Dekorasi Nanovesikel dengan Peptida Penyisipan pH (Rendah) (pHLIP) untuk Pengiriman yang Ditargetkan
Abstrak
Keasaman pada permukaan sel kanker merupakan ciri lingkungan mikro tumor, yang tidak bergantung pada perfusi tumor, sehingga dapat berfungsi sebagai biomarker umum untuk menargetkan sel tumor. Kami menggunakan peptida penyisipan pH (rendah) (pHLIP) untuk dekorasi liposom dan niosom. pHLIP merasakan pH pada permukaan sel kanker dan menyisipkan ke dalam membran sel yang ditargetkan, dan membawa nanomaterial ke dekat membran sel. Liposom DMPC dan niosom Tween 20 atau Span 20 dengan dan tanpa pHLIP di lapisannya dikarakterisasi sepenuhnya untuk mendapatkan pemahaman mendasar tentang fitur nanocarrier dan memfasilitasi desain rasional dari nanovektor sensitif keasaman. Stabilitas sampel dari waktu ke waktu dan dengan adanya serum ditunjukkan. Ukuran, -potensial, dan morfologi nanovektor, serta kemampuannya untuk menjebak probe hidrofilik dan memodulasi pelepasannya diselidiki. Vesikel yang didekorasi dengan pHLIP dapat berguna untuk mendapatkan pelepasan zat aktif biologis yang berkepanjangan (dimodifikasi) untuk menargetkan tumor dan jaringan penyakit asam lainnya.
Pengantar
Sekitar satu abad yang lalu, Paul Ehrlich melontarkan gagasan untuk mewujudkan “peluru ajaib” ke pengiriman obat yang spesifik dan lebih efektif [1]. “Peluru ajaib” harus mampu melindungi obat yang dikirim dari lingkungan yang keras, mengurangi efek samping dengan menargetkan obat ke jaringan yang sakit, meningkatkan farmakokinetik dan farmakodinamik obat, dan memodulasi pelepasan obat [2].
Pada tahun 1965, Bangham mengamati vesikel berbasis fosfolipid untuk pertama kalinya [3] dan, pada tahun-tahun berikutnya, Gregory Gregoriadis menetapkan konsep bahwa liposom dapat merangkum obat dan kemudian digunakan sebagai sistem penghantaran obat. Secara khusus, mereka disusun oleh lapisan ganda fosfolipid tertutup (lamellae), di mana rantai lipid hidrofobik ditutup antara dua lapisan kelompok kepala hidrofilik. Bilayer tertutup mengelilingi inti berair, sehingga memungkinkan untuk lokalisasi obat lipofilik atau hidrofilik masing-masing [4, 5].
Ukuran liposom merupakan parameter penting dalam mempengaruhi nasib pembawa setelah pemberian, dalam hal penyerapan protein plasma, pengenalan oleh sistem retikuloendotelial (RES), waktu paruh sirkulasi, dan perdagangan seluler. Pembawa berukuran nano dapat mendukung internalisasi sel dan penargetan tumor, sehingga banyak peneliti telah berfokus pada “nanonisasi” [6,7,8,9].
Untuk mendapatkan nanocarrier yang lebih fleksibel dan lebih ekonomis, surfaktan sintetis telah digunakan untuk mendapatkan sistem penghantaran obat seperti liposom. Surfaktan non-ionik banyak digunakan untuk tujuan ini, dan mampu merakit sendiri menjadi vesikel unilamellar atau multilamelar (non -liposom ionik , niosom, atau vesikel surfaktan non-ionik). Surfaktan ester sorbitan (Spans®) adalah zat lipofilik yang banyak digunakan dalam preparasi niosom. Untuk memperpanjang waktu sirkulasi vesikel dan mendapatkan nanocarrier "siluman", penggabungan polietilen glikol (PEG) adalah pendekatan standar emas:melalui konjugasi ini, surfaktan ester ethoxyethylatedsorbitan (Tweens®) diperoleh. Baik Span maupun Tween dicirikan oleh nilai keseimbangan hidrofilik/lipofilik (HLB) yang berbeda dan pilihan surfaktan memungkinkan pembuatan niosom dengan sifat yang diinginkan [10]. Selanjutnya, penambahan kolesterol digunakan untuk meningkatkan stabilitas bilayer dengan meregangkan ekor surfaktan, mempengaruhi gel surfaktan ke suhu transisi fase cair dan memberikan kekakuan bilayer lipofilik [11, 12]. Nanocarrier "dioptimalkan" dirancang untuk meningkatkan formulasi dan/atau meningkatkan penargetan [10].
