Morfologi Permukaan yang Diatur dari Nanofiber Komposit Polianilin/Asam Polilaktat melalui Berbagai Doping Asam Anorganik untuk Meningkatkan Biokompatibilitas dalam Rekayasa Jaringan
Abstrak
Scaffold nanofibrous yang konduktif dan dapat terdegradasi memiliki potensi besar dalam mendorong pertumbuhan sel, proliferasi, dan diferensiasi di bawah medan listrik eksternal. Meskipun masalah konduktivitas listrik rendah dalam cairan tubuh masih ada, nanofibers degradable berbasis polianilin (PANI) dapat meningkatkan adhesi sel, pertumbuhan, dan proliferasi. Untuk menyelidiki apakah efek tersebut disebabkan oleh morfologi PANI, kami memilih tiga asam anorganik sebagai dopan dalam proses polimerisasi oksidatif PANI in situ:asam klorida, asam sulfat, dan asam perklorat. Serat nano komposit polianilin/asam polilaktat (PANI/PLA) yang diperoleh dikarakterisasi melalui analisis SEM, FTIR, dan XPS, dan kami mengonfirmasi bahwa serat nano PLA berhasil dilapisi oleh PANI tanpa perubahan apa pun pada struktur berpori dari serat nano PLA. Sifat mekanik dan degradabilitas in vitro menunjukkan bahwa oksidasi dopan asam harus dipertimbangkan dan kemungkinan besar memiliki efek degradasi oksidasi yang lebih tinggi pada serat nano PLA. Tes sudut kontak menunjukkan bahwa nanofiber komposit PANI/PLA dengan morfologi permukaan yang berbeda memiliki keterbasahan yang baik, menyiratkan bahwa mereka memenuhi persyaratan perancah rekayasa jaringan tulang. Kekasaran permukaan dan viabilitas sel menunjukkan bahwa morfologi PANI yang berbeda pada permukaan dapat mendorong proliferasi sel. Semakin tinggi kekasaran permukaan PANI, semakin baik biokompatibilitasnya. Akibatnya, morfologi permukaan yang diatur dari nanofiber komposit PANI/PLA melalui doping asam yang berbeda memiliki efek positif pada biokompatibilitas dalam rekayasa jaringan.
Pengantar
Matriks ekstraseluler (ECM) adalah jenis jaringan makromolekul yang disekresikan oleh sel ke dalam stroma ekstraseluler. Ini menyajikan dasar sel, jaringan, dan organ, disertai dengan organ, dan dicirikan oleh struktur grid yang kompleks [1, 2]. Selain itu, ia menyediakan tempat yang cocok untuk kelangsungan hidup dan aktivitas sel, menentukan bentuknya, mengendalikan diferensiasinya, berpartisipasi dalam migrasi dan metabolismenya, dan pada akhirnya mempengaruhi kelangsungan hidup, pertumbuhan, dan kematiannya [3, 4]. Nanofibers electrospinning dapat mensimulasikan aksi matriks ekstraseluler untuk mengatur perilaku sel karena luas permukaan spesifik yang tinggi, sifat mekanik yang sesuai, dan biodegradabilitas. Selain itu, nanofibers electrospinning dapat multifungsi dengan modifikasi permukaan atas dasar mempertahankan struktur berpori. Oleh karena itu, nanofibers electrospinning telah menjadi bahan kandidat yang menjanjikan dalam rekayasa jaringan, yang diterapkan secara luas dalam pengiriman obat, regenerasi ortopedi, regenerasi saraf, dan perbaikan [5,6,7,8,9,10].
