Studi Persiapan dan Farmakokinetik Liposom Daidzein Beredar Panjang

Metode

Materi

Kedelai phosphatidyl choline (SPC) dibeli dari Lipoid GmbH (Jerman). Kolesterol dan DSPE-mPEG2000 dibeli dari AVT Pharmaceutical Co., Ltd. (Shanghai, China). Metanol dan asetonitril tingkat HPLC dibeli dari TEDIA Company (AS). Kloroform dan metanol (kelas analitik) diperoleh dari Sinopharm Chemistry Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Air dimurnikan dengan sistem pemurnian air Milli-Q® ((Millipore, USA). Daidzein (kemurnian ≥ 98%) dibeli dari Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Apigenin (standar internal, IS, 98% dalam kemurnian) dibeli dari Delge Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Nanjing, China). Phosphotungstic acid hydrate (grade analitik) dibeli dari Macklin Co., Ltd. (Shanghai, China). Tween-80 dan etil asetat diperoleh dari Sigma (Missouri, USA).Formic acid (MS-grade) dibeli dari Fischer (USA).

Hewan

Sepuluh tikus jantan Sprague-Dawley (200–210 g) dibeli dari pusat pencegahan dan pengendalian penyakit provinsi Hubei dengan nomor lisensi SCXK (E) 2017–0012. Eksperimen hewan telah disetujui oleh Komite Etika Universitas Hubei, dan mematuhi panduan untuk perawatan dan penggunaan hewan laboratorium.

Persiapan Daidzein Long-Circulating Nanoliposome (DLCL)

Mengambil ukuran partikel dan efisiensi enkapsulasi (EE) sebagai indeks evaluasi, desain ortogonal dari empat faktor dan tiga tingkat (Tabel 3) dilakukan untuk mengoptimalkan pencocokan terbaik rasio molar SPC terhadap kolesterol (A), rasio massa obat (daidzein) terhadap total lipid (SPC dan kolesterol) (b/b) (B), temperatur hidrasi (C), dan waktu ultrasonik (D) pada kondisi kandungan DSPE-mPEG2000 5% [21, 22] .

DLCL dibuat dengan metode evaporasi-sonikasi film tipis yang dijelaskan secara singkat sebagai berikut [21]:fosfatidilkolin kedelai, kolesterol, DSPE-mPEG2000, dan daidzein dilarutkan dalam labu alas bulat dengan 10 mL kloroform-metanol (1:4, v/ v) campuran. Di bawah kondisi vakum dan 40 C (water bath), campuran dikeringkan untuk membentuk film tipis dalam alat evaporasi putar (RE-2000A, Shanghai Yi-Rong Biochemical Instrument Factory, China), dan kemudian dihidrasi dengan 20 mL air ultra murni dengan sonikasi (80 w) selama 24 min dalam penangas es. Suspensi liposomal diekstrusi tiga kali dengan menyaring melalui membran mikropori 0,45 μm dan 0,22 μm secara bergantian. Larutan DLCL yang telah disiapkan disimpan pada suhu 4 °C. Pengawetan jangka panjang memerlukan penambahan sukrosa 3% (digunakan sebagai lyoprotectant) ke dalam suspensi DLCL dan pengawetan pengeringan beku pada 20 °C.

Penentuan Daidzein dalam DLCL oleh HPLC

Kolom tersebut adalah kolom analitik Phenomenex ODS (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) yang dihubungkan dengan kolom pelindung (30 mm × 10 mm, 3 μm) dengan suhu kolom 40 °C. Fase gerak terdiri dari 10 mM larutan amonium asetat berair (A) dan metanol (B) dengan elusi gradien sebagai berikut:0–3,0 min, 45% B hingga 80% B; 3.0–4.0 min, 80% B; 4.0–6.0 min, 80% B hingga 45% B. Laju aliran adalah 1 mL/menit. Panjang gelombang deteksi adalah 240 nm. Volume injeksi adalah 10 μL. Rentang linier daiazein adalah 0,313–50 μg/mL, dan persamaan regresinya adalah y = 35.461x + 1802.4, R ² = 0.9999. Waktu retensi daidzein adalah 4,30 min, dan tidak ada gangguan dari formulasi DLCL yang ditemukan pada penentuan daidzein (Gbr. 1). Presisi, reproduktifitas, stabilitas, dan pemulihan sampel dari metode analisis diselidiki secara ketat dan memenuhi persyaratan analisis kuantitatif (Tabel 1).

