Upregulating MicroRNA-410 atau Downregulating Wnt-11 Meningkatkan Osteoblas dan Mengurangi Osteoklas untuk Mengurangi Osteonekrosis Kepala Femoral
Abstrak
Latar Belakang
Sedikit yang diketahui mengenai peran fungsional microRNA-410 (miR-410) dalam osteonekrosis kepala femoralis (ONFH); karenanya, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki miR-410 yang menargetkan Wnt-11 untuk memodulasi mekanisme osteogenik dan osteoklastik dalam pencegahan ONFH.
Metode
Lima belas sampel ONFH dan 15 sampel normal dikumpulkan. Perubahan patologis kepala femoralis, osteoblas, dan osteoklas dalam sampel klinis diamati. Model tikus ONFH disuntik dengan agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, atau oe-Wnt-11. MiR-410; mau-11; faktor terkait osteoblas alkaline phosphatase (ALP), protein gamma-carboxyglutamate tulang (BGLAP), dan ekspresi Collα1; dan faktor terkait osteoklas acid phosphatase 5 (ACP5), cathepsin K (CTSK), dan MMP9, serta ekspresi Bcl-2 dan Bax, diuji dengan RT-qPCR dan analisis western blot. Indeks fungsi osteogenik ALP dan OCN bersama dengan indeks fungsi osteoklas NTX-1 dan CTX-1 dalam serum diuji dengan ELISA.
Hasil
MiR-410, ALP, BGLAP, dan Collα1 terdegradasi serta Wnt-11, ACP5, CTSK, dan MMP9 ditingkatkan dalam jaringan ONFH dari sampel klinis. MiR-410 yang diregulasi dan Wnt-11 yang diregulasi meningkatkan kepadatan mineral tulang (BMD) dan BV/TV tikus, meningkatkan level BMD batang femur, kepala femoral, dan tulang belakang, dan juga meningkatkan level kalsium dan fosfor serum tikus , sementara menahan apoptosis osteosit, peningkatan ekspresi OCN, ALP, BGLAP, dan Collα1 dan penurunan ekspresi ACP5, CTSK, NTX-1, CTX-1, dan MMP9 pada tikus.
Kesimpulan
Studi ini menyarankan bahwa upregulating miR-410 atau downregulating Wnt-11 meningkatkan osteoblas dan mengurangi osteoklas untuk mengurangi terjadinya ONFH. Dengan demikian, miR-410 dapat berfungsi sebagai target potensial untuk pengobatan ONFH.
Pengantar
Osteonekrosis kepala femoralis (ONFH), sebagai salah satu penyakit paling umum yang mempengaruhi sendi panggul, menyebabkan nyeri parah atau kecacatan sendi dan terutama terjadi pada individu paruh baya [1]. Terapi ONFH dewasa yang memiliki 8,12 juta pasien di China masih menjadi tantangan bagi ahli bedah [2]. Banyak faktor risiko yang berhubungan dengan terjadinya ONFH, seperti hiperlipidemia, penyakit autoimun, gangguan pembekuan darah, alkoholisme, dan hiperkortisonisme [3]. Perawatan bedah berisi dekompresi inti dengan atau tanpa adjuvant, misalnya, sumsum tulang autologus, sementara penggantian pinggul total (THR) dipertahankan untuk pasien pikun atau osteonekrosis lanjut yang tidak diobati dengan retensi sendi [4]. Namun, ONFH memiliki prognosis yang tidak memuaskan pada pasien yang sering membutuhkan THR [5]. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk mengeksplorasi target terapi yang akurat untuk pengobatan ONFH.