Saat ini, kanker merupakan salah satu penyebab utama kematian di dunia. Pendekatan terapeutik saat ini memiliki sejumlah keterbatasan termasuk penghantaran obat yang tidak efisien ke tumor dan kurangnya penargetan tumor yang terkait dengan efek samping yang tidak diinginkan dan berbahaya, yang mungkin dapat diatasi dengan pendekatan nanoteknologi [13].
Saat ini, berbagai pendekatan penargetan sedang dikembangkan. Kebanyakan dari mereka didasarkan pada penargetan biomarker tertentu yang diekspresikan secara berlebihan pada permukaan sel kanker. Namun, karena fakta bahwa tumor manusia sangat heterogen, pendekatan penargetan tumor yang lebih umum akan jauh lebih menguntungkan. Keasaman pada permukaan sel kanker merupakan ciri dari lingkungan mikro tumor, dan tidak tergantung pada perfusi tumor, sehingga dapat berfungsi sebagai biomarker umum untuk menargetkan sel tumor [14]. Teknologi peptida penyisipan pH (rendah) (pHLIP) berkembang pesat untuk menargetkan pencitraan dan molekul kecil terapeutik, serta bahan nano untuk tumor. pHLIP merasakan pH pada permukaan sel kanker dan memasukkan ke dalam membran sel yang ditargetkan [15, 16]. Mekanisme penyisipan pHLIP dipicu oleh protonasi residu peptida bermuatan negatif pada pH rendah (pH <-7,0). Hal ini menyebabkan peningkatan hidrofobisitas peptida sehingga menggeser keseimbangan menuju partisi peptida ke dalam bilayer [17]. Nanocarrier yang didekorasi dengan pHLIP bersifat biokompatibel, dapat menargetkan tumor, dan menunjukkan peningkatan penyerapan seluler oleh sel kanker. Di antara nanopartikel berlapis pHLIP yang diselidiki adalah lipid, polimer, dan nanomaterial berbasis logam [18,19,20,21].
Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk sepenuhnya mengkarakterisasi nanocarrier vesikular baru yang didekorasi oleh pHLIP untuk mendapatkan pemahaman mendasar tentang fitur nanocarrier dan memfasilitasi desain rasional dari nanovector sensitif keasaman.
Bahan dan Metode
Materi
Polioksietilenasorbitan monolaurat (Tween 20), sorbitan monolaurat (Span 20), kolesterol (Chol), garam Hepes {N -(2-idroxyethyl) piperazine-T′ -(2-ethanesulfonic acid)}, serum manusia, Sephadex G-75, calcein, dan diphenylhexatriene (DPH) dibeli dari Sigma-Aldrich. 1,2-Dimyristoyl-sn -glisero-3-fosfokolin (DMPC) dan 1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfoetanolamina-N -[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] garam natrium (DSPE-maleimide) dibeli dari Avanti Polar Lipid dan pyrene diperoleh dari Fluka. Peptida pHLIP (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) disintesis dan dimurnikan oleh CS Bio. Semua produk dan reagen lainnya memiliki tingkat analitis.
Sintesis DSPE-pHLIP
pHLIP terkonjugasi dengan lipid DSPE dalam metanol oleh konjugasi kovalen DSPE-maleimide dengan residu sistein tunggal di N-terminus pHLIP, seperti yang dijelaskan sebelumnya [18, 21, 22]. Secara singkat, 5 mg peptida yang dilarutkan dalam 250 L metanol (ditiup dengan argon) dan DSPE-maleimide (dari larutan stok 9,9 mM) yang dilarutkan dalam kloroform dicampur dengan rasio molar 1:1. Campuran reaksi disimpan pada suhu kamar selama sekitar 2-6 jam sampai konjugasi selesai. Kemajuan reaksi dalam konjugasi DSPE-malemide dengan pHLIP dipantau oleh RP-HPLC menggunakan gradien dari 25 hingga 80% asetonitril dalam air yang mengandung 0,05% TFA dengan memantau penurunan puncak yang sesuai dengan pHLIP yang tidak berlabel dalam campuran reaksi. Konstruksi yang disintesis dikarakterisasi dengan spektrometri massa SELDI-TOF. Konsentrasi konjugat DSPE-pHLIP ditentukan dengan absorbansi menggunakan koefisien kepunahan molar untuk pHLIP:ε280 = 13.940 jt
−1
cm
−1
.