Kromatogram tipikal dari liposom kosong (a ), zat referensi daidzein (b ), dan sampel DLCL (c )

Penyaringan Resep dengan Uji Ortogonal

Mengambil ukuran partikel dan efisiensi enkapsulasi (EE) sebagai indeks evaluasi, desain ortogonal dari empat faktor dan tiga tingkat dilakukan untuk mengoptimalkan pencocokan terbaik dari rasio molar SPC terhadap kolesterol (A), rasio massa obat (daidzein) terhadap total lipid (SPC dan kolesterol) (b/b) (B), temperatur hidrasi (C), dan waktu ultrasonik (D) pada kondisi kandungan DSPE-mPEG2000 5% [21, 22].

Diameter dan Morfologi DLCL

Ukuran partikel dan potensi zeta dari larutan DLCL yang disiapkan diukur dengan penganalisis ukuran partikel laser (Zetasizer Nano90, Malven Instruments Limited, Worcestershire, UK) pada suhu kamar, 230 V dan 50 HZ. Larutan DLCL yang telah disiapkan diencerkan 10 kali dengan air murni kemudian diambil dari tepi kasa tembaga dengan pinset. Setelah pengeringan pada suhu kamar dan pewarnaan balik dengan larutan asam fosfotungstat (2%, b/v), morfologi DLCL yang benar-benar kering diamati menggunakan mikroskop elektron transmisi emisi medan (JEM-2100 (HR), JEOL Ltd. , Tokyo, Jepang) pada akselerasi 200 kV dan pemancar LaB6.

EE dan Pemuatan Obat DLCL

EE dan pemuatan obat dari DLCL yang disiapkan diuji dengan metode dialisis yang dinyatakan sebagai berikut:(1) 500 μL larutan DLCL yang disiapkan ditambahkan ke dalam kantong dialisis dengan potongan berat molekul 8000-14,000 (BioSharp Sai-Guo Biotechnology Co., LTD), lalu ikat kedua ujung kantong dialisis dengan erat, dan masukkan kantong dialisis ke dalam 20 mL air (media dialisis). Setelah digetarkan dengan shaker selama 12 h, 1 mL media dialisis diambil dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 min untuk menentukan konsentrasi obat bebas (C ₁ ) dalam supernatan. (2) Lima ratus mikroliter larutan DLCL yang disiapkan dan 2000 μL metanol dicampur dengan vortex selama 15 menit untuk menghancurkan liposom dan kemudian disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit untuk menentukan konsentrasi obat total (C ₀ ) dalam supernatan. (3) Sepuluh mililiter larutan DLCL yang disiapkan (V ₀ ) diliofilisasi untuk menimbang massa bubuk padat (W ₀ ). (4) EE dan pemuatan obat dihitung menurut rumus yang dinyatakan sebagai berikut:

Pelepasan Obat In Vitro

Pelepasan DLCL dan daidzein bebas secara in vitro ditentukan dengan metode dialisis. Cairan lambung yang disimulasikan adalah 0,1 mol/L HCl (pH 1,2) yang mengandung 0,5% Tween-80, dan cairan usus yang disimulasikan adalah 25 mM buffer PBS (pH 6,9) yang mengandung 0,5% Tween-80. 0,5 mL larutan DLCL yang disiapkan ditambahkan ke dalam kantong dialisis dengan intersepsi berat molekul 8000-14,000 dan ditempatkan dalam 20 mL dari dua media pelepasan, masing-masing. Media uji pelepasan diaduk (100 rpm) terus menerus pada suhu 37 °C. Pada titik waktu yang ditunjukkan (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120, dan 144 h), alikuot sampel (1 mL ) diambil dari dialisat dan kemudian ditambahkan media pelepasan segar dalam jumlah yang sama. Satu miligram per mililiter daidzein (dilarutkan dalam DMSO) digunakan sebagai kontrol dan ditempatkan masing-masing dalam dua media pelepasan di atas untuk perlakuan yang sama. Daidzein diukur pada setiap titik waktu, dan tingkat pelepasan kumulatif dihitung menurut rumus:

