Autophagy Inhibitor (LY294002) dan Nanoliposome Berbasis Kombinasi 5-fluorouracil (5-FU) untuk Meningkatkan Kemanjuran Terhadap Karsinoma Sel Skuamosa Kerongkongan
Abstrak
Dalam penelitian ini, nanoliposom PEGylated 5-fluorouracil (5-FU) dan LY294002 (LY) disiapkan untuk menargetkan karsinoma sel skuamosa esofagus (ESCC). Partikel dikarakterisasi berdasarkan parameter fisikokimia dan biologi. Pengiriman bersama inhibitor autophagy dan obat kemoterapi dalam pembawa tunggal berhasil dicapai. Kedua komponen dari 5-FU dan LY-loaded PEGylated nanoliposome (FLNP) dilepaskan secara terkendali dengan LY relatif lebih cepat dilepaskan dibandingkan dengan 5-FU. FLNP menunjukkan serapan seluler yang dimediasi reseptor yang akan memungkinkan pelepasan obat secara bertahap dalam lingkungan asam. Serapan seluler nanopartikel (NP) dikonfirmasi lebih lanjut oleh analisis FACS. Kombinasi 5-FU dan LY menghasilkan efek sitotoksik yang lebih tinggi dibandingkan dengan obat individu. Yang paling penting, FLNP menunjukkan efek antikanker yang jauh lebih tinggi pada sel kanker dibandingkan dengan kombinasi koktail gratis. Pelepasan LY yang lebih cepat dari FLNP mengarah pada penghambatan autophagy yang meningkatkan sensitivitas sel kanker terhadap 5-FU, menghasilkan lebih banyak kematian sel. Secara konsisten, FLNP menginduksi apoptosis yang lebih besar (~ 48%) sel kanker dibandingkan dengan kelompok lain. Analisis Western blot dengan jelas menunjukkan bahwa 5-FU dan LY secara individual meningkatkan ekspresi caspase-3 dan PARP, sementara seperti yang diharapkan FLNP menginduksi ekspresi luar biasa dari penanda protein ini yang menunjukkan efek antikanker yang unggul. Kami percaya bahwa pelepasan terprogram inhibitor autophagy dan obat kemoterapi dari nanocarrier tunggal akan meningkatkan prospek terapi antikanker di ESCC.
Latar Belakang
Karsinoma sel skuamosa esofagus (ESCC) adalah salah satu jenis umum dari kanker esofagus yang lebih umum di Asia Timur seperti Cina [1, 2]. Tingkat kelangsungan hidup 5 tahun ESCC adalah sekitar 25%. Pembedahan adalah pilihan pengobatan utama untuk pengobatan ESCC; namun, diyakini bahwa kemoterapi ajuvan akan berdampak besar pada pengobatan ESCC [3, 4]. Telah dilaporkan bahwa pengobatan kemoterapi berdasarkan rejimen obat tunggal menghasilkan kemanjuran terapeutik yang buruk karena heterogenitas sel kanker [5]. Sel kanker seringkali resisten terhadap obat antikanker tunggal dan tidak akan efektif secara alami. Dalam hal ini, kombinasi dua atau lebih obat akan bekerja secara sinergis dengan menargetkan target seluler yang berbeda [6, 7]. Inhibitor autophagy telah dilaporkan mengatasi resistensi multidrug (MDR) sel kanker. Ketika sel memiliki nutrisi dan faktor pertumbuhan yang terbatas, autophagy menyediakan homeostasis yang sangat dibutuhkan untuk lingkungan kanker dan berkontribusi untuk kelangsungan hidupnya [8]. Autophagy juga berfungsi untuk melindungi sel kanker dari agen kemoterapi. Dalam penelitian ini, kami telah memilih LY294002 (LY) sebagai inhibitor autophagy [9].
Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa penghambat autophagy bekerja paling baik bila dikombinasikan dengan obat antikanker. Dalam penelitian ini, kami telah memilih 5-fluorouracil (5-FU) sebagai agen kemoterapi. 5-FU terutama diindikasikan dalam pengobatan kanker sel skuamosa dan digunakan pada pasien dengan kanker payudara dan kanker lainnya [10]. 5-FU memiliki atom fluor pada posisi C-5 dari urasil menggantikan hidrogen. Efek antikanker 5-FU muncul dari regulasi berbagai molekul seperti Bax dan Bcl-2 dan menginduksi apoptosis sel kanker [11, 12]. Terlepas dari potensi efek sitotoksik 5-FU dan LY, kedua agen tersebut menderita kelarutan air yang buruk dan masalah stabilitas yang menghasilkan waktu paruh plasma yang pendek dan efek toksik yang tidak diinginkan pada sel normal [6]. Selain itu, campuran koktail sederhana dari kedua agen antikanker tidak menyebabkan efek sinergis karena pelepasan obat secara acak dan distribusi obat yang tidak terkontrol di berbagai jaringan [7]. Oleh karena itu, sangat penting untuk memberikan kedua obat antikanker dengan cara yang terprogram dan terkontrol yang akan meningkatkan kemanjuran terapeutiknya.
Nanopartikel telah banyak diselidiki sebagai pembawa pengiriman obat untuk aplikasi penargetan kanker [13]. Obat yang sukar larut dapat secara stabil tergabung dalam nanopartikel dan dengan demikian kelarutan dan bioavailabilitasnya dapat ditingkatkan. Di antara semua pembawa, liposom telah dipelajari secara luas untuk kesesuaiannya untuk aplikasi sistemik [14, 15]. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa banyak formulasi liposom komersial tersedia termasuk Doxil, Myocet, LipoPlatin dan sebagainya. Sirkulasi sistemik liposom dapat ditingkatkan dengan konjugasi permukaan polietilen (glikol) (PEG) sebagai cangkang hidrofilik [16]. Lapisan nanosize dan hidrofilik PEG akan memberikan sirkulasi darah yang berkepanjangan dan mengurangi klirens plasma yang dimediasi retikuloendotelial (RES). Selain itu, NP dapat terakumulasi secara pasif di jaringan tumor melalui efek permeasi dan retensi (EPR) yang ditingkatkan [17, 18]. Oleh karena itu, dapat diharapkan jika obat kemoterapi dan inhibitor autophagy dapat dimasukkan dalam pembawa tunggal, itu akan memiliki efek antikanker sinergis di ESCC.
Sejauh ini, tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengelola kombinasi 5-FU dan LY untuk mengobati ESCC. Untuk tujuan ini, 5-FU dan LY secara stabil tergabung dalam nanoliposom PEGylated. Diperkirakan bahwa pelepasan awal autophagy inhibitor (LY) akan mengganggu mekanisme perlindungan sel kanker dan setelah itu 5-FU akan bertindak lebih kuat dalam sel kanker. Liposom yang mengandung obat dicirikan dalam hal ukuran partikel, bentuk dan pola pelepasan. Serapan seluler dan uji viabilitas sel telah dilakukan dalam sel kanker ESCC. Selanjutnya dilakukan uji apoptosis dengan pewarnaan annexin V/PI dan pewarnaan Hoechst 33382. Akhirnya, studi kemanjuran antitumor dilakukan pada model hewan xenograft yang mengandung sel ESCC.
Metode
Materi
5-Fluorouracil dibeli dari Sigma-Aldrich, Cina. 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002, LY) dibeli dari Beijing Huafeng United Technology Corporation, Cina. L-a-phosphatidylcholine (telur/ayam) (EPC), disteroylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol (2000) (DSPE-PEG) dan kolesterol dibeli dari Avanti Polar Lipids, China. Semua bahan kimia lainnya memiliki tingkat reagen dan digunakan untuk pemurnian lebih lanjut.
