0,03 MPa, masing-masing, sementara PANI/PLA-SA sedikit meningkat sebesar 0,13 ± 0,05 MPa. Perelongasi pada keruntuhan PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-PA menurun sebesar 16,93 ± 1,38% dan 35,42 ± 3,94%, masing-masing, sementara PANI/PLA-SA meningkat sebesar 3,32 ± 0,13%.
Properti mekanis nanofiber PLA dan nanofiber komposit PANI/PLA. a Kurva tegang–tekan tarik representatif, b Modulus Young, c kekuatan tarik pada keruntuhan, d perelongasi pada keruntuhan
Seperti ditunjukkan pada Gambar 2, asam anorganik yang dipilih dapat meningkatkan modulus elastis nanofiber PLA melalui koneksi lapisan PANI. Dalam hal kekuatan tarik dan perelongasi pada keruntuhan, dibandingkan dengan nanofiber PLA, properti mekanis PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-SA bervariasi hingga beberapa tingkat, sementara PANI/PLA-PA menurun paling jelas, dan segera setelah tekanan diterapkan selama pengujian, keruntuhan terjadi dalam waktu kurang dari 5 detik. Hasil ini mungkin disebabkan oleh oksidasi HClO4, yang mengakibatkan pemutusan ikut ester dalam rantai molekul PLA dan dekomposisi oksidatif grup karboksil, yang kemudian mengakibatkan properti mekanis yang buruk [31]. Sementara itu, properti mekanis yang berbeda dari PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-SA mungkin terkait dengan densitas yang berbeda PANI yang didope oleh HCl dan H2SO4, sementara pemasukan APS dalam proses reaksi juga dapat memiliki dampak ringan pada nanofiber PLA, dengan efek komprehensif dari faktor-faktor ini menampilkan properti mekanis yang berbeda [32].
Adhesi, proliferasi, dan diferensiasi sel dipengaruhi oleh morfologi, dengan permukaan kasar umumnya diyakini menguntungkan adhesi sel [33]. Hidrofobisitas nanofiber PLA menyiratkan bahwa polimerisasi seragam PANI menampilkan hambatan, sementara perawatan permukaan nanofiber PLA dengan plasma dapat secara signifikan meningkatkan basabilitas [34]. Setelah polimerisasi in situ berbasis PANI dengan berbagai dopan asam anorganik, diperoleh nanofiber komposit PANI/PLA dengan depozisi permukaan yang seragam.
Morfologi PANI pada permukaan berbagai fiber PANI/PLA diamati melalui FE-SEM (Gambar 3). Gambar ini secara jelas menunjukkan bahwa permukaan nanofiber PLA ditutupi oleh banyak nanopartikel tidak teratur dan bahwa nanofiber komposit PANI/PLA yang didope dengan asam anorganik mampu mempertahankan morfologi fiber yang baik dan struktur nanofiber poros. Observasi morfologi mengungkapkan bahwa nanofiber komposit PANI/PLA berhasil dimuat dengan PANI, yang memberikan dasar untuk adhesi dan proliferasi sel. Sementara itu, AFM digunakan untuk mengukur kekasaran permukaan nanofiber komposit PANI/PLA, seperti ditunjukkan pada Gambar 4. Ra, nilai rata-rata kekasaran permukaan pada tiga posisi berbeda setiap sampel, umumnya digunakan untuk mengevaluasi kekasaran permukaan sampel. Selain itu, Ra nanofiber komposit PANI/PLA lebih besar daripada nanofiber PLA, dan Ra PANI/PLA-PA adalah yang tertinggi. Peningkatan kekasaran permukaan ini mempercepat luas permukaan dan polaritas, yang potensialmente menyediakan lebih banyak situs pertumbuhan untuk sel dan mempromosikan adhesi sel.