Polimer konduktif (misalnya, polipirol [PPy], politiofena [PTH], dan polianilin [PANI]) memiliki biokompatibilitas in vitro dan in vivo yang baik, yang secara signifikan dapat mempengaruhi adhesi sel, proliferasi, dan diferensiasi serta regenerasi jaringan [11,12] ,13]. Di antara polimer konduktif ini, PANI dianggap sebagai bahan potensial untuk rekayasa jaringan dan obat regeneratif karena kemampuan prosesnya yang baik, konduktivitas yang sangat baik, stabilitas redoks yang baik, dan biokompatibilitas [14, 15]. Di bawah stimulasi listrik, PANI dapat mengatur adhesi sel, proliferasi, migrasi, dan diferensiasi [16, 17]. Bahkan, banyak laporan telah menyimpulkan bahwa nanofibers komposit degradable konduktif berbasis PANI mempromosikan perilaku sel di bawah medan listrik [18,19,20,21]. Namun, ini memerlukan masalah penting bahwa konduktivitas PANI dalam lingkungan fisiologis (pH = 7.4) akan melemah karena dedoped PANI, yang, seperti yang telah ditunjukkan oleh penelitian sebelumnya, mengurangi keuntungan aktivitas listriknya dalam mempromosikan proliferasi dan diferensiasi sel [22] . Sementara ini dengan jelas menunjukkan keterbatasan serat nano yang dapat terdegradasi konduktif berbasis PANI dalam rekayasa jaringan tulang di bawah stimulasi listrik eksternal, mereka masih dapat meningkatkan proliferasi dan pertumbuhan sel hingga tingkat yang signifikan [23, 24]. Di sini, kami berspekulasi bahwa morfologi permukaan PANI meningkatkan kekasaran serat nano komposit, yang kondusif untuk adhesi sel, pertumbuhan, dan proliferasi.
Polianilin yang didoping dengan asam anorganik umumnya memiliki daya hantar listrik yang baik. Namun, anion yang diperkenalkan oleh berbagai dopan asam anorganik akan mempengaruhi konduktivitas dan struktur polianilin [25,26,27]. Dalam makalah ini, tiga asam anorganik yang umum, yaitu asam klorida (HCl, HA), asam sulfat (H2 JADI4 , SA), dan asam perklorat (HClO4 , PA), dipilih sebagai dopan dalam polimerisasi oksidatif in situ PANI. Kemudian, sifat mekanik, keterbasahan, morfologi permukaan, biokompatibilitas, dan adhesi sel dari serat nano PANI/asam polilaktat (PLA) diselidiki di bawah dopan asam yang berbeda. Hasil penelitian menunjukkan bahwa semakin tinggi kekasaran permukaan PANI, semakin baik proliferasi sel, sehingga menunjukkan biokompatibilitas yang lebih baik.
Metode/Eksperimental
Bahan kimia
Aniline (AN) dibeli dari Sigma, PLA (M w = 60.000) dibeli dari Solarbio, diklorometana (DCM) dibeli dari Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., dan N, N-dimethylformamide (DMF) dibeli dari Macklin. Sedangkan amonium persulfat (APS) dibeli dari Aladdin, HCl dan H2 JADI4 dibeli dari Guangzhou Chemical Co., Ltd., dan HClO4 dibeli dari Macklin.
Partikel PLA dengan massa tertentu ditambahkan ke dalam larutan campuran DCM dan DMF (perbandingan volume 7:3) sebelum diaduk sampai larut, dan diperoleh larutan campuran PLA 10%. Solusi PLA kemudian dibagikan ke dalam jarum suntik dan dihubungkan dengan catu daya tegangan tinggi. Mesin electrospinning (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) disetel dengan tegangan 15 kV dan pada jarak 15 cm. Serat nano PLA yang diperoleh dikeringkan dengan vakum semalaman pada suhu 40 °C.
Preparat Nanofiber Polianilin/Asam Polilaktat yang Didoping dengan Asam Anorganik Berbeda
Nanofiber PLA ditempatkan di ruang mesin pembersih plasma (PCE-6, MTI Corporation, USA) dan dibuang selama 2 menit pada daya RF 30 W. Dalam makalah ini, tiga asam anorganik umum, yaitu HCl, H2 JADI4 , dan HClO4 , digunakan sebagai dopan untuk polimerisasi oksidatif in situ dalam preparasi nanofiber PANI/PLA [24], dan nanofiber PANI yang sesuai ditandai sebagai PANI-HA, PANI-SA, dan PANI-PA, masing-masing, sedangkan PANI/PLA nanokomposit nanofibers diberi label sebagai PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, dan PANI/PLA-PA, masing-masing. Proses preparasi nanofiber komposit PLA dan PANI/PLA ditunjukkan pada Gambar 1.