Preparasi dan Pemurnian Vesikel
Metode penguapan lapisan tipis digunakan untuk membuat surfaktan non-ionik (dari Tween 20 atau Span 20) dan vesikel fosfolipid (dari DMPC), dengan dan tanpa pHLIP. Dalam setiap formulasi vesikel, kolesterol ditambahkan dalam rasio molar yang berbeda (Tabel 1) [23].
Komposisi sampel telah dioptimalkan dengan memilih struktur yang sebelumnya berkarakteristik baik [24, 25] di mana jumlah pHLIP yang sama telah ditambahkan.
Komponen lipofilik pertama kali dilarutkan dalam CHCl3 :CH3 campuran OH (3:1); pelarut organik kemudian dihapus di bawah vakum pada suhu yang berbeda tergantung pada sampel. Film yang diperoleh dihidrasi dengan 5 mL buffer Hepes (0,01 M pH 7,4) atau larutan natrium calcein 10
−2
M. Suspensi dicampur dengan vortex selama sekitar 5 menit, diikuti dengan sonikasi (lihat File tambahan 1:Tabel S1, informasi pendukung) menggunakan mikroprobe yang beroperasi pada 20 kHz (VibraCell-VCX 400-Sonics, Taunton, MA, USA). Sonikasi LipoDMPC dilakukan di bawah atmosfer inert untuk mencegah oksidasi.
Suspensi vesikel kemudian dimurnikan dengan kromatografi permeasi gel menggunakan Sephadex G-75 (kolom gelas 50 × 1,2 cm) dan buffer Hepes sebagai eluen. Setelah itu, suspensi vesikel yang telah dimurnikan disaring dengan menggunakan filter selulosa dengan diameter pori yang sesuai.
Metode preparasi yang sama digunakan untuk menyiapkan niosom dan liposom berlapis pHLIP.
Pengukuran Hamburan Cahaya Dinamis
Ukuran rata-rata dan distribusi ukuran vesikel diukur pada T = 25 °C dengan hamburan cahaya dinamis (DLS), menggunakan Malvern NanoZetaSizer ZS90, dilengkapi dengan laser HeNe 5 mW (panjang gelombang = 632,8 nm) dan korelator digital. Fungsi autokorelasi ternormalisasi dari intensitas hamburan pada sudut 90° dianalisis dengan algoritma Contin untuk mendapatkan distribusi koefisien difusi partikel D , maka distribusi radius hidrodinamika efektif RH vesikel melalui hubungan Stokes-Einstein RH =KBT /6πηS , di mana KBT adalah energi panas dan adalah viskositas pelarut. Lebar distribusi ukuran niosom/liposom agak kecil tetapi tidak dapat diabaikan. Nilai yang dilaporkan pada Tabel 2 sesuai dengan diameter hidrodinamik rata-rata tertimbang intensitas dari partikel [26].
ζ-Pengukuran Potensial
Pengukuran mobilitas elektroforesis dilakukan dengan teknik elektroforesis Doppler laser, menggunakan peralatan Malvern NanoZetaSizer ZS90. Mobilitas u diubah menjadi ζ -potensial menggunakan relasi Smoluchowski = uη/є, di mana dan masing-masing adalah viskositas dan permitivitas fase pelarut [27].
Hamburan Sinar-X Sudut Kecil
Eksperimen hamburan sinar-X sudut kecil (SAXS) dilakukan di Fasilitas Radiasi Sinkronisasi Eropa (ESRF, Grenoble, Prancis). Penggunaan beamline kecemerlangan tinggi ID02 memungkinkan untuk melakukan pengukuran pada larutan encer di wilayah transfer momentum 0,1 nm
−1q 6 nm
−1
, q = (4π/λ)sin(θ/2), di mana adalah sudut hamburan dan = 0,1 nm panjang gelombang sinar-X. Skala panjang yang diselidiki terkait adalah antara 1 dan 60 nm, cocok untuk mengakses struktur internal vesikel niosomal dan liposomal. Semua eksperimen dilakukan di T = 25 °C dengan waktu penyinaran yang singkat, 0,1 detik, untuk mencegah kerusakan akibat radiasi. Untuk setiap sampel, intensitas hamburan pada sudut hamburan yang berbeda ditangkap pada detektor 2D, kemudian dikelompokkan kembali secara sudut, dikurangi untuk latar belakang dan kontribusi pelarut, dan dianalisis untuk memperoleh informasi tentang bentuk dan struktur internal vesikel dalam larutan.