MicroRNAs (miRNAs) adalah pengatur utama fungsi sel dan ekspresi gen, yang memberikan fungsi yang sangat besar pada homeostasis endotel dan mungkin merupakan pengobatan baru [6]. Sebuah penelitian telah melaporkan bahwa miR-410 telah ditemukan diekspresikan secara abnormal pada beberapa jenis kanker pernisiosa manusia dan dapat digunakan sebagai penghambat tumor pada kanker endometrium, paru-paru, mieloma, dan kanker payudara [7,8,9,10]. Studi lain mengungkapkan bahwa ada efek neuroprotektif miR-410 pada model sel penyakit Parkinson yang diinduksi oleh 6-hidroksidopamin dengan menekan jalur pensinyalan PTEN/AKT/mTOR [11]. Selain itu, miR-410 telah diturunkan untuk memodulasi perilaku biologis ganas anak-anak dengan leukemia limfoblastik akut melalui penargetan jalur pensinyalan FKBP5 dan AKT [12]. Sebuah artikel juga telah menunjukkan efek penghambatan miR-410 yang menargetkan angiotensin II tipe 1 pada kanker pankreas [13]. Protein Wnt adalah sejenis lipoglikoprotein yang disekresikan kaya sistein, yang memberikan fungsi yang sangat besar pada perkembangan dan penyakit [14]. Wnt-11 termasuk dalam jalur pensinyalan Wnt dan merupakan regulator positif yang berperan penting dalam karsinogenesis [15]. Ada sebuah penelitian yang melaporkan signifikansi klinis dari ekspresi antigen karsinoma sel skuamosa dan Wnt11 pada karsinoma serviks [16]. Selain itu, ditunjukkan bahwa sinyal sinergis TGF-β1 dan Wnt11 mendorong ekspresi sm-α-aktin di otot polos oleh pensinyalan Rho kinase-aktin-MRTF-A [17]. Berdasarkan literatur di atas, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki peran miR-410 yang mengatur Wnt-11 pada pencegahan ONFH, dan hipotesis diajukan bahwa miR-410 yang menargetkan Wnt-11 dapat memodulasi osteogenik dan osteoklastik. mekanisme pencegahan ONFH.
Bahan dan Metode
Pernyataan Etika
Penelitian ini dilakukan di bawah persetujuan dari Institutional Review Board Rumah Sakit Shijitan Beijing, Capital Medical University, dan mengikuti prinsip Deklarasi Helsinki. Peserta memberikan persetujuan tertulis untuk berpartisipasi dalam penelitian ini. Semua percobaan hewan konsisten dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari National Institutes of Health. Protokol tersebut diizinkan oleh Komite Etika Eksperimen Hewan dari Rumah Sakit Shijitan Beijing, Universitas Kedokteran Modal.
Mata Pelajaran
Sebanyak 30 pasien yang dirawat di departemen ortopedi Rumah Sakit Shijitan Beijing, Universitas Kedokteran Capital, dari Januari 2017 hingga September 2018 dipilih. Di antara pasien ini, 15 pasien dengan ONFH dirawat di operasi THR, usia rata-rata pasien adalah 50,6 ± 4,3 tahun, dan massa tubuh adalah 57,0 ± 5,6 kg dengan 7 laki-laki dan 8 perempuan (kelompok ONFH). 15 pasien lain dengan fraktur leher femur dirawat dengan operasi THR, usia rata-rata adalah 59,6 ± 3,3 tahun, dan massa tubuh adalah 50,0 ± 5,6 kg dengan 9 laki-laki dan 6 perempuan (kelompok kontrol). Tidak ada perbedaan mencolok dalam jenis kelamin, usia, dan berat badan antara kedua kelompok (P> 0,05) yang sebanding. Jaringan pada daerah nekrotik subkondral diambil dengan cara dipahat sepanjang garis longitudinal kepala femur dan disimpan pada suhu 80 °C. Setiap kelompok diperiksa oleh patologi dan biologi molekuler, masing-masing.
Pewarnaan Hematoxylin-Eosin (HE)
Sampel diikat dengan paraformaldehid 4% dan didekalsifikasi dengan asam etilen diamin tetraasetat 10%, dan larutan dekalsifikasi diganti seminggu sekali. Warna sampel tulang diamati dan derajat dekalsifikasi diukur. Setelah dekalsifikasi lengkap, sampel dimasukkan ke dalam parafin dan diiris dengan ketebalan 4 μm. Bagian yang telah dipanggang direndam ke dalam xilena I dan xilena II secara bergantian selama 10 menit, dan bagian yang di-dewax masing-masing direndam dalam alkohol absolut I, alkohol absolut II, alkohol 95%, alkohol 80%, dan alkohol 70% selama 2 menit. Kemudian bagian dicelup dengan hematoxylin selama 3 menit dan dibedakan dengan alkohol asam klorida 1% selama 2 menit. Selanjutnya, potongan direndam dalam alkohol 50%, 70%, dan 80% selama 2 menit secara bergantian dan direndam dalam eosin selama 5 detik. Selanjutnya, potongan direndam dalam alkohol 95%, alkohol absolut I, dan alkohol absolut II selama 3 menit kemudian direndam dalam xilena I dan xilena II secara bergantian selama 5 menit. Akhirnya, bagian-bagian itu ditutup dengan getah netral dan diperiksa dengan mikroskop.