Dalam rumus, V ₁ adalah jumlah pengambilan sampel pada setiap titik waktu, V ₂ adalah volume media dialisis, C ₁ ~~C _i adalah konsentrasi daidzein yang diukur pada setiap titik waktu, dan V ₀ dan C ₀ adalah volume dan konsentrasi DLCL yang ditambahkan ke kantong dialisis.

Farmakokinetik DLCL pada Tikus

Sepuluh tikus jantan Sprague-Dawley secara acak dibagi menjadi dua kelompok (n = 5). Satu kelompok adalah kelompok daidzein (tersuspensi dalam 0,5% natrium karboksimetilselulosa), dan kelompok lainnya adalah kelompok DLCL (dilarutkan dalam air). Dosis daidzein pada kedua kelompok adalah 30 mg/kg. Sebelum pemberian oral, tikus dipuasakan selama 12 jam dan bebas minum air. Setelah tikus diberikan intragastrik, kelompok daidzein diambil 0,5 mL darah dari pleksus vena fundus masing-masing tikus pada 3 min, 5 min, 10 min, 15min, 30min, 45min, 60min, 1.5 h, 2 h , 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24h, dan 36h, berturut-turut. Sedangkan kelompok DLCL diambil 0,5 mL darah dari masing-masing tikus dengan cara yang sama pada 1 min, 3 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60min, 1.5 h, 2 h, 3 h , 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12h, 24 h, dan 36h, berturut-turut. Sampel darah ditempatkan dalam tabung centrifuge heparinized dan disentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 min, dan plasma diambil untuk disimpan pada -80 °C. Kandungan daidzein dalam sampel plasma ditentukan dengan metode LC-MS/MS yang ditetapkan untuk mendapatkan kurva waktu obatnya pada tikus yang diuji. Parameter farmakokinetik dihitung dengan model non-kompartemen dengan menggunakan perangkat lunak DAS3.0 (Anggota Profesional Masyarakat Farmakologi Cina, Shanghai, Cina).

Penentuan Daidazein dalam Plasma Tikus dengan LC-MS/MS

Sampel plasma tikus diperlakukan sebagai berikut:plasma tikus (50 μL), metanol (10 μL), apigenin standar internal (IS) yang dilarutkan dalam metanol (10 μL, 500 ng/mL), dan larutan asam format 5% (100 μL ) dicampur dalam tabung reaksi 1,5 mL yang bersih. Setelah pencampuran vorteks sebentar, 1,2 mL etil asetat ditambahkan ke dalam campuran. Setelah dikocok pada suhu kamar selama 5 menit, campuran disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit. Fase organik atas yang dihasilkan (1 mL) dipindahkan ke tabung reaksi 1,5-mL bersih lainnya, diuapkan dan dilarutkan kembali dalam fase gerak (100 μL). Supernatan yang diperoleh dengan sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 min dikumpulkan untuk analisis LC-MS/MS. Kondisi kuantitatif sampel plasma tikus dijelaskan di bawah ini:GL Inertsustain C18 (100 mm × 2.1 mm, 3 μm) dihubungkan ke kolom pelindung Pemegang Kolom Shim-pack (5.0 mm × 2.0 mm, 1.6 μm) pada suhu kolom 40 °C; elusi gradien dengan laju alir 0,2 mL/menit dilakukan menggunakan fase gerak yang terdiri dari air (A)-metanol (B) pada kondisi 50% B hingga 80% B (0–2.00 min), 80% B (2.00–4.00 min), 80% B hingga 50% B (4,00–6.00 min), dan 50% B (6.10–8.00 min). Volume injeksi adalah 10 μL. Mode pemantauan multi-reaksi ion negatif (MRM) digunakan untuk mendeteksi pasangan ion daidzein (m /z 253.0 → 224.15) dan IS (m /z 269.00 → 117.05). Kondisi lain dinyatakan sebagai berikut:sumber ion ESI, suhu blok pemanas 400 °C, suhu pemanasan tabung DL 250 °C, gas atomisasi (N ₂ ) aliran volume 3,0 L/mnt, gas pengering (N ₂ ) volume aliran 15.0 L/menit, dan tegangan semprotan ion 4.5 V. Waktu retensi daidzein dan standar internal (apigenin) masing-masing adalah 4,5 menit dan 5,4 menit, dan zat endogen dalam plasma tidak mengganggu penentuan daidzein dan standar internal (Gbr. 2). Metodologi kuantitatif diselidiki secara ketat dan memenuhi persyaratan analisis kuantitatif sampel biologis (Tabel 2).