Persiapan Nanoliposom Berisi Obat Ganda
EPC, DSPE-PEG dan kolesterol dicampur dalam campuran metanol-kloroform (rasio 10:4:1 M (total 10 mg)), dan pada campuran organik ini, 5-FU (1,5 mg) dan LY (1,5 mg) ditambahkan. Pelarut organik diuapkan menggunakan rotary evaporator (Buchi, USA) pada 60 °C selama 1 jam. Film lipid tipis dihidrasi dengan buffer PBS selama 1 jam dan diikuti dengan ekstrusi melalui mini-extruder melalui membran polikarbonat (200 nm). Nanoliposom berisi obat disaring melalui tabung Millipore dengan MW 3500. Liposom berisi obat dikumpulkan dari ruang atas dan obat yang tidak terperangkap ditentukan dengan metode HPLC. Pemuatan obat dan enkapsulasi dihitung menggunakan persamaan berikut:
Ukuran partikel dan distribusi ukuran nanopartikel ditentukan dengan teknik dynamic light scattering (DLS) menggunakan Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments, UK). Ukuran partikel diukur pada 25 °C setelah diencerkan dengan tepat dengan air suling. Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga.
Analisis Morfologi
Morfologi NP pertama kali dipelajari dengan mikroskop elektron transmisi (TEM; H-7600, Hitachi, Tokyo, Jepang) pada tegangan percepatan 100 kV. Sampel dimuat dalam kisi tembaga berlapis karbon dan dikeringkan. Morfologi NP diamati lebih lanjut dalam mikroskop kekuatan atom (AFM). Sampel ditempatkan pada permukaan mika.
Studi Rilis In Vitro
Pelepasan in vitro 5-FU dan LY dari 5-FU dan LY-loaded PEGylated nanoliposome (FLNP) dipelajari dalam phosphate buffered saline (PBS, pH 7,4) pada 37°C. Dispersi NP (1 ml yang mengandung 1 mg masing-masing obat dalam pembawa) ditempatkan dalam membran dialisis (MW ~ 3500) dan kedua ujungnya disegel. Membran dialisis ditempatkan dalam tabung dengan 30 ml media pelepas. Tabung yang berisi membran dialisis ditempatkan dalam shaker bath dan dibiarkan diinkubasi untuk titik waktu prasyarat. Pada titik waktu tertentu, 100 l sampel diambil dan diganti dengan buffer segar dalam jumlah yang sama. Jumlah obat yang dilepaskan dalam buffer dipelajari dengan metode HPLC. Sistem kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) (Hitachi, Tokyo, Jepang) yang terdiri dari autosampler L-2200 dan detektor UV–Vis L-2420 digunakan. Kolom C18 Inertsil (150 mm × 4.6 mm, ukuran partikel 5 μm; Cosmosil, Nacalai Tesque Inc., USA) digunakan di bawah elusi isokratik fase gerak pada laju alir 1,0 mL/menit dan suhu kolom 25 ° C. Linieritas yang baik diamati antara 0,025 dan 2 μg/ml untuk kedua obat dengan koefisien korelasi (r
2
) sekitar 0,9995. LOD (μg/ml) untuk 5-FU dan LY masing-masing adalah 0,020 dan 0,050. LOQ (μg/ml) untuk 5-FU dan LY masing-masing adalah 0,070 dan 0,150.
Budaya Sel
Garis sel kanker esofagus, EC 9706, dikultur dalam media RPMI normal dengan 10% FBS dan 100 unit/mL penisilin, 100 mg/ml streptomisin dalam 5% CO2 dan 95% atmosfer kelembaban di pelembab udara.
Analisis Serapan Seluler
Serapan seluler NP diamati dengan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM). Untuk tujuan ini, NP bermuatan rhodamin B disiapkan dan dimurnikan dengan filtrasi gel menggunakan kolom Sephadex G-50 dengan buffer HEPES. Sel-sel diunggulkan di piring 12-sumur dan diinkubasi semalaman. Sel-sel tersebut kemudian diekspos dengan NP bermuatan rhodamin B (10 g/ml) dan diinkubasi selama 2 jam. Sel-sel dicuci dengan PBS tiga kali dan difiksasi dengan paraformaldehida (PFA) 2% dan dicuci lagi dengan PBS. Sel-sel kemudian diwarnai dengan DAPI sebagai zat pewarnaan nuklir. Sel-sel dicuci dan diamati di bawah mikroskop fluoresensi (mikroskop Nikon TE2000-E).