Pewarnaan Alkaline Phosphatase (ALP)
Satu bagian dipilih dalam setiap sampel dan dipanggang pada suhu 60 °C selama 60 min. Bagian parafin didewax dengan xilena I dan xilena II masing-masing selama 15 menit, dan dicelupkan ke dalam alkohol absolut I, alkohol absolut II, etanol 95%, etanol 90%, etanol 80%, dan etanol 75% secara bergantian selama 5 menit, dan dibersihkan dengan air suling tiga menit selama tiga kali. Bagian-bagian itu dijatuhkan dengan beberapa cairan substrat yang disiapkan dalam kit pencelupan ALP (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), membuat cairan substrat sepenuhnya menutupi sampel, kemudian menetas pada 37 °C menghindari cahaya selama 15 menit. Larutan pewarna yang berlebihan dibuang, dan bagian-bagian tersebut segera ditetesi dengan agen kromogenik A selama 5 menit dan dibersihkan dengan air suling tiga selama 30 detik. Kemudian bagian dicelup dengan agen kromogenik B selama 30 detik dan diwarnai dengan reagen selama 30 detik. Foto diperoleh di bawah mikroskop optik 200 ×, dan jumlah osteoblas dihitung melalui sistem analisis citra untuk mikroskop (Image-Proplus 6.0).
Pewarnaan Tartrat Tahan Asam Fosfatase (TRAP)
Satu bagian dipilih untuk setiap sampel dan dipanggang pada 60 °C selama 60 min. Bagian parafin di-dewax dengan xilena I dan xilena II selama 15 menit, dan dicelupkan ke dalam alkohol absolut I, alkohol absolut II, etanol 95%, etanol 90%, etanol 80%, dan etanol 75% secara bergantian selama 5 menit. Bagian difiksasi dengan beberapa larutan fiksatif yang disiapkan selama 30 detik. Bagian-bagian tersebut dimasukkan ke dalam rak pencelupan dan ditempatkan dalam kotak gelap yang berisi larutan pewarnaan TRAP yang baru disiapkan (Sigma, St. Louis, MO, USA), larutan pewarnaan harus benar-benar tertutup dengan bagian-bagian tersebut, dan kemudian bagian-bagian tersebut ditetaskan dalam Panci mandi air 37 °C selama 1 jam. Selanjutnya, bagian-bagian tersebut diwarnai dengan hematoxylin selama 2 menit dan dikeringkan. Karena pewarnaan TRAP akan membusuk seiring waktu, bagian tersebut akan langsung diperiksa oleh mikroskop tanpa penyegelan. Gambar diperoleh di bawah mikroskop optik 200 ×, dan jumlah osteoklas dihitung dengan sistem analisis gambar untuk mikroskop (Image-Proplus 6.0).