Dalam kasus vesikel unilamellar, bilayer tertutup dimodelkan dengan tiga cangkang konsentris yang sesuai dengan kelompok kepala eksternal, rantai hidrofobik, dan kelompok kepala internal. Distribusi Schulz untuk ukuran vesikel diasumsikan.
Cryo-TEM
Larutan vesikel (tetesan 5 L) disebarkan pada kisi-kisi mikroskop elektron formar/karbon Lacey dan diawetkan dalam keadaan terhidrasi beku dengan pembekuan cepat dalam etana cair. Proses vitrifikasi dilakukan menggunakan sistem FEI Vitrobot dengan setting single blot 3 s, offset 1, dan drain dan waiting time 1 s. Mikroskop elektron transmisi (TEM) (JEOL 2100) dengan tegangan percepatan 200 kV pada perbesaran dalam kisaran × 10.000 hingga × 150.000 digunakan untuk mencitrakan vesikel.
Studi Stabilitas
Studi stabilitas fisik niosom dan liposom, dibuat dengan dan tanpa pHLIP, dilakukan pada dua suhu penyimpanan yang berbeda (25 °C dan 4 °C). Tujuannya adalah untuk mengevaluasi apakah perubahan signifikan dalam ukuran dan -potensial dari dispersi vesikel terjadi selama 90 hari. Sampel dari setiap batch diambil pada interval waktu tertentu (1, 30, 60, dan 90 hari) dan ukuran vesikel dan -potensial ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Demikian pula, stabilitas vesikel diselidiki juga dengan adanya cairan biologis, seperti serum manusia. Suspensi dikontakkan dengan 45% serum manusia pada suhu 37 °C. Pada interval waktu tertentu (0, 30 menit, 1 jam, 2 jam, dan 3 jam), variasi ukuran vesikel dan -potensial ditentukan seperti yang dijelaskan.
Karakterisasi Bilayer
Fluiditas dan mikroviskositas-polaritas bilayers niosomal dan liposomal diakses dengan pengukuran fluoresensi dari dua probe fluoresen, diphenylhexatriene (DPH) dan pyrene, masing-masing, terletak di wilayah hidrofobik membran bilayer. Baik DPH (2 mM) dan pyrene (4 mM), masing-masing 220 L dan 2,5 mg, ditambahkan ke campuran surfaktan atau fosfolipid/kolesterol sebelum preparasi vesikel [28]. Setelah itu, vesikel yang mengandung pyrene dimurnikan seperti yang dijelaskan sebelumnya, sementara vesikel yang mengandung DPH disaring melalui ukuran pori yang semakin kecil (dari 5,0 menjadi 0,22 m).
Pengukuran anisotropi fluoresensi dilakukan pada suhu kamar menggunakan spektrofluorometer LS55 (PerkinElmer, MA, USA) pada λkecuali = 400 nm dan em = 425 nm dan anisotropi fluoresensi (A ) sampel dihitung menurut persamaan berikut [29]:
dimana Akuvv dan Akuvh adalah intensitas fluoresensi yang dipancarkan (satuan arbitrer), masing-masing, paralel dan tegak lurus terhadap arah cahaya eksitasi terpolarisasi vertikal. Faktor koreksi G = Ihv/Akuhh adalah rasio antara komponen emisi terpolarisasi vertikal dan horizontal ketika cahaya eksitasi terpolarisasi horizontal. Nilai anisotropi fluoresensi berbanding terbalik dengan fluiditas membran. Oleh karena itu, nilai anisotropi fluoresensi yang tinggi sesuai dengan tatanan struktural yang tinggi dan/atau fluiditas membran yang rendah [30].
Untuk mengevaluasi mikroviskositas dan mikropolaritas lapisan ganda vesikel, percobaan fluoresensi dengan pirena dilakukan dengan spektrofluorometer Perkin-Elmer LS55 di λexc = 330 nm, merekam spektrum emisi dalam kisaran 350 < λem < 550 nm [28]. Struktur halus fluoresensi pirena menyajikan lima puncak. Rasio antara intensitas pita vibrasi pertama (372 nm) dan ketiga (382 nm) dari spektrum fluoresensi pirena, I1 /Aku3 , terkait dengan polaritas lingkungan pyrene [31]. Memang, nilai I . yang rendah 1 /Aku3 rasio sesuai dengan lingkungan nonpolar. Selanjutnya, molekul pyrene dimasukkan ke dalam lapisan ganda vesikel dapat membentuk excimers intramolekul dan proses ini sensitif terhadap viskositas lingkungan mikro probe [32]. Oleh karena itu, rasio intensitas fluoresensi excimer/monomer, IE /AkuM , terkait dengan mikroviskositas.