Serapan seluler diamati lebih lanjut menggunakan flow cytometer. Sel-sel diunggulkan di piring 12-sumur dan diinkubasi semalaman. Sel-sel tersebut kemudian diekspos dengan rhodamin B-loaded NP dan diinkubasi masing-masing selama 1 jam dan 2 jam. Sel-sel kemudian diekstraksi dan dicuci dua kali dengan PBS. Sel disuspensikan kembali dalam buffer PBS dan dianalisis menggunakan penyortir sel yang diaktifkan fluoresensi Calibur yang dilengkapi dengan perangkat lunak CELLQuest (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA).
Uji Sitotoksisitas
Potensi sitotoksik formulasi individu dievaluasi dengan 3-(4,5-dimetil-2-tiazoil)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT). Secara singkat, 1 × 10
4
sel diunggulkan dalam piring 96-sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel tersebut kemudian diekspos dengan konsentrasi yang berbeda dari 5-FU, LY, 5-FU + LY dan FLNP, masing-masing dan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Larutan MTT disiapkan (5 mg/ml), dan 10 l larutan MTT ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 4 jam. Kristal formazan diekstraksi dengan menambahkan DMSO, dan absorbansinya dipelajari menggunakan pembaca lempeng mikro (Synergy™ HTX Multi-Mode Microplate Reader) (pada 570 nm).
Uji Apoptosis
Apoptosis sel kanker ditentukan dengan protokol pewarnaan Annexin-V/PI (BD Biosciences, USA). Secara singkat, EC 9706 diunggulkan di piring 12-sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel diinkubasi dengan 5-FU, LY, 5-FU + LY dan FLNP gratis, masing-masing dan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam (1 g konsentrasi obat yang setara). Sel diekstraksi dan diwarnai dengan annexin V-FITC dan PI selama 15 menit pada suhu kamar, lalu dihitung melalui analisis flow cytometry menggunakan software FACS CELLQuest (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA).
Pengujian Hoechst 33342
Apoptosis sel kanker ditentukan lebih lanjut dengan protokol pewarnaan Hoechst 33342. Secara singkat, EC 9706 diunggulkan di piring 12-sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel diinkubasi dengan 5-FU, LY, 5-FU + LY dan FLNP gratis, masing-masing dan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam (1 g konsentrasi obat yang setara). Sel difiksasi dengan PFA 2% dan diinkubasi dengan Hoechst 33342 (1 μg/ml) selama 15 menit. Apoptosis sel kemudian diamati di bawah mikroskop fluoresensi.
Western Blotting
Sel EC 9706 diunggulkan dan diperlakukan dengan 5-FU, LY, 5-FU + LY dan FLNP gratis, masing-masing dan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel kemudian dilisiskan dan supernatan menjadi sasaran elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) dan dioleskan ke membran polivinilidena difluorida (Millipore). Membran diblokir dengan susu skim 5% dan selanjutnya diinkubasi dengan antibodi primer spesifik semalaman pada suhu 4 °C. Setelah inkubasi dengan antibodi sekunder konjugat peroksidase lobak, noda terungkap menggunakan sistem ECL (AbClon) untuk deteksi sinyal. Film dikembangkan menggunakan prosesor Kodak M35-A X-OMAT.
Penghambatan Pertumbuhan Tumor di Vivo
Penelitian pada hewan dilakukan sesuai dengan pedoman yang terkenal oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional, Rumah Sakit Rakyat Subei di Provinsi Jiangsu, Cina. Tikus telanjang betina berumur 6 minggu diinokulasi dengan 1 × 10
6
Sel OE-19 di sayap kanan tikus dalam 100 l media. Tumor dibiarkan tumbuh hingga 80 mm
3
(hari ke 10). Hewan tersebut dibagi menjadi lima kelompok dengan masing-masing enam ekor mencit. Tikus disuntik dengan formulasi masing-masing dengan dosis tetap 5 mg/kg dan diberikan tiga kali selama 10 hari pertama percobaan. Ukuran tumor diukur dalam hal volume tumor menggunakan jangka sorong dan ukuran diperkirakan menggunakan rumus; Volume = (lebar
2
× panjang)/2.