Skema yang menggambarkan proses preparasi nanofiber komposit PLA dan PANI/PLA
nanofibers nanokomposit PANI/PLA disiapkan di bawah kondisi mandi es [16, 28]. APS dan AN ditambahkan ke dalam larutan asam 1 M menurut rasio molar 1:1. Di sini, kami mengambil HCl sebagai contoh untuk menggambarkan proses preparasi nanofiber PANI/PLA. Di bawah kondisi penangas es, AN (930 mg, 0,01 mol) ditambahkan tetes demi tetes ke dalam APS (2,280 mg, 0,01 mol) dan dilarutkan dalam 50 mL HCl 1 M. Segera, membran nanofiber PLA yang diperlakukan dengan plasma direndam dalam larutan dan diaduk selama 2 jam pada 0 °C. Setelah reaksi, membran nanofiber PLA dibersihkan beberapa kali dengan HCl dan etanol untuk menghilangkan PANI yang tidak terikat sebelum dikeringkan semalaman pada suhu 40 °C untuk mendapatkan nanofiber PANI/PLA-HA, yang disisihkan untuk digunakan nanti. Serat nano komposit PANI/PLA-SA dan PANI/PLA-PA diperoleh dengan pendekatan serupa.
Karakterisasi
Uji tarik uniaksial untuk serat nano PLA dan serat nano komposit PANI/PLA dilakukan melalui uji tegangan-regangan (Shimadzu AGX-PLUS, Jepang). Di sini, spesimen dipotong menjadi bentuk seperti halter, dengan kecepatan tarik dipertahankan pada konstan 3 mm/menit. Modulus Young dihitung dari daerah linier regangan 0-15% pada kurva tegangan-regangan, dan kekuatan tarik serta laju tarik patah dari kurva ditentukan dari rekahan membran nanofiber.
Morfologi perancah nanofiber dicirikan melalui mikroskop elektron pemindaian emisi lapangan (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Jepang) untuk mengamati morfologi yang berbeda dari PANI yang didoping dengan asam anorganik yang berbeda. Sebelum pengamatan SEM, sampel nanofiber disemprot dengan emas selama 60 detik untuk memungkinkan pengamatan morfologi yang lebih jelas. Sementara itu, kekasaran permukaan nanofiber komposit PANI/PLA diukur dengan menggunakan atomic force microscopy (AFM, Bruker Dimension Edge). Untuk mengonfirmasi bahwa PANI telah dimuat sepenuhnya pada serat nano PLA, spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) digunakan untuk mengukur perubahan panjang gelombang 2000 ~ 500 cm
−1
. Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS; Thermo ESCALAB 250) dan Al-Kα digunakan sebagai sumber emisi sinar-X untuk menentukan lebih lanjut komposisi permukaan serat nano PANI/PLA, sedangkan keterbasahannya diukur dalam sudut kontak tetesan air pada suhu sekitar melalui analisis sudut kontak (OCA 15 plus, Jerman). Degradasi nanofibers dievaluasi menggunakan metode kehilangan massa [29, 30]. Membran nanofiber dipotong menjadi cakram 16 mm dan ditempatkan dalam 20 mL fosfat buffer saline (PBS) dengan pH 7,4 sebelum perancah diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 7, 14, dan 21 hari dan dikeringkan hingga berat konstan. .
Dalam makalah ini, biokompatibilitas scaffold nanofibrous komposit PANI/PLA dikarakterisasi dengan eksperimen aktivitas sel human osteosarcoma (HOS). Sel HOS dibeli dari bank sel Akademi Ilmu Pengetahuan China, Shanghai. Sel HOS dikultur dalam medium Eagle modifikasi Dulbecco rendah glukosa (DMEM) yang mengandung 10% serum janin sapi, 100 U/mL penisilin, dan 100 U/mL streptomisin sebelum diinkubasi pada 37 °C dan 5% CO2 . Ketika pertumbuhan sel mencapai tingkat fusi 90%, sel-sel dilewatkan dengan rasio 1:3.
Sel-sel HOS harus diunggulkan pada nanofiber PANI/PLA sebelum uji proliferasi sel. Di sini, nanofibers ditempatkan ke dalam piring 96-sumur sedemikian rupa sehingga mereka benar-benar menutupi bagian bawah piring sebelum disterilkan melalui UV selama 30 menit dan melalui larutan etanol 75% selama 30 menit. Kemudian dicuci dengan PBS. Serat nano kemudian diinokulasi dengan 1 × 10
4
kepadatan sumur, sementara kelompok kosong dan kelompok kontrol secara bersamaan dibentuk. Sel-sel tersebut kemudian diinkubasi dalam inkubator sel pada suhu 37 °C selama satu, tiga, dan lima hari, dengan media disegarkan setiap dua hari.