Studi ini dilakukan pada vesikel yang dibuat dengan dan tanpa pHLIP dan hasil yang diperoleh kemudian dibandingkan.
Studi Rilis Calcein
Surfaktan non-ionik atau vesikel fosfolipid diisi dengan calcein pada konsentrasi 10
−2
M. Pada konsentrasi ini, fluoresensi calcein padam sendiri [33]. Pengukuran dequenching kemudian digunakan untuk menentukan pelepasan calcein dari inti berair vesikel. Probe fluoresen dimasukkan ke dalam vesikel selama hidrasi film tipis dengan penambahan 5 mL larutan berair calcein. Suspensi vesikel dimurnikan dengan kromatografi permeasi gel, dikontakkan dengan 45% serum manusia atau Hepes, dan kemudian dimasukkan ke dalam kantong dialisis membran selulosa (berat molekul cut-off 8.000 Da dari Spectra/Por®). Eksperimen pelepasan dilakukan pada suhu 37 °C, di bawah pengadukan magnetik dalam buffer Hepes (10 mM, pH 7,4) sebagai media eksternal. Aliquot dari media eksternal ditarik pada waktu yang berbeda selama 0-24 jam. Dari waktu ke waktu, alikuot yang ditarik dimasukkan kembali ke dalam sistem [34].
Pelepasan calcein dipantau dengan pengukuran fluoresensi medium menggunakan spektrofluorometer Perkin-Elmer LS50B dengan ex = 492 dan em =520nm. Nilai referensi F∞ (satuan arbitrer), berkorelasi dengan jumlah total calcein yang terperangkap dalam vesikel [35], ditentukan setelah gangguan vesikel menggunakan isopropil alkohol (1:1 v /v ). Persentase rilis (F %) pada setiap titik waktu diperoleh dengan menggunakan persamaan berikut:
$$ F\%={F}_t/{F}_{\infty }x\ 100 $$
dimana Ft (satuan arbitrer) adalah fluoresensi yang dibaca pada titik waktu tertentu t .
Analisis Statistik
ANOVA satu arah digunakan untuk analisis statistik. A posteriori Bonferroni t uji dilakukan untuk mengevaluasi signifikansi statistik dari uji ANOVA. p nilai < 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Hasil rata-rata dari tiga percobaan ± standar deviasi.
Hasil dan Diskusi
Vesikel Tween20-, Span20-, dan DMPC, dibuat dengan dan tanpa DSPE-pHLIP, dikarakterisasi untuk ukuran dan -potensial (Tabel 2).
Menurut hasil yang disajikan pada Tabel 2, sampel yang dianalisis tidak menunjukkan variasi yang signifikan baik dalam ukuran atau potensi , terlepas dari keberadaan pHLIP.
Rentang ukuran yang dilaporkan di atas dikonfirmasi dengan teknik analisis yang berbeda, seperti cryo-TEM (Gbr. 1).
Gambar cryo-TEM representatif dari niosom dan liposom yang dilapisi dengan pHLIP. Gambar niosom NioSpan20-pHLIP (a ) dan liposom LipoDMPC-pHLIP (b ) diperoleh pada perbesaran × 10.000 dan liposom LipoDMPC-pHLIP (c ) diperoleh pada perbesaran × 40.000
Struktur internal niosom/vesikel dengan dan tanpa DSPE-pHLIP ditentukan dengan eksperimen SAXS. Spektrum intensitas SAXS, yang disajikan pada Gambar. 2, berbeda, menunjukkan bahwa setiap sistem memiliki fitur khusus.
spektrum SAXS. Spektrum intensitas niosom/vesikel tanpa (simbol hitam terbuka) dan dengan DSPE-pHLIP (simbol warna)
Niosom berbasis Tween20 adalah unilamellar, sedangkan vesikel DMPC menunjukkan derajat multilamellar tertentu (seperti liposom), seperti yang ditunjukkan oleh adanya puncak karakteristik di q 1 nm
−1
, sesuai dengan jarak interlamelar 6 nm (sekitar 5 nm lipid bilayer dan 1 nm air). Vesikel berbasis Span20 pasti multilamellar, dengan puncak karakteristik di q = 1,6 nm
−1
sesuai dengan jarak interlamelar 3,8 nm, sama dengan dua kali panjang molekul Span20. Hasil menunjukkan bahwa cangkang berlapis-lapis dari vesikel Span20 terdiri dari lapisan ganda yang berdekatan dengan hampir tidak ada air interlamellar.