Analisis Statistik
Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. Signifikansi statistik ditentukan dengan menggunakan t uji dan analisis varians (ANOVA). P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil dan Diskusi
Sel kanker seringkali resisten terhadap obat antikanker tunggal dan tidak akan efektif secara alami. Dalam hal ini, kombinasi dua atau lebih obat akan bekerja secara sinergis dengan menargetkan target seluler yang berbeda. Inhibitor autophagy telah dilaporkan mengatasi resistensi multidrug (MDR) sel kanker. Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa penghambat autophagy bekerja paling baik bila dikombinasikan dengan obat antikanker. Dalam penelitian ini, kami telah memilih 5-fluorouracil (5-FU) sebagai agen kemoterapi dan LY294002 (LY) sebagai inhibitor autophagy. Untuk mengatasi masalah kelarutan dan stabilitas obat bebas yang pada gilirannya menghasilkan waktu paruh plasma yang pendek dan efek toksik yang tidak diinginkan, kami telah secara stabil menggabungkan 5-FU dan LY dalam nanoliposom PEGylated (Gbr. 1).
Ilustrasi skema persiapan 5-fluorouracil dan nanoliposom PEGylated bermuatan LY
Persiapan dan Karakterisasi Nanoliposom 5-FU dan LY-loaded
Liposom yang dimuati obat ganda dibuat dengan metode hidrasi film tipis. Ukuran partikel rata-rata liposom kosong ditemukan ~ 110 nm dengan indeks dispersi yang sangat baik. Ukuran partikel liposom yang memuat obat ganda (FLNP) meningkat menjadi ~ 150 nm dengan indeks polidispersitas yang baik (PDI ~ 150) (Gbr. 2a). Peningkatan ukuran partikel terutama disebabkan oleh penggabungan obat hidrofobik dalam liposom. Telah dilaporkan bahwa ukuran partikel sekitar 200 nm akan meningkatkan akumulasi obat dalam jaringan tumor berdasarkan efek permeasi dan retensi yang ditingkatkan (EPR). Liposom yang mengandung obat menunjukkan kemampuan penyimpanan jangka panjang yang dikaitkan dengan keberadaan PEG di permukaannya yang berkontribusi pada efek anti-fouling. Selain itu, FLNP menunjukkan muatan permukaan rata-rata ~ 25 mV yang menunjukkan stabilitas koloidnya. Muatan permukaan negatif akan menghindari interaksi apapun dalam sirkulasi sistemik.
Karakterisasi fisikokimia FLNP. a Distribusi ukuran partikel FLNP dengan metode DLS. b Gambar TEM dari FLNP. c Gambar AFM dari FLNP
Morfologi FLNP pertama kali diamati menggunakan TEM (Gbr. 2b). Seperti yang terlihat, partikel berbentuk bola yang khas dan tersebar merata di jaringan tembaga. Cangkang sedikit keabu-abuan di lingkar dikaitkan dengan keberadaan PEG di permukaannya. Ukuran partikel yang diamati dari TEM sedikit lebih kecil dibandingkan dengan DLS. Ukuran partikel dari TEM adalah ~ 130 nm dibandingkan dengan ~ 150 nm dari DLS. Perbedaan ukuran partikel dari dua teknik mungkin dikaitkan dengan keadaan pengukuran. TEM mengukur partikel dalam kondisi kering sementara DLS mengukur partikel dalam kondisi terhidrasi dan pemanjangan rantai PEG. Morfologi partikel dikonfirmasi lebih lanjut oleh AFM (Gbr. 2c). Partikel-partikel itu melingkar dan hadir sebagai objek pipih di permukaan mika.