Viabilitas sel dari serat nano PANI/PLA dievaluasi menggunakan uji 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazolium bromida (MTT). Setelah inkubasi pada satu, tiga, dan lima hari, media dikeluarkan dari pelat 96-sumur dan dicuci dengan PBS tiga kali sebelum DMEM 1 mL yang mengandung 10% 5 mg/mL MTT ditambahkan. Media kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 4 jam dan kemudian dihilangkan sebelum ditambahkan DMSO untuk melarutkan metilprednisolon. Media digetarkan selama 10 menit, kemudian ditentukan absorbansinya (BioTek Synergy HTX, USA).
Fluorescent Immunostaining
Sel-sel HOS diinkubasi dalam inkubator nanofiber PANI/PLA selama 24 jam dan dicuci dengan PBS tiga kali. Kemudian, sel-sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 10 menit pada suhu kamar. Sel yang difiksasi dicuci dengan PBS tiga kali (10 menit setiap kali) dan 10 L peptida berlabel FITC 100 nM ditambahkan sebelum sel diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar dan kemudian dicuci dengan PBS tiga kali (5 menit setiap kali). ). Aktin ekstraseluler sel HOS diwarnai, dengan mikroskop confocal (Tipe A1, Nikon, Jepang) digunakan untuk mengamati pewarnaan sel pada perbesaran 20 .
Adhesi Sel
Adhesi sel HOS pada perancah nanofibrous komposit PANI / PLA diamati melalui SEM. Di sini, media kultur dihilangkan setelah kultur sel HOS nanofiber PANI / PLA 24-jam dan kemudian dicuci dengan PBS tiga kali sebelum penambahan 4% PFA. Medium difiksasi semalaman pada suhu 4 °C, dicuci dengan PBS tiga kali, didehidrasi dengan larutan etanol gradien (30%, 50%, 70%, 85%, 90%, dan 100%, masing-masing; 20 menit setiap kali), dan kemudian dibekukan-kering selama 24 jam. Sebelum pengamatan SEM, serat nano disemprot dengan platinum selama 120 detik untuk memungkinkan pengamatan yang lebih baik.
Aktivitas Alkaline Phosphatase (ALP)
ALP adalah salah satu penanda diferensiasi awal osteoblas yang umum digunakan yang bergantung pada ekspresi enzim alkaline phosphatase. Di sini, aktivitas ALP dilakukan menggunakan ALP Assay Kit (Beyotime Biotechnology, P0321S). Sel-sel HOS dikultur pada perancah komposit PANI / PLA yang berbeda untuk 7d yang ditentukan. Sel-sel dilisiskan menggunakan 50 L Tris–HCl (0,1 M, pH 8) dengan 0,1% (v/v) triton X-100. Aktivitas ALP dianalisis dengan mengukur konsentrasi p -nitrofenol dari p -nitrofenil fosfat (PNPP), yang diperkirakan dengan merekam absorbansi pada 405 nm. Persentase aktivitas ALP sel yang dikultur di sepanjang serat nano PANI/PLA dihitung dengan membandingkan aktivitas ALP sel yang dikultur pada serat nano PLA murni.
Analisis Statistik
Signifikansi statistik dari hasil dinilai melalui analisis varians satu arah (ANOVA) menggunakan GraphPad Prism (versi 8.02). Di sini, perbedaan sifat mekanik, biodegradabilitas in vitro, dan viabilitas sel di antara perancah nanofibrous komposit PANI/PLA yang berbeda dianalisis. Hasilnya dianggap signifikan ketika p < 0.05 (∗) dan sangat signifikan bila p < 0.005 (∗∗).