Kehadiran DSPE-pHLIP (kurang dari 1% fraksi mol) tidak secara dramatis mempengaruhi sistem. Intensitas yang tersebar di semua q . yang diselidiki -rentang sangat mirip, menunjukkan fraksi yang sebanding dari bahan terstruktur dan ukuran keseluruhan partikel vesikular yang sebanding.
Vesikel berbasis DMPC menunjukkan sedikit peningkatan jumlah lapisan ganda dalam liposom, seperti yang dapat dikurangkan dari peningkatan intensitas puncak Bragg di q = 1 nm
−1
. Penyisipan fraksi rendah rantai DSPE C18, terkait dengan setiap molekul peptida, tidak mengubah ketebalan lapisan ganda lipid, dan terutama ditentukan oleh fraksi besar kolesterol sehubungan dengan DMPC (sekitar 40-50%). Pada konsentrasi kolesterol ini, rantai lipid diatur dalam fase urutan cair (Lo), dan ditandai dengan pemisahan urutan posisi lateral rantai yang lemah sehubungan dengan urutan orientasi tinggi di sepanjang rantai dan mampu menampung sedikit C18- rantai tanpa perubahan struktural [36]. Vesikel berlapis-lapis berbasis Span20 juga tidak menunjukkan perubahan dalam struktur internalnya.
Dalam sistem Tween20 + pHLIP, sejumlah kecil kristal kolesterol hadir, seperti yang ditunjukkan oleh puncak tajam yang khas pada q = 1,84 nm
−1
(jarak karakteristik 3,41 nm), dan struktur vesikel tidak terpengaruh. Kehadiran beberapa mikrokristalin telah sering ditemukan terkait dengan niosom berbasis Tween [37] dalam jumlah tergantung pada komposisi, prosedur preparasi, dan pemurnian. Pada Gambar. 2, dua spektrum eksperimental vesikel Tween20 dan Tween20 + pHLIP ditunjukkan bersama-sama dengan kurva pemasangan yang diperoleh dengan memodelkan bilayer tertutup sferis dengan tiga cangkang konsentris:kelompok kepala eksternal, rantai, dan kelompok kepala internal. Ukuran rata-rata pemasangan vesikel adalah sekitar 168 nm di kedua sistem, sesuai dengan hasil DLS. Parameter struktural adalah sama untuk dua lapisan ganda tertutup (lihat File tambahan 1:Gambar S1 dan Tabel S2) kecuali untuk kulit luar:dengan adanya DSPE-pHLIP, sedikit penurunan (5%) dari kerapatan elektron headgroup diamati (dari 0,42 hingga 0,40 e/Å
3
), bersama-sama dengan peningkatan kekasaran lapisan. Hasil ini menunjukkan bahwa penambahan DSPE-pHLIP terutama mempengaruhi cangkang luar vesikel. Ini konsisten dengan gambar di mana rantai DSPE C18 dimasukkan ke dalam bilayer dan menambatkan peptida ke permukaan vesikel, di antara kelompok kepala polietilen-glikol yang diperpanjang dan bercabang. Kami mencatat bahwa kemampuan peptida pHLIP itu sendiri (tidak terkait dengan molekul lipid) untuk berinteraksi dengan permukaan luar vesikel pada pH tinggi dan memasukkan ke dalam bilayer pada pH rendah baru-baru ini diamati oleh SAXS dalam kasus bilayer fosfolipid tak jenuh [38 ]. Dalam penelitian ini, fraksi mol peptida secara signifikan lebih rendah dan peptida terkait dengan lipid, karena tujuannya adalah untuk merancang nanovektor obat sensitif pH yang dilapisi pHLIP. Asosiasi pHLIP didorong oleh interaksi hidrofobik dari rantai DSPE C18 terkonjugasi yang dimasukkan ke dalam wilayah hidrofobik dari nanovector. Peptida pHLIP berlabuh dan terletak di wilayah kelompok kepala eksternal, cenderung berinteraksi dengan membran target pada pH asam dan/atau melepaskan konten nanovektor setelah penataan ulang bilayer di lingkungan pH rendah.