HPLC plasma kosong (a ), daidzein + apigenin (standar internal) + plasma kosong (b ), dan sampel plasma (c ). 1, daidzein; 2, apigenin (IS)

Analisis Statistik

Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Perbandingan statistik dilakukan dengan menggunakan one-way analysis of variance (ANOVA), dilanjutkan dengan uji Tukey. Nilai dianggap signifikan secara statistik pada p <  0,05.

Hasil dan Diskusi

Pengaruh Proses Preparasi pada Karakteristik Nanoliposom

Desain uji ortogonal dan hasil pengujian ditunjukkan pada Tabel 3, dan hasil analisis varians ditunjukkan pada Tabel 4. Analisis intuitif (Tabel 3) menunjukkan bahwa urutan pengaruh empat faktor terhadap ukuran partikel adalah rasio obat-lipid > SPC- rasio kolesterol> suhu hidrasi > waktu ultrasonik, yang memiliki sedikit efek pada efisiensi enkapsulasi. Analisis varians (Tabel 4) menunjukkan rasio obat-lipid; Rasio SPC-kolesterol berpengaruh nyata terhadap ukuran partikel. Kondisi persiapan optimal untuk DLCL adalah A₁ B₁ C₂ D₁ , rasio SPC terhadap kolesterol adalah 55:40, rasio obat terhadap lipid adalah 1:10, suhu hidrasi adalah 50 °C, dan waktu ultrasonik adalah 24 min.

Tiga batch DLCL disiapkan secara paralel sesuai dengan proses yang dioptimalkan di atas. EE adalah 85,3 ± 3,6%, dan pemuatan obat adalah 8,2 ± 1,4%. Ukuran partikel rata-rata adalah 156.1 ± 3.0 nm dengan PDI 0.294 ± 0.012 dan potensi zeta 49 ± 0.6 mV. Distribusi ukuran partikel DLCL ditunjukkan pada Gambar 3, yang menunjukkan bahwa di bawah kondisi proses preparasi yang dioptimalkan, DLCL yang disiapkan memiliki distribusi ukuran partikel yang sempit dan seragam. Bentuk dan struktur partikel DLCL yang diamati oleh TEM adalah bulat atau elips, dan ukurannya pada dasarnya seragam (Gbr. 4).

Distribusi ukuran partikel DLCL

Foto TEM dari DLCL

Daidzein adalah obat khas dengan sifat hidrofilik dan lipofilik yang buruk. Kombinasi terarah obat ke ujung kutub fosfolipid dapat membuat keduanya dalam keadaan sangat terdispersi. Karakteristik kristal obat dihambat, dan kelarutan lipid meningkat [11]. Dilaporkan bahwa dalam interaksi antara daidzein dan lipid bilayer, sekitar 15% daidzein terletak di daerah hidrofilik membran liposom [23, 24] dan sisanya didistribusikan di antarmuka air/membran [25]. Menurut hasil TEM, struktur ganda DLCL terlihat jelas, dan penyisipan daidzein tidak mempengaruhi struktur ganda lipid.