Pewarnaan imunohistokimia
Setelah dekalsifikasi, bagian-bagian tersebut dibenamkan dalam lilin parafin dan diiris dengan ketebalan 4 μm. Bagian-bagian tersebut dikeringkan dengan xilena konvensional, didehidrasi dengan alkohol gradien, ditetaskan dengan 3% H2 O2 (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, USA) pada 7 °C selama 30 menit, lalu direbus dengan buffer asam sitrat 0,01 M pada 95 °C selama 20 menit. Bagian diblokir dengan cairan kerja serum domba normal selama 10 menit, dicampur dengan antibodi primer Wnt-11 (1:100, Invitrogen, Carlsbad, California, USA) pada suhu 4 °C semalaman, antibodi sekunder (antibodi sekunder siap pakai kit (PV-6000), ZSGB-Bio, Beijing, China) selama 20 menit, dan cairan kerja streptomyces ovalbumin berlabel peroksidase lobak (SA/HRP, Beijing ComWin Biotech Co. Ltd, Beijing, China) selama 2 menit. Bagian tersebut dikembangkan oleh diaminobenzidine (DAB) (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, USA), diwarnai dengan hematoxylin (Shanghai Bogoo Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China), dan kemudian disegel. Phosphate-buffered saline (PBS) menggantikan antibodi primer sebagai kontrol negatif (NC). Di bawah mikroskop cahaya, sel-sel positif ditemukan dengan reaktan coklat di sitoplasma, ekspresi positif kuat berwarna kuning kecoklatan, ekspresi positif lemah berwarna kuning kecoklatan, dan ekspresi negatif tidak berwarna. Pewarnaan sel diamati di bawah mikroskop cahaya, lima bidang daya tinggi (400 ×) diamati untuk setiap bagian, dan 100 sel dihitung dalam per bidang. Nilai rata-rata merupakan hasil observasi setiap seksi. Sesuai dengan proporsi dan distribusi sel positif ditentukan sebagai berikut:negatif (−), pewarnaan sel tunggal, sel positif kurang dari 5%; positif lemah (+), pewarnaan massa sel tersebar atau kecil, jumlah sel positif adalah 5-24%; positif (++), pewarnaan sel serpih atau cluster, jumlah sel positif adalah 25-50%; dan sangat positif (+++), pewarnaan sel menyebar, jumlah sel positif lebih dari 50%. Hasil imunohistokimia dievaluasi dengan skor double-blind oleh dua orang secara independen.
Total RNA diabstraksi dari sampel jaringan dengan kit ekstraksi Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Konsentrasi dan kemurnian RNA ditentukan. Primer dirancang dan diperparah oleh Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Jepang) (File tambahan 1:Tabel S1). Kemudian RNA ditranskripsi balik menjadi cDNA menggunakan kit PrimeScript RT (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). Larutan reaksi digunakan untuk PCR kuantitatif fluoresensi, dengan mengacu pada instruksi SYBR® Premix Ex Taq
TM
Kit II (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). PCR kuantitatif fluoresensi diimplementasikan dalam sistem ABI PRISM® 7300 (Applied Biosystems, Massachusetts, USA). U6 adalah kontrol pemuatan miR-410, dan gliseraldehida fosfat dehidrogenase (GAPDH) adalah parameter internal Wnt-11, ALP, protein gamma-karboksiglutamat tulang (BGLAP), Collα1, asam fosfatase 5 tahan tartrat (ACP5), cathepsin K (CTSK), matriks metalopeptidase (MMP)9, Bcl-2, dan Bax. Tingkat transkripsi relatif dari gen target dihitung oleh 2
−△△Ct
metode [18].
Analisis Western Blot
Protein total disarikan dari jaringan kepala femoralis. Konsentrasi protein setiap sampel diukur dan pemuatan sampel disesuaikan dengan air deionisasi untuk memastikan ukurannya konsisten. Gel pemisahan natrium dodesil sulfat dan gel spacer (10%) disiapkan. Setelah penangas es dan sentrifugasi, sampel dipisahkan dengan elektroforesis dengan jumlah mikrosampler yang sama, kemudian protein pada gel dipindahkan ke membran nitroselulosa. Membran nitroselulosa disegel dengan 5% susu bubuk skim pada 4 °C semalaman dan dicampur dengan antibodi primer Wnt-11 (1:150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), ALP (1:100, Sigma, St Louis, MO, USA), BGLAP, Collα1 dan MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA), dan Bcl-2 dan Bax (1:500, Proteintech, Chicago, USA) dan menetas dalam semalam. Dan sampel ditetesi dengan antibodi sekunder IgG (1:1000, Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd., Hubei, China) yang diberi label oleh HRP dan diinkubasi selama 1 jam. Membran direndam dalam larutan reaksi chemiluminescence yang disempurnakan (Pierce, Rockford, IL, USA) selama 1 menit. Setelah mengeluarkan cairan, sampel ditutup dengan film pengawet makanan. Setelah dikembangkan dan diperbaiki, hasilnya diamati. GAPDH adalah parameter internal, dan citra jejak protein dianalisis oleh perangkat lunak ImageJ2x.