Untuk menyelidiki apakah keberadaan pHLIP dapat mempengaruhi sifat mikroreologi bilayer (fluiditas, mikroviskositas, dan polaritas), dilakukan karakterisasi cangkang lipofilik. Studi karakterisasi dilakukan dengan menggunakan fluorescent probe pyrene, ditambahkan ke sampel pada awal prosedur preparasi. Karena sifatnya yang lipofilik, ia menyisipkan ke dalam lapisan ganda vesikel dan memberikan informasi tentang polaritas dan mikroviskositas lingkungan membran.
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3, di ketiga set sampel, nilai polaritas hanya sedikit menurun dengan adanya pHLIP dibandingkan dengan vesikel pasangan tanpa pHLIP, sedangkan nilai mikroviskositas menunjukkan peningkatan tiga kali lipat, untuk semua vesikel.
Bilayer selanjutnya dikarakterisasi dengan pengukuran anisotropi fluoresensi dari probe fluoresen lipofilik lainnya, DPH, yang dimasukkan ke dalam lipid. Pengukuran ini mencerminkan pergerakan probe dan orientasinya di dalam bilayer yang memberikan informasi tentang fluiditas bilayer yang dapat mempengaruhi kemampuan vesikel untuk melepaskan isinya [29]. Nilai anisotropi fluoresensi berbanding terbalik dengan fluiditas membran. Oleh karena itu, nilai anisotropi fluoresensi yang tinggi sesuai dengan tatanan struktural yang tinggi dan/atau fluiditas membran yang rendah, seperti pada fase berurutan cairan [30].
Nilai anisotropi untuk setiap sampel ditunjukkan pada Tabel 3. Data menunjukkan bahwa keberadaan DSPE-pHLIP dalam vesikel meningkatkan fluiditas membran, karena anisotropi fluoresensi menurun. Hal ini juga diketahui bahwa fluiditas bilayer dipengaruhi tidak hanya oleh urutan dan organisasi lateral rantai apolar tetapi juga oleh headgroup kutub [31]. Hasil SAXS pada tiga sistem yang berbeda menunjukkan bahwa molekul DSPE-pHLIP terutama mempengaruhi wilayah kelompok kepala, yang akhirnya menyebabkan kemasan kepala kutub yang berbeda. Hasil struktural tampaknya cocok dengan sifat mikroreologi bilayer dengan adanya DSPE-pHLIP terkait seperti yang diungkapkan oleh penyisipan dua probe yang berbeda. Hasil menunjukkan peningkatan mikroviskositas seperti yang diungkapkan oleh pyrene, sebuah probe yang dapat dimasukkan dekat dengan wilayah luar (pyrene log P adalah 4,88). Di sisi lain, DPH diasumsikan tertanam di inti bilayer, berorientasi sejajar dengan sumbu rantai asil lipid atau dibatasi di tengah bilayer, sejajar dengan permukaan. Hal ini sebagian besar sensitif terhadap reorientasi sudut rantai asil amfifil [39]. Peningkatan fluiditas, seperti yang diungkapkan oleh DPH, dapat dikaitkan dengan efek penyisipan rantai DSPE di antara rantai asil lainnya dan efek partisi pHLIP di wilayah gugus kepala kutub, mengubah sifat pengepakan surfaktan. (Gbr. 3).
Representasi interaksi pHLIP dengan membran vesikel
Studi karakterisasi lebih lanjut dilakukan pada preparat yang diperiksa. Semua sampel, disiapkan dengan dan tanpa pHLIP, disimpan selama 90 hari pada suhu 4 °C untuk mengevaluasi stabilitas vesikel dari waktu ke waktu, dengan mengukur ukuran dan variasi potensial (File tambahan 1:Gambar S2). Tidak ada variasi signifikan dalam ukuran dan -potensial yang diamati selama percobaan; oleh karena itu, semua sediaan yang diperiksa menghasilkan kestabilan jika disimpan pada suhu 4 °C.
Selain itu, stabilitas sampel diperiksa dengan adanya 90% (v /v ) serum manusia dan disimpan pada suhu 37 °C selama 3 jam (File tambahan 1:Gambar S3).