Morfologi a nanofiber PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, dan d nanofiber komposit PANI/PLA-PA
Gambar AFM dan kekasaran permukaan (Ra) a nanofiber PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, dan d nanofiber komposit PANI/PLA-PA
Adhesi, migrasi, dan proliferasi sel secara signifikan dipengaruhi oleh basabilitas rangka [35, 36]. Secara umum, basabilitas dievaluasi dalam hal sudut kontak antara rangka dan air. Karena PLA hidrofobik, kami mengukur sudut kontak tetes air pada membran nanofiber dalam waktu 1 detik, seperti ditunjukkan pada Gambar 5, dan sudut kontak nanofiber PANI/PLA setelah perawatan ditemukan secara signifikan menurun. Sudut kontak yang sesuai dari PLA, PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, dan PANI/PLA-PA adalah 112°, 61,6°, 36,7°, dan 37,2°, masing-masing. Morfologi PANI PANI/PLA meningkatkan energi sistem, dengan area kontak meningkat pada kontak awal dengan air, yang menghasilkan penurunan sudut kontak dan peningkatan basabilitas. Sudut kontak nanofiber komposit berubah menjadi 0° setelah 5 detik kontak dengan air, sehingga menunjukkan hidrofilik yang baik. Rangka hidrofilik ini juga memberikan kondisi yang menguntungkan untuk adhesi dan difusi sel [37] karena grup fungsi yang mengandung oksigen (misalnya –OH dan –COOH) pada permukaan PLA lebih terikat pada permukaan nanofiber setelah perawatan plasma, dan morfologi PANI serta grup fungsi yang mengandung oksigen bekerja sama untuk memastikan bahwa nanofiber komposit PANI/PLA pada akhirnya sepenuhnya basah [38, 39].
Sudut kontak a nanofiber PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, dan d nanofiber komposit PANI/PLA-PA
Spektrum FTIR PANI murni dan nanofiber komposit PANI/PLA yang didope dengan berbagai asam anorganik ditunjukkan pada Gambar 6. Dalam spektrum PANI murni yang didope (Gambar 6a), puncak karakteristik kuat pada 1.565, 1.485, 1.298, dan 1.125 cm−1 masing-masing sesuai dengan C=C penguatan cincin kuinoid dan C = C penguatan, C–N penguatan, dan = C–H penguatan cincin benzenoid. Dalam spektrum PANI murni yang didope (Gambar 6b), selain puncak PANI karakteristik, puncak PLA juga dapat dilihat (puncak getaran penguatan C–O sebesar 1092 dan 1184 cm−1, puncak getaran penguatan C=O sebesar 1757 cm−1). Hasil ini menunjukkan bahwa PANI berhasil dimuat pada permukaan nanofiber PANI/PLA yang didope dengan asam anorganik. Untuk menyelidiki lebih lanjut komposisi kimia nanofiber PANI/PLA, XPS digunakan untuk menganalisis komposisi permukaannya. Selain itu, dalam spektrum XPS (Gambar 7a), puncak N1s yang jelas terlihat pada ~ 400 eV dalam nanofiber komposit PANI/PLA. Selain itu, puncak Cl2p terlihat pada ~ 200 eV pada PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-PA, sementara intensitas puncak Cl2p pada PANI/PLA-PA lebih tinggi daripada pada PANI/PLA-HA. Puncak S2p muncul pada ~ 210 eV pada spektrum XPS pada PANI/PLA-SA. Spektrum XPS menunjukkan bahwa Cl−, SO42−, dan ClO4− didope pada nanofiber PANI/PLA yang sesuai. Selain itu, atom nitrogen imin PANI sepenuhnya atau sebagian dioksidasi untuk menghasilkan serangkaian status oksidasi yang diiringi dengan tingkat protonasi yang bervariasi. Perubahan status oksidasi dan tingkat protonasi PANI diukur dalam hal spektrum level nuklir N1s (Gambar 7b–d). Setiap spektrum N1s dapat diuraikan menjadi empat komponen utama dengan energi ikatan sekitar 398,7, 399,6, 400,4, dan 401,8 eV, yang masing-masing dapat diatribusikan kepada imin kuinoid (–N=), amina benzenoid (–NH–), amina protonasi (–N+), dan imin protonasi (=N+) [40, 41]. Dengan merujuk pada studi Kumar [42], puncak penyelesaian spektrum N1s dianggap dipengaruhi oleh muatan anion yang terikat pada atom N yang protonasi, yang mengakibatkan delokalisasi dan pergeseran ringan.