Pemuatan Obat dan Pelepasan Obat In Vitro
FLNP menunjukkan efisiensi jebakan yang tinggi untuk kedua obat (92,5% untuk 5-FU dan 86% untuk LY) dengan muatan obat aktif sekitar ~ 16% w /dengan . Perilaku pelepasan in vitro 5-FU dan LY dari FLNP diamati pada saline buffer fosfat (pH 7,4). Kedua komponen dari FLNP dilepaskan secara terkendali dalam kondisi pH 7,4. Misalnya, ~ 30% 5-FU dan ~ 40% LY dilepaskan dari liposom pada akhir 24 jam. Pelepasan obat berlanjut hingga 90 jam dengan ~ 60% 5-FU dan ~ 75% LV dilepaskan (Gbr. 3). Perlu dicatat bahwa laju pelepasan menurun secara signifikan setelah 24 jam hingga 90 jam yang menunjukkan difusi obat yang lambat dari sistem NP. Pelepasan obat yang terkontrol seperti itu akan bermanfaat untuk aplikasi penargetan kanker. Selanjutnya, pelepasan obat yang lambat dalam kondisi netral menunjukkan efek samping yang lebih rendah pada jaringan normal. Perlu dicatat bahwa LY relatif lebih cepat dirilis dibandingkan dengan 5-FU. Ini akan menjadi situasi yang menguntungkan karena LY akan membuat sel kanker lebih sensitif terhadap 5-FU sehingga meningkatkan efek sitotoksik pada jaringan tumor.
Profil pelepasan 5-FU dan LY dari FLNP dalam saline buffer fosfat (PBS, pH 7,4). Jumlah obat yang dilepaskan diukur dengan analisis HPLC
Studi Internalisasi Seluler
Mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) dilakukan untuk menentukan pola subseluler FLNP. Rhodamin B digunakan sebagai probe fluoresen untuk melacak penyerapan intraseluler NP di ESCC. Seperti yang terlihat (Gbr. 4), sinyal fluoresensi merah yang kuat diamati di sitoplasma seluler pada keliling nukleus yang menunjukkan serapan seluler yang dimediasi endositosis. Serapan seluler yang dimediasi reseptor akan memungkinkan pelepasan obat secara bertahap dalam lingkungan asam. Ukuran partikel nano memungkinkan internalisasi sistem NP dengan mudah. Hasilnya jelas menunjukkan bahwa obat memasuki sel kanker melalui jalur tertentu daripada difusi sederhana. Serapan seluler dipantau lebih lanjut oleh FACS. Seperti yang terlihat, penyerapan NP yang luar biasa diamati setelah inkubasi 1 jam dan serapan seluler meningkat dengan peningkatan waktu inkubasi (2 jam). Serapan NP seluler yang lebih besar akan meningkatkan konsentrasi intraseluler obat antikanker yang dienkapsulasi yang selanjutnya akan meningkatkan kemanjuran terapeutik dalam ESCC.
a Gambar mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) sel kanker HT-29 setelah inkubasi dengan FLNP selama 2 jam. Nukleus diwarnai dengan DAPI dan Rhodamin B digunakan sebagai probe fluoresen. b Analisis flow cytometer dari FLNP pada inkubasi untuk titik waktu yang berbeda
Efek Antikanker In Vitro
Efek sitotoksik formulasi individu dipelajari dengan uji MTT (Gbr. 5). Seperti yang ditunjukkan, obat bebas serta NP kombinasional menunjukkan efek sitotoksik tergantung konsentrasi yang khas di ESCC. 5-FU menunjukkan efek antikanker yang relatif lebih tinggi dibandingkan dengan LY dalam sel kanker. Kombinasi 5-FU dan LY menghasilkan efek sitotoksik yang lebih tinggi dibandingkan dengan obat individu. Yang paling penting, FLNP menunjukkan efek antikanker yang jauh lebih tinggi pada sel kanker dibandingkan dengan kombinasi koktail gratis. Nilai IC50 dari 5-FU, LY, 5-FU + LY dan FLNP masing-masing adalah 2,68 μg/ml, 5,98 μg/ml, 1,54 μg/ml dan 0,58 g/ml. Ini dapat dikaitkan dengan fakta bahwa LY dapat menghambat autophagy dalam sel kanker dan membuatnya lebih responsif terhadap 5-FU. Perlu dicatat bahwa FLNP lebih efektif daripada kombinasi koktail gratis karena pelepasan obat yang lebih terprogram secara terkendali. Pelepasan LY dari FLNP yang lebih cepat menyebabkan penghambatan autophagy yang meningkatkan sensitivitas sel kanker terhadap 5-FU, sehingga lebih banyak kematian sel [19]. Telah dilaporkan bahwa 5-FU setelah memasuki sel kanker diubah menjadi fluorouridine triphosphate (FUTP) melalui fluorouridine monophosphate (FUMP) atau dimetabolisme menjadi fluorodeoxyuridine triphosphate (FdUTP) melalui dua jalur yang berbeda. FdUTP bertindak sebagai substrat untuk timidilat sintase (TS) dan memblokir sintesis nukleotida. Metabolit 5-FU mengikat situs pengikatan nukleotida TS dan menghambat sintesis nukleotida. Siklus ini menyebabkan penipisan deoxythymidine triphosphate (dTTP) yang akan mencegah sintesis DNA dan mengakibatkan peningkatan kematian sel kanker [20, 21].