Dalam kontak dengan serum manusia, vesikel Tween20 menunjukkan peningkatan ukuran, meskipun tetap di bawah 300 nm. Ukuran dan nilai PDI diukur agar konstan selama percobaan 3 jam, menunjukkan bahwa vesikel dalam suspensi tetap utuh sepanjang percobaan.
Kedua sampel Span20 yang kontak dengan serum manusia menunjukkan peningkatan ukuran, terutama pada preparasi dengan pHLIP, sedangkan nilai PDI menunjukkan distribusi ukuran yang homogen (data tidak ditampilkan). Peristiwa ini dapat disebabkan oleh penyerapan protein plasma pada permukaan niosomal, sebagai akibat dari interaksi elektrostatik, namun tanpa menimbulkan gangguan vesikel. Hipotesis ini didukung oleh penurunan -potensial setelah kontak vesikel dengan serum manusia. Fenomena ini terjadi ketika -potensial mencapai nilai yang sedikit negatif, di sekitar daerah netralitas, membuat sistem menjadi tidak stabil, dan vesikel mulai berkumpul.
Selain Tween20, vesikel DMPC menunjukkan peningkatan ukuran dibandingkan dengan sampel pra-kontak. Namun, variasi ini ternyata tidak signifikan dan nilai ukuran dipertahankan di bawah 280 nm (DMPC) atau di bawah 240 nm (DMPC + pHLIP).
Kemampuan pelepasan dievaluasi untuk sampel yang disiapkan dengan dan tanpa pHLIP mengikuti jumlah calcein (probe hidrofilik) yang dilepaskan dari vesikel dari waktu ke waktu.
Penelitian dilakukan pada suhu 37 °C untuk jangka waktu 24 jam, dengan memaparkan sampel yang dimurnikan dengan buffer HEPES atau serum manusia. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, profil pelepasan calcein ternyata sangat mirip untuk Tween20 dan Tween20-pHLIP dalam buffer HEPES atau serum manusia.
Profil rilis Calcein. NioTween20 dan NioTween20-pHLIP dihubungi dengan buffer HEPES (a ) atau serum manusia (b )
Jumlah calcein yang dilepaskan antara 30 dan 50% menunjukkan tidak ada perbedaan dalam kemampuan pelepasan antara sampel yang disiapkan dengan dan tanpa pHLIP.
Hasil yang sama diperoleh untuk sampel Span dan DMPC (data tidak ditampilkan).
Profil rilis yang sebanding telah dilaporkan untuk berbagai nanocarrier responsif terhadap rangsangan, seperti kubosom termo-sensitif [40] atau nanocarrier rakitan polimer (SAN) [41, 42].
Kesimpulannya, perbedaan fisiko-kimia yang diamati dalam hal mikroviskositas dan fluiditas untuk sampel yang disiapkan dengan dan tanpa pHLIP (Tabel 3) tidak mempengaruhi kemampuan pelepasannya (Gbr. 4), menurut bukti bahwa penyisipan DSPE-pHLIP molekul mempengaruhi terutama wilayah headgroup. Data ini sesuai dengan hasil yang dilaporkan sebelumnya yang menunjukkan bahwa pada pH netral dan tinggi, pHLIP terikat pada permukaan liposom yang dibuat oleh 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn -glisero-3-fosfokolin (POPC) dan tidak menyebabkan fusi atau kebocoran membran.
Kesimpulan
Studi ini mengkonfirmasi kemungkinan mempersiapkan vesikel yang didekorasi dengan pHLIP. Sampel stabil jika disimpan pada suhu 4 °C selama minimal 3 bulan dan dengan adanya serum. Selanjutnya, nanovektor yang diusulkan mampu menjebak probe hidrofilik dan memodulasi pelepasannya.
Vesikel pHLIP sepenuhnya dikarakterisasi untuk mendapatkan pemahaman mendasar tentang fitur nanocarrier dan memfasilitasi desain rasional dari nanovector sensitif keasaman.
The pHLIP association is driven by the hydrophobic interaction of the conjugated DSPE C18-chains inserting in the hydrophobic region of the nanovector. The pHLIP peptide is anchored and lies in the external headgroup region, prone to interact with target membranes at acidic pH and/or to release the nanovector content after bilayer rearrangement in low pH environment.
According to these findings, proposed pHLIP decorated vesicles could be useful to obtain a prolonged (modified) release of biological active substances for targeting tumors and other acidic diseased tissues.