Hasil dan Diskusi
Sifat mekanik perancah yang direkayasa jaringan merupakan indikator penting dalam evaluasi apakah perancah dapat menahan dinamika fluida. Kehadiran asam anorganik dapat mempengaruhi sifat fisik dan kimia matriks PLA nanofiber komposit PANI/PLA dalam proses polimerisasi oksidasi kimia in situ PANI. Oleh karena itu, perlu dilakukan eksplorasi sifat mekanik nanofiber komposit PANI/PLA yang didoping dengan asam anorganik. Di sini, sifat mekanik nanofibers komposit PANI/PLA dievaluasi melalui uji tarik, yang ditunjukkan pada Gambar. 2, termasuk tegangan-regangan, modulus Young, kekuatan tarik, dan perpanjangan putus. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, serat nano PLA menunjukkan perilaku elastis linier, dan serat nano komposit PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-SA menunjukkan perilaku hasil yang jelas, sedangkan serat nano komposit PANI/PLA-PA segera pecah setelah deformasi elastis. . Modulus Young (Gbr. 2b) nanofiber komposit PANI/PLA lebih tinggi daripada nanofiber PLA. Dibandingkan dengan PLA, peningkatan modulus elastisitas PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, dan PANI/PLA-PA berturut-turut adalah 53,5 ± 9.09, 60,00 ± 9,47, dan 28,43 ± 8,34 MPa. Dalam hal kekuatan tarik (Gbr. 2c) dan rasio tarik patah (Gbr. 2d), PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-PA menurun, sedangkan PANI/PLA-SA sedikit meningkat; kekuatan tarik dan perpanjangan putus PANI/PLA-PA adalah yang terendah. Dibandingkan dengan serat nano PLA, kekuatan tarik PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-PA masing-masing turun 0,15 ± 0,01 dan 0,64 ± 0,03 MPa, sedangkan PANI/PLA-SA sedikit meningkat 0,13 ± 0,05 MPa. Perpanjangan putus PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-PA masing-masing turun 16,93 ± 1,38% dan 35,42 ± 3,94%, sedangkan perpanjangan PANI/PLA-SA naik 3,32 ± 0,13%.
Sifat mekanik nanofibers PLA dan nanofibers komposit PANI/PLA. a Kurva tegangan-regangan tarik yang representatif, b Modulus Young, c kekuatan tarik putus, d perpanjangan putus
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, asam anorganik yang dipilih dapat meningkatkan modulus elastisitas nanofibers PLA melalui sambungan lapisan PANI. Dalam hal kekuatan tarik dan perpanjangan putus, dibandingkan dengan PLA nanofibers, sifat mekanik PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-SA bervariasi untuk derajat yang berbeda, sedangkan PANI/PLA-PA menurun paling jelas, dan segera sebagai stres diterapkan selama pengujian, patah tulang terjadi di bawah 5 s. Hasil ini mungkin karena oksidasi HClO4 , yang mengakibatkan pemutusan ikatan ester dalam rantai molekul PLA dan dekomposisi oksidatif gugus karboksil, yang selanjutnya mengarah pada sifat mekanik yang lebih rendah [31]. Sementara itu, perbedaan sifat mekanik PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-SA mungkin terkait dengan perbedaan densitas PANI yang didoping oleh HCl dan H2 JADI4 , sementara pengenalan APS dalam proses reaksi juga dapat berdampak kecil pada serat nano PLA, dengan efek komprehensif dari faktor-faktor ini menunjukkan sifat mekanik yang berbeda [32].
Adhesi sel, proliferasi, dan diferensiasi dipengaruhi oleh morfologi, dengan permukaan kasar umumnya diyakini kondusif untuk adhesi sel [33]. Hidrofobisitas nanofibers PLA menyiratkan bahwa polimerisasi seragam PANI menghadirkan penghalang, sedangkan perlakuan permukaan nanofibers PLA dengan plasma dapat secara signifikan meningkatkan keterbasahan [34]. Setelah polimerisasi in situ berbasis PANI dengan dopan asam anorganik yang berbeda, serat nano komposit PANI/PLA dengan deposisi permukaan yang seragam diperoleh.
Morfologi PANI pada permukaan serat PANI/PLA yang berbeda diamati melalui FE-SEM (Gbr. 3). Gambar tersebut dengan jelas menunjukkan bahwa permukaan nanofibers PLA ditutupi oleh banyak nanopartikel tidak beraturan dan bahwa nanofiber komposit PANI/PLA yang didoping dengan asam anorganik mampu mempertahankan morfologi serat yang baik dan struktur nanofiber berpori. Pengamatan morfologi mengungkapkan bahwa nanofiber komposit PANI/PLA berhasil dimuat dengan PANI, yang memberikan dasar untuk adhesi dan proliferasi sel. Sementara itu, AFM digunakan untuk mengukur kekasaran permukaan nanofiber komposit PANI/PLA, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4. Ra, nilai rata-rata kekasaran permukaan pada tiga posisi berbeda dari setiap sampel, umumnya digunakan untuk mengevaluasi kekasaran permukaan sampel. Selanjutnya, Ra nanofiber komposit PANI/PLA lebih besar dari nanofiber PLA, dan Ra PANI/PLA-PA paling tinggi. Peningkatan kekasaran permukaan ini mempercepat luas permukaan dan polaritas, berpotensi menyediakan lebih banyak tempat pertumbuhan untuk sel dan mendorong adhesi sel.