Spektrum FTIR a PANI, b PLA dan nanofiber komposit PANI/PLA
Spektrum XPS (a) rangka nanofiber komposit PANI/PLA yang disiapkan dan sinyal level inti N1s PANI/PLA-HA (b), PANI/PLA-SA (c), dan PANI/PLA-PA (d)
Sebagai templat untuk perbaikan dan regenerasi jaringan, rangka bioaktif terdegradasi dan dikeluarkan dari tubuh setelah diinduksi perbaikan sel dan jaringan [43]. Dalam paper ini, properti degradasi rangka nanofiber dievaluasi menggunakan metode kehilangan massa, seperti ditunjukkan pada Gambar 8. Kehilangan massa semua sampel meningkat pada hari 7, 14, dan 21, dan laju kehilangan massa nanofiber PLA adalah 4,34 ± 0,41%, 7,84 ± 1,57%, dan 12,65 ± 0,83%, masing-masing. Sementara itu, kehilangan massa nanofiber komposit PANI/PLA-PA secara bertahap meningkat setelah polimerisasi oksidatif in situ, dengan laju kehilangan massa sebesar 31 ± 2,15%, 34 ± 1,86%, dan 40 ± 2,54% pada hari 7, 14, dan 21, masing-masing, yang secara signifikan lebih tinggi daripada kedua nanofiber PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-SA. Dalam proses polimerisasi oksidatif in situ PANI, keberadaan oksidan APS mungkin telah merusak ikut ester dalam PLA dan memicu reaksi hidrolisis, yang menghasilkan mikroretakan pada nanofiber PLA. Seiring dengan peningkatan waktu rendaman PBS, mikroretakan secara bertahap menyelimuti dan matriks PLA mulai terdegradasi secara bertahap. PANI yang dimuat pada permukaan juga rontok, yang mengakibatkan kehilangan massa nanofiber. Seiring dengan peningkatan waktu, rasio kehilangan masa menjadi lebih jelas. Di sini, oksidasi yang kuat HClO4 memperparah degradasi PLA dan mempercepat kehilangan massa nanofiber PANI/PLA-PA, yang konsisten dengan properti mekanis yang ditampilkan pada Gambar 2.
Properti degradasi PLA dan nanofiber PANI/PLA
Biokompatibilitas rangka bioaktif adalah dasar untuk mempromosikan adhesi, pertumbuhan, dan proliferasi sel [44]. Di sini, kami mempelajari proliferasi sel HOS pada nanofiber PLA dan komposit PANI/PLA untuk menggambarkan adhesi dan biokompatibilitas yang terkait. Selama perawatan kimia dan fungsionalisasi [45], sejumlah faktor pengaruh potensial dapat berperan dalam persiapan rangka bioaktif. Oleh karena itu, menyelidiki biokompatibilitas mereka adalah kunci untuk mengevaluasi aplikasi praktis mereka.
Untuk menyelidiki biokompatibilitas nanofiber komposit PANI/PLA, kelayakan sel mereka dievaluasi menggunakan metode MTT. Gambar 9 menunjukkan aktivitas sel yang diinkubasi pada nanofiber PLA dan komposit PANI/PLA setelah 1, 3, dan 5 hari. Gambar ini secara jelas menunjukkan bahwa seiring dengan bertambahnya waktu inkubasi, aktivitas sel nanofiber secara bertahap meningkat; sel PANI/PLA-PA menunjukkan aktivitas terbaik, dan aktivitas sel setelah kultur lima hari adalah yang tertinggi.
Kelayakan sel HOS yang dikultur selama 1, 3, dan 5 hari pada nanofiber PLA dan nanofiber komposit PANI/PLA (*p < 0,05; **p < 0,005)
PLA terdegradasi, tetapi hidrofobik, yang berarti tidak menguntungkan untuk adhesi, pertumbuhan, dan proliferasi sel. Setelah perawatan plasma, permukaan nanofiber komposit PANI/PLA dimuat dengan grup yang mengandung oksigen, dan permukaan fungsional menunjukkan hidrofilik yang baik. Hasil morfologi dan AFM di atas menunjukkan bahwa PANI yang didope dengan berbagai asam anorganik menunjukkan morfologi dan tingkat kekasaran yang berbeda pada permukaan nanofiber PLA. Sementara itu, nanofiber komposit PANI/PLA menunjukkan basabilitas yang baik. Oleh karena itu, kami menganggap bahwa morfologi yang berbeda PANI yang didope dengan asam anorganik menyebabkan peningkatan energi dan polaritas permukaan nanofiber komposit PANI/PLA, yang pada gilirannya mempengaruhi pertumbuhan, migrasi, dan proliferasi sel, yang menghasilkan performa yang ditingkatkan dalam hal aktivitas sel [46].