Pengaruh Proses Persiapan Terhadap Pelepasan Obat In Vitro

Hasil percobaan pelepasan in vitro ditunjukkan pada Gambar. 5. Dalam media pelepasan cairan lambung yang disimulasikan (0,1 mol/L HCL yang mengandung 0,5% Tween-80), laju pelepasan kumulatif daidzein adalah sekitar 85% pada 1 h dan rilis lengkap pada 12 h; DLCL dirilis 18% pada 1 h, 60% pada 12 h, dan 100% pada 48 h. Dalam media pelepasan cairan usus yang disimulasikan (buffer 25 mM PBS yang mengandung 0,5% Tween-80, pH 6,9), laju pelepasan kumulatif daidzein adalah sekitar 73% pada 1 h, 84% pada 12 h, dan pelepasan lengkap pada 24 h; DLCL dirilis 3% pada 1 jam, 59% pada 12 jam, dan 100% pada 48 jam.

Pelepasan in vitro DLCL dan daidzein bebas pada larutan hidroklorida (pH 1.2) yang mengandung 0,5% Tween 80 (a ) dan buffer fosfat (pH 6,9) yang mengandung 0,5% Tween 80 (b ) (berarti ± SD, n = 3)

Hasil percobaan pelepasan secara in vitro menunjukkan bahwa DLCL lepas lambat secara signifikan pada media dialisis dengan pH 1.2 dan pH 6.9, serta laju pelepasan pada media dialisis dengan pH 1.2 lebih cepat dibandingkan pada media dialisis dengan pH 6.9. Ini mungkin karena fakta bahwa struktur lapisan ganda lipid rentan dalam kondisi asam dan memiliki stabilitas yang buruk.

Pengaruh Proses Persiapan Terhadap Farmakokinetik In Vivo

Kurva waktu konsentrasi plasma rata-rata daidzein setelah pemberian oral dosis tunggal daidzein dan DLCL ditunjukkan pada Gambar. 6, dan parameter farmakokinetik non-kompartemen utama daidzein pada kedua kelompok ditampilkan pada Tabel 5. Hasil menunjukkan bahwa di bawah iso-dose daidazein (30 mg/kg) pada kedua kelompok, konsentrasi plasma daidzein pada kelompok DLCL selalu lebih tinggi daripada pada kelompok daidzein. AUC_0−t (area di bawah kurva konsentrasi obat plasma-waktu, yang mewakili total penyerapan setelah dosis tunggal dan mencerminkan tingkat penyerapan obat) daidzein dalam kelompok DLCL adalah 1515,52 ± 532,40 μg/L*h, yang 2,5 kali lipat dari kelompok daidzein (p <  0,05). Selain itu, MRT_0−t (rata-rata waktu tinggal, yaitu waktu yang diperlukan untuk eliminasi 63,2% obat di dalam tubuh) dan t _1/2 (waktu paruh eliminasi, yang merupakan waktu yang diperlukan untuk membagi dua konsentrasi obat plasma fase terminal) daidzein dalam kelompok DLCL diperpanjang masing-masing 1,6 kali dan 1,8 kali dibandingkan kelompok daidzein (p <  0,05). Hasil farmakokinetik menunjukkan bahwa DLCL tidak hanya dapat mengurangi efek first-pass daidzein untuk meningkatkan penyerapan oralnya, tetapi juga memperpanjang waktu tinggal rata-rata untuk mencapai efek pelepasan lambat.

Kurva waktu konsentrasi plasma rata-rata DLCL dan daidzein bebas setelah pemberian oral dosis tunggal daidzein (30 mg/kg) (rata-rata ± SD, n = 5)

Kesimpulan

Telah dilaporkan bahwa pembawa nano-lipid, termasuk self-emulsifying drug delivery system (SEDDS), solid lipid nanoparticles (SLN), dan nano-structured lipid carriers (NLC), dapat secara efektif meningkatkan kelarutan, permeabilitas, stabilitas gastrointestinal, dan bioavailabilitas oral obat. SEDDS terdiri dari minyak isotropik anhidrat, pengemulsi, pengemulsi tambahan, pelarut, dan obat. Melalui emulsifikasi lipid di saluran pencernaan, dapat meningkatkan penyerapan luas permukaan dan permeabilitas obat dan mempromosikan obat untuk memasuki sirkulasi sistemik. Namun, SEDDS memiliki beban obat yang rendah dan rentan terhadap kristalisasi obat dan presipitasi in vivo, dan korelasi antara hasil in vitro dan in vivo buruk [26, 27]. SLN terdiri dari obat, lipid, dan surfaktan. Dengan karakteristik struktur partikel yang unik dan keunggulan pelepasan yang dapat dikontrol, SLN dapat secara signifikan meningkatkan penargetan dan mempromosikan penyerapan sel kanker saat digunakan untuk merangkum obat antikanker. Namun, SLN tidak cocok untuk enkapsulasi obat hidrofilik dan obat dengan muatan kationik [28]. NLC adalah generasi kedua dari nanopartikel lipid yang dibentuk oleh campuran lipid cair dan padat, dengan stabilitas lebih tinggi dari SLN. Ini dapat secara efektif merangkum molekul hidrofobik dan memperpanjang waktu tinggal obat dalam tubuh, tetapi biaya persiapannya tinggi [29].