Morfologi a Serat nano PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, dan d Serat nano komposit PANI/PLA-PA
Gambar AFM dan kekasaran permukaan (Ra) dari a Serat nano PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, dan d Serat nano komposit PANI/PLA-PA
Adhesi sel, migrasi, dan proliferasi secara signifikan dipengaruhi oleh keterbasahan perancah [35, 36]. Secara umum, keterbasahan dievaluasi dalam hal sudut kontak antara perancah dan air. Mengingat PLA bersifat hidrofobik, kami mengukur sudut kontak tetesan air pada membran nanofiber dalam 1 detik, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, dan sudut kontak nanofiber PANI/PLA setelah perawatan ditemukan menurun secara signifikan. Sudut kontak yang sesuai dari PLA, PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, dan PANI/PLA-PA masing-masing adalah 112°, 61,6°, 36,7°, dan 37,2°. Morfologi PANI dari PANI/PLA meningkatkan energi permukaan sistem, dengan meningkatnya area kontak pada kontak awal dengan air, yang mengakibatkan penurunan sudut kontak dan peningkatan keterbasahan. Sudut kontak serat nano komposit berubah menjadi 0 ° setelah 5 detik kontak dengan air, sehingga menunjukkan hidrofilisitas yang baik. Scaffold hidrofilik ini juga menyediakan kondisi yang menguntungkan untuk adhesi dan difusi sel [37] karena gugus fungsi yang mengandung oksigen (misalnya, –OH dan –COOH) pada permukaan PLA lebih terikat pada permukaan nanofiber setelah perlakuan plasma, dan PANI morfologi dan gugus fungsi yang mengandung oksigen bekerja sama untuk memastikan serat nano komposit PANI/PLA pada akhirnya benar-benar basah [38, 39].
Sudut kontak a Serat nano PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, dan d Serat nano komposit PANI/PLA-PA
Spektrum FTIR nanofiber komposit PANI dan PANI/PLA murni yang didoping oleh asam anorganik yang berbeda ditunjukkan pada Gambar. 6. Dalam spektrum PANI murni yang didoping (Gbr. 6a), puncak karakteristik kuat pada 1.565, 1.485, 1.298, dan 1.125 cm
−1
sesuai dengan regangan C=C cincin quinoid dan regangan C = C, regangan C–N, dan regangan = C–H dari cincin benzenoid. Dalam spektrum PANI murni yang didoping (Gbr. 6b), selain puncak PANI yang khas, puncak PLA juga dapat dilihat (puncak getaran regangan C–O 1092 dan 1184 cm
−1
, C=O puncak getaran regangan 1757 cm
−1
). Hasil ini menunjukkan bahwa PANI berhasil dimuat pada permukaan nanofiber PANI/PLA yang didoping dengan asam anorganik. Untuk menyelidiki lebih lanjut komposisi kimia dari nanofibers PANI/PLA, XPS digunakan untuk menganalisis komposisi permukaannya. Selain itu, dalam spektrum XPS (Gbr. 7a), puncak N1 yang jelas terlihat pada ~ 400 eV dalam serat nano komposit PANI/PLA. Selain itu, puncak Cl2p terlihat pada ~ 200 eV pada PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-PA, sedangkan intensitas puncak Cl2p dengan PANI/PLA-PA lebih tinggi dibandingkan dengan PANI/PLA-HA. Puncak S2p muncul pada ~ 210 eV pada spektrum XPS di PANI/PLA-SA. Spektrum XPS menunjukkan bahwa Cl
−
, JADI4
2−
, dan ClO4
−
didoping ke nanofiber PANI / PLA yang sesuai. Selain itu, atom nitrogen imina PANI dioksidasi seluruhnya atau sebagian untuk menghasilkan serangkaian keadaan oksidasi disertai dengan berbagai tingkat protonasi. Perubahan tingkat oksidasi dan tingkat protonasi PANI diukur dalam hal spektrum tingkat nuklir N1s (Gbr. 7b-d). Setiap spektrum N1 dapat didekonvolusi menjadi empat komponen utama dengan energi ikat sekitar 398,7, 399,6, 400,4, dan 401,8 eV, yang dapat dikaitkan dengan quinonoid imine (–N=), benzenoid amine (–NH–), amina terprotonasi (– N
+
), dan imina terprotonasi (=N
+
), masing-masing [40, 41]. Dengan mengacu pada penelitian Kumar [42], puncak pas spektrum N1s dianggap dipengaruhi oleh muatan dalam anion yang terikat oleh atom N terprotonasi, yang mengakibatkan delokalisasi dan sedikit pergeseran.