Viabilitas sel sel kanker HT-29 pada inkubasi dengan 5-FU, LY, 5-FU + LY dan FLNP gratis, masing-masing. Viabilitas sel ditentukan dengan uji MTT
Esai Apoptosis
Efek apoptosis dari formulasi dievaluasi dengan metode pewarnaan Annexin-V/PI (Gbr. 6a, b). Ini akan memungkinkan untuk menentukan efek apoptosis individu serta sistem obat kombinasi. Konsisten dengan uji MTT, 5-FU (~ 20%) menghasilkan apoptosis sel kanker yang lebih besar dibandingkan dengan LY (~ 12%), sedangkan kombinasi 5-FU + LY menginduksi kematian sel apoptosis yang lebih besar (~ 30%). Dibandingkan dengan kelompok lain, FLNP menginduksi apoptosis yang lebih besar (~ 48%) sel kanker menunjukkan bahwa serapan seluler yang dimediasi reseptor sangat meningkatkan konsentrasi obat antikanker intraseluler yang menghasilkan efek terapeutik yang lebih tinggi. Alasan penting untuk efek antikanker yang lebih tinggi dari FLNP terutama dikaitkan dengan pelepasan berurutan obat yang dienkapsulasi di mana LY akan membuat sel tumor peka dan 5-FU akan menginduksi efek sitotoksiknya yang kuat. Terapi antikanker bekerja dengan menginduksi apoptosis pada sel kanker tanpa merusak sel normal di sekitarnya. Aktivitas apoptosis FLNP yang cukup besar terutama dikaitkan dengan akumulasi nanopartikel yang lebih tinggi dalam sel melalui serapan endositosis dan pelepasan obat secara berurutan di lingkungan intraseluler yang menghasilkan efek terapeutik sinergis. Diperkirakan bahwa pelepasan awal dari autophagy inhibitor (LY) akan mengganggu mekanisme perlindungan sel kanker dan setelah itu 5-FU akan bertindak lebih kuat dalam sel kanker.
Hasil analisis sitometrik aliran representatif dari apoptosis sel sel kanker HT-29 pada inkubasi dengan 5-FU, LY, 5-FU + LY dan FLNP gratis, masing-masing. Kiri bawah, sel hidup; kanan bawah, sel-sel apoptosis awal; kanan atas, sel-sel apoptosis terlambat; dan kiri atas, sel nekrotik
Analisis Western Blot
Mekanisme kerja formulasi ditentukan oleh analisis Western blot (Gbr. 7). Ekspresi tingkat protein pro-apoptosis dan anti-apoptosis pada paparan formulasi masing-masing disajikan pada Gambar. 8. p53 adalah salah satu pengatur siklus sel yang penting, dan downregulasinya dikaitkan dengan peningkatan kelangsungan hidup sel kanker. Dapat dilihat bahwa formulasi secara signifikan menurunkan tingkat ekspresi p53 yang menunjukkan efek luar biasa pada sel ESCC. Telah dilaporkan bahwa kerusakan DNA menghasilkan aktivasi kaskade kaspase yang menghasilkan pembelahan PARP-1 yang dianggap sebagai tanda apoptosis sel [22, 23]. Hasil kami dengan jelas menunjukkan bahwa 5-FU dan LY secara individual meningkatkan ekspresi caspase-3 dan PARP, sementara seperti yang diharapkan FLNP menginduksi ekspresi luar biasa dari penanda protein ini yang menunjukkan efek antikanker yang unggul. Secara konsisten, FLNP secara signifikan menurunkan regulasi ekspresi protein anti-apoptosis (Bcl-2), menunjukkan efisiensinya untuk meningkatkan kemanjuran terapeutik dalam ESCC.