Untuk meningkatkan bioavailabilitas oral daidzein yang buruk, penelitian terbaru difokuskan pada sistem penghantaran obat baru, seperti kompleks daidzein-fosfolipid yang memuat nanocarrier lipid dengan 91,7 ± 1,5% EE dan 6,87 kali lipat peningkatan AUC [11], daidzein -sistem pengiriman nano rakitan sendiri dengan 85,9 ± 2,7% EE sembilan kali lipat dari peningkatan AUC [12], dan nanopartikel daidzein-PLGA dengan 81,9% EE dan 5,57 kali lipat peningkatan AUC [13].

Dalam penelitian ini, EE dan pemuatan obat dari DLCL yang disiapkan dalam kondisi yang dioptimalkan masing-masing adalah 85,3 ± 3,6% dan 8,2 ± 1,4%. Waktu pelepasan lengkap DLCL secara in vitro dalam media pH 1.2 dan pH 6.9 masing-masing meningkat empat dan dua kali lipat dari obat bebas. Setelah tikus diberikan secara oral dengan dosis tunggal daidzein (30 mg/kg) dan DLCL (mengandung dosis yang sama dari daidzein), t _1/2 , MRT_0−t , dan AUC_0–t daidzein pada kelompok DLCL meningkat sebesar 1,8-, 1,6-, dan 2,5 kali lipat dibandingkan dengan kelompok daidzein, yang menunjukkan bahwa DLCL meningkatkan penyerapan oral dan memperpanjang waktu tinggal rata-rata daidzein pada tikus.

Ketersediaan Data dan Materi

Penulis menyatakan bahwa materi, data, dan protokol terkait segera tersedia bagi pembaca tanpa kualifikasi yang tidak semestinya dalam perjanjian transfer materi. Semua data yang dihasilkan dan dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel ini.

Singkatan

AUC:

Area di bawah kurva konsentrasi waktu;

C _maks :

Konsentrasi puncak

Tabung DL:

Tabung pelarut

DLCL:

Liposom bersirkulasi panjang daidzein

DSPE-mPEG2000:

Distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000

EE:

Efisiensi enkapsulasi

ESI:

Ionisasi semprotan listrik

HPLC:

Kromatografi cair kinerja tinggi

ADALAH:

Standar internal

LC-MS/MS:

Kromatografi cair-spektrometri massa tandem

m /z :

Rasio massa terhadap muatan

MPS:

Sistem fagosit mononuklear

MRM:

Mode pemantauan multi-reaksi

MRT:

Rata-rata waktu tinggal

MS:

Spektrogtafi massa

PBS:

Garam buffer fosfat

PDI:

Indeks polidispersitas

PEG:

Poli etilen glikol

RSD:

Derivasi standar relatif;

SD:

Simpangan baku

SEM:

Kesalahan standar rata-rata

SPC:

Fosfatidilkolin

t _1/2 :

Waktu paruh eliminasi

TEM:

Mikroskop elektron transmisi

T _maks :

Waktu konsentrasi puncak

Transisi Celah Pita Tidak Langsung-Langsung-Tidak Langsung Terkendali Medan Listrik di Monolayer InSe Grafena Oksida dalam Komposit dengan Nanopartikel Perak Mengurangi Sitotoksisitas Fibroblas dan Sel Endotel dari Nanoplatform Antibakteri