Spektrum FTIR a PANI, b Serat nano komposit PLA dan PANI/PLA
Spektrum XPS (a ) dari perancah nanofibrous komposit PANI/PLA yang disiapkan dan PANI/PLA-HA (b ), PANI/PLA-SA (c ), dan PANI/PLA-PA (d ) dari sinyal level inti N1s
Sebagai template untuk perbaikan dan regenerasi jaringan, perancah bioaktif terdegradasi dan dikeluarkan dari tubuh setelah perbaikan sel dan jaringan yang diinduksi [43]. Dalam makalah ini, sifat degradasi perancah nanofiber dievaluasi menggunakan metode kehilangan massa, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8. Kehilangan massa semua sampel meningkat pada 7, 14, dan 21 hari, dan tingkat kehilangan massa PLA nanofibers masing-masing adalah 4,34 ± 0,41%, 7,84 ± 1,57%, dan 12,65 ± 0,83%. Sementara itu, kehilangan massa nanofiber komposit PANI/PLA-PA secara bertahap meningkat mengikuti polimerisasi oksidatif in situ, dengan tingkat kehilangan massa 31 ± 2.15%, 34 ± 1.86%, dan 40 ± 2.54% pada 7, 14, dan 21 hari, masing-masing, yang secara signifikan lebih tinggi daripada serat nano PANI/PLA-HA dan PANI/PLA-SA. Dalam proses polimerisasi oksidatif PANI in situ, kehadiran oksidan APS dapat menghancurkan ikatan ester di PLA dan menginduksi reaksi hidrolisis, menghasilkan retakan mikro pada serat nano PLA. Dengan perpanjangan waktu perendaman PBS, microcracks secara bertahap menumpuk dan matriks PLA mulai terdegradasi secara bertahap. PANI yang dimuat di permukaan juga jatuh, menghasilkan tingkat kehilangan kualitas nanofiber. Dengan bertambahnya waktu, rasio kehilangan massa menjadi lebih jelas. Di sini, oksidasi kuat HClO4 memperburuk degradasi PLA dan mempercepat hilangnya massa serat nano PANI/PLA-PA, yang konsisten dengan sifat mekanik yang disajikan pada Gambar 2.
Sifat degradasi nanofiber PLA dan PANI/PLA
Biokompatibilitas perancah bioaktif adalah dasar untuk mempromosikan adhesi sel, pertumbuhan, dan proliferasi [44]. Di sini, kami mempelajari proliferasi sel HOS pada nanofiber komposit PLA dan PANI / PLA untuk menggambarkan adhesi dan biokompatibilitas yang menyertainya. Selama perawatan kimia dan fungsionalisasi [45], sejumlah faktor potensial yang mempengaruhi bisa ikut bermain dalam persiapan perancah bioaktif. Oleh karena itu, menyelidiki biokompatibilitasnya adalah kunci untuk mengevaluasi aplikasi praktisnya.
Untuk menyelidiki biokompatibilitas nanofiber komposit PANI/PLA, viabilitas selnya dievaluasi menggunakan metode MTT. Gambar 9 menunjukkan aktivitas sel yang diinkubasi pada nanofiber komposit PLA dan PANI/PLA setelah 1, 3, dan 5 hari. Gambar tersebut dengan jelas menunjukkan bahwa dengan perpanjangan waktu inkubasi, aktivitas sel nanofibers secara bertahap meningkat; sel PANI/PLA-PA menunjukkan aktivitas terbaik, dan aktivitas sel setelah kultur lima hari adalah yang tertinggi.