Untuk mempelajari lebih lanjut perilaku sel nanofiber komposit PANI/PLA, pertumbuhan dan adhesi pada nanofiber diamati melalui pewarnaan imunostaining fluoresens (Gambar 10) dan SEM (Gambar 11). Di sini, kami membandingkan aktin dan morfologi sel pada permukaan berbagai nanofiber. Saat sel tumbuh pada fiber PLA dan nanofiber PANI/PLA, rantai aktin menunjukkan keadaan peregangan yang baik. Sementara itu, densitas sel nanofiber komposit PANI/PLA lebih tinggi daripada nanofiber PLA kelompok kontrol, dengan urutan densitas pertumbuhan sel PANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HA. Sel HOS tumbuh pada nanofiber PANI/PLA dan melekat dalam bentuk multipolar datar. Jelas, banyak sel terbenam dalam pori fiber PANI/PLA tetapi tidak tereregang dengan baik pada nanofiber PLA dan tidak dapat sepenuhnya mengembang. Hasil ini menunjukkan bahwa nanofiber komposit PANI/PLA dapat mempromosikan adhesi dan proliferasi sel HOS.
Gambar mikroskopik fluoresens pada a nanofiber PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, dan d nanofiber komposit PANI/PLA-PA setelah inkubasi 24 jam
Gambar mikroskop SEM sel HOS yang ditanam pada a nanofiber PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, dan d nanofiber komposit PANI/PLA-PA setelah 24 jam
Sementara itu, hasil pewarnaan imunofluoresens sel dan adhesi sel menunjukkan bahwa morfologi PANI yang berbeda pada permukaan nanofiber komposit PANI/PLA mempengaruhi pertumbuhan, adhesi, dan proliferasi sel HOS, yang konsisten dengan hasil di atas.
Sebagai penanda osteogenik awal, uji ALP dilakukan pada rangka nanofiber PLA dan komposit PANI/PLA selama 7 hari. Dibandingkan dengan nanofiber PLA murni, hasil (Gambar 12) menunjukkan bahwa aktivitas ALP secara signifikan meningkat pada nanofiber komposit PANI/PLA. Jelas, aktivitas ALP nanofiber komposit PANI/PLA-PA adalah yang terbaik. Hasil ini membuktikan bahwa nanofiber komposit PANI/PLA menunjukkan biokompatibilitas yang lebih baik, yang konsisten dengan hasil di atas mengenai adhesi, pertumbuhan, dan proliferasi sel.
Aktivitas fosfatase kaprat pada rangka nanofiber komposit PANI/PLA (ns = tidak signifikan)
Kesimpulan
Dalam paper ini, nanofiber komposit PANI/PLA dengan morfologi permukaan yang berbeda disiapkan oleh tiga jenis asam anorganik sebagai dopan dalam polimerisasi in situ. Kami mengonfirmasi bahwa PANI dapat berhasil dimuat pada permukaan PLA tanpa mengubah struktur poros nanofiber. Eksperimen properti mekanis dan degradasi in vitro menunjukkan bahwa asam oksidatif dapat secara signifikan melemahkan properti mekanis dan mempercepat degradasi nanofiber poliestere. Sementara itu, permukaan yang lebih kasar menghasilkan basabilitas yang lebih baik dan mempromosikan adhesi, pertumbuhan, dan proliferasi sel, yang menunjukkan biokompatibilitas yang lebih baik. Secara kesimpulan, morfologi PANI yang diatur melalui dopant asam yang berbeda memiliki efek positif pada biokompatibilitas dalam teknologi jaringan.
Ketersediaan Data dan Bahan
Penulis menyatakan bahwa bahan dan data segera tersedia bagi pembaca tanpa persyaratan berlebihan untuk perjanjian transfer materi. Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama studi ini disertakan dalam paper ini.