Analisis Western blot sel kanker HT-29 pada inkubasi dengan 5-FU, LY, 5-FU + LY dan FLNP gratis, masing-masing. Analisis Western blot dari caspase-3, PARP, Bcl-2 dan p53 yang dibelah telah ditentukan
Studi efikasi antitumor in vivo pada model hewan. Formulasi gratis 5-FU, LY, 5-FU + LY dan FLNP, masing-masing, diberikan kepada tikus tumor, dan kemanjurannya dipelajari selama 20 hari
Analisis Penghambatan Pertumbuhan Tumor di Vivo
Tikus disuntik dengan formulasi masing-masing pada tikus, dan volume tumor dicatat hingga 20 hari. Seperti yang terlihat (Gbr. 8), kelompok kontrol menunjukkan peningkatan volume tumor yang stabil pada setiap titik waktu hingga hari ke 18. Dibandingkan dengan kontrol, obat bebas mengontrol pertumbuhan tumor; namun, itu tidak memuaskan. Campuran koktail dua obat relatif lebih efektif daripada obat individu dalam mengendalikan volume tumor. Yang penting, FLNP menunjukkan secara signifikan (p < 0,05; p < 0,0001) kemanjuran antitumor lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok lain. Volume tumor akhir adalah ~ 500 mm
3
dibandingkan dengan ~ 1400 mm
3
untuk tikus yang tidak diobati. Efek antitumor yang lebih tinggi secara signifikan dalam model tumor dikaitkan dengan partikel berukuran nano yang mungkin terakumulasi dalam jaringan tumor karena peningkatan permeasi dan efek retensi. Pelepasan obat yang terkontrol dalam jaringan tumor juga berkontribusi pada kemanjurannya yang lebih tinggi [24].
Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, nanoliposom PEGylated 5-fluorouracil (5-FU) dan LY294002 (LY) berhasil disiapkan untuk menargetkan karsinoma sel skuamosa esofagus (ESCC). FLNP menunjukkan serapan seluler yang dimediasi reseptor yang akan memungkinkan pelepasan obat secara bertahap dalam lingkungan asam. Kombinasi 5-FU dan LY menghasilkan efek sitotoksik yang lebih tinggi dibandingkan dengan obat individu. Yang paling penting, FLNP menunjukkan efek antikanker yang jauh lebih tinggi pada sel kanker dibandingkan dengan kombinasi koktail gratis. Pelepasan LY yang lebih cepat dari FLNP mengarah pada penghambatan autophagy yang meningkatkan sensitivitas sel kanker terhadap 5-FU, menghasilkan lebih banyak kematian sel. Secara konsisten, FLNP menginduksi apoptosis yang lebih besar (~ 48%) sel kanker dibandingkan dengan kelompok lain. Analisis Western blot dengan jelas menunjukkan bahwa 5-FU dan LY secara individual meningkatkan ekspresi caspase-3 dan PARP, sementara seperti yang diharapkan FLNP menginduksi ekspresi luar biasa dari penanda protein ini yang menunjukkan efek antikanker yang unggul. We believe that the programmed release of autophagy inhibitor and chemotherapeutic drug from a single nanocarrier will increase the prospect of anticancer therapy in ESCC. A broader study on different squamous cell carcinoma and development of the orthotropic model and patient-derived xenograft (PDX) model will be the subject of future investigation.