Viabilitas sel HOS dikultur selama 1, 3, dan 5 hari pada serat nano PLA dan serat nano komposit PANI/PLA (*p < 0,05; **p < 0.005)
PLA bersifat biodegradable, tetapi hidrofobik, artinya tidak kondusif untuk adhesi, pertumbuhan, dan proliferasi sel. Setelah perawatan plasma, permukaan nanofiber komposit PANI/PLA diisi dengan kelompok yang mengandung oksigen, dan permukaan fungsional menunjukkan hidrofilisitas yang baik. Morfologi dan hasil AFM di atas menunjukkan bahwa PANI yang didoping dengan asam anorganik berbeda menunjukkan morfologi dan tingkat kekasaran yang berbeda pada permukaan nanofiber PLA. Sementara itu, nanofiber komposit PANI/PLA menunjukkan keterbasahan yang sangat baik. Oleh karena itu, kami menganggap bahwa perbedaan morfologi PANI yang didoping dengan asam anorganik menyebabkan peningkatan energi permukaan dan polaritas serat nano komposit PANI/PLA, yang akibatnya memengaruhi pertumbuhan, migrasi, dan proliferasi sel, menghasilkan peningkatan kinerja dalam hal aktivitas sel [46].
Untuk mempelajari lebih lanjut perilaku sel dari nanofiber komposit PANI/PLA, pertumbuhan dan adhesi pada nanofibers diamati melalui fluorescence immunostaining (Gbr. 10) dan SEM (Gbr. 11). Di sini, kami membandingkan aktin dan morfologi sel pada permukaan serat nano yang berbeda. Ketika sel tumbuh pada serat PLA dan serat nano PANI/PLA, bundel aktin menunjukkan keadaan peregangan yang baik. Sementara itu, kerapatan sel nanofiber komposit PANI/PLA lebih tinggi dibandingkan nanofiber PLA kelompok kontrol, dengan kerapatan pertumbuhan sel mengikuti urutan PANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HA. Sel-sel HOS tumbuh pada nanofibers PANI/PLA dan menempel dalam bentuk multipolar datar. Jelas, banyak sel tertanam di pori-pori serat PANI / PLA tetapi tidak teregang dengan baik pada serat nano PLA dan tidak dapat diperluas sepenuhnya. These results indicate that PANI/PLA composite nanofibers could promote the adhesion and proliferation of HOS cells.
Fluorescence micrographic images on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after the incubation of 24 h
SEM micrographs of HOS seeded on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after 24 h
Meanwhile, the cell immunofluorescence staining and cell adhesion results indicated that the different PANI morphologies on the surface of the PANI/PLA composite nanofibers affected the growth, adhesion, and proliferation of the HOS cells, which was consistent with the above results.
As an early osteogenic marker, the ALP test was conducted on PLA and PANI/PLA composite nanofibers scaffolds for 7 days. Compared to the pure PLA nanofibers, the result (Fig. 12) showed that the ALP activity was significantly improved in of PANI/PLA composite nanofibers. Obviously, the ALP activity of PANI/PLA-PA composite nanofibers is the best. These results proved that PANI/PLA composite nanofibers exhibited better biocompatible, which is consistent with the above results of cell adhesion, growth, and proliferation.
Alkaline phosphatase activity on PANI/PLA composite nanofibers scaffolds (ns = no significance)
Kesimpulan
In this paper, PANI/PLA composite nanofibers of different surface morphologies were prepared by three types of inorganic acid as dopant in in situ polymerization. We confirmed that PANI could be successfully loaded on the surface of PLA without changing the porous structure of the nanofibers. The mechanical properties and in vitro degradation experiments demonstrated that oxidizing acids can significantly weaken the mechanical properties and accelerate the degradation of polyester nanofibers. Meanwhile, the rougher surface resulted in a better wettability and promoted the cells adhesion, growth, and proliferation, which indicated a better biocompatibility. In conclusion, the regulated PANI morphology via different acids doping has positive effect on biocompatibility in tissue engineering.
Ketersediaan data dan materi
The authors declare that the materials and data are promptly available to readers without undue qualifications for material transfer agreements. Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama studi ini disertakan dalam artikel ini.