Pembentukan Model Tikus ONFH
Sembilan puluh tikus jantan Sprague-Dawley (SD) (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, China), dengan berat antara 300 g dan 350 g, dipilih. Lingkungan diatur pada 18–25 °C dan kelembabannya 45–70%. Tikus dibesarkan di kandang terpisah menghindari kebisingan. Setelah 1 minggu pemberian pakan adaptif, eksperimen lanjutan dilakukan.
Model ini didirikan oleh ONFH traumatis. Metode pemodelan adalah sebagai berikut:tikus SD dibius dengan rongga perut, diikuti dengan hair removal dan persiapan kulit. Kulit tikus dipotong, jaringan dipisahkan, dan ligamen bundar dipotong setelah kepala femoralis terpapar. Periosteum dari leher femoralis tikus dikerok, dan suplai darah di sekitar kepala femoralis dihancurkan. Kapsul sendi, otot, dan kulit dijahit lapis demi lapis dan disterilkan kembali.
Pengelompokan Hewan
Tujuh puluh tikus model SD yang berhasil didistribusikan ke dalam tujuh kelompok, dengan 10 tikus di setiap kelompok:kelompok ONFH; agomir-NC group (0,5 mL miR-410 agonis NC (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) disuntikkan di sekitar sendi pinggul 1 minggu setelah keberhasilan pembentukan ONFH), agomir-miR-410 group (0,5 mL agonis miR-410 (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, Cina) disuntikkan di sekitar sendi pinggul 1 minggu setelah keberhasilan pembentukan ONFH), kelompok siRNA-NC (NC dari 0,4 mL Wnt yang dibungkam -11 vektor (berisi 1 × 10
9
unit pembentuk plak (PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Cina) disuntikkan di sekitar sendi panggul 1 minggu setelah keberhasilan pembentukan ONFH), kelompok Wnt-11-siRNA (0,4 mL vektor Wnt-11 yang dibungkam (mengandung 1 × 10
9
PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) disuntikkan di sekitar sendi panggul 1 minggu setelah keberhasilan pembentukan ONFH), grup agomir-miR-410 + overexpressed (OE)-NC (0,5 mL agonis miR-410) dan NC dari 0,4 mL vektor Wnt-11 yang diregulasi (mengandung 1 × 10
9
PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) disuntikkan di sekitar sendi panggul 1 minggu setelah keberhasilan pembentukan ONFH), dan grup agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (0,5 mL agonis miR-410). dan 0,4 mL vektor Wnt-11 yang diregulasi (mengandung 1 × 10
9
PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) disuntikkan di sekitar sendi pinggul 1 minggu setelah keberhasilan pembentukan ONFH). Sedangkan kelompok normal (hanya saline yang disuntikkan ke rongga perut, 10 ekor tikus) ditetapkan sebagai kontrol. Setelah 4 minggu ONFH, mikro-CT, analisis osteonometrik, pengamatan sinar-X, densitometri tulang, dan penentuan kadar kalsium dan fosfor serum dilakukan.
Uji Mikro-CT dan Analisis Osteonometrik
Kepala femoralis kanan tikus ditempatkan pada mesin mikro-CT (General Electric (GE) Company, Massachusetts, USA), dan phantom standar yang dilengkapi secara acak juga dipindai. Parameter pemindaian adalah sebagai berikut:resolusi 27 μm × 27 μm × 27 μm, arus pemindaian 450 mA, tegangan pemindaian 80 kV, dan waktu pemindaian tunggal 88 min. Struktur mikro kepala femoralis tikus diamati secara rinci. Setelah kalibrasi berdasarkan spesifikasi, tiga daerah berbentuk kubus yang diminati (ROI) dipilih secara acak dari kelompok tikus yang berbeda untuk rekonstruksi (0,5 × 0,5 × 0,5 cm
3
). Pemrosesan gambar dilakukan dengan perangkat lunak mesin GE Microview, dan ROI direkonstruksi dan dianalisis dengan metrologi tulang. Parameter kepadatan mineral tulang (BMD) dan fraksi volume tulang (BV/TV) dipilih.
Pengamatan X-ray, Penentuan BMD, dan Penentuan Kadar Kalsium dan Fosfor Serum
Empat minggu setelah operasi, tikus di masing-masing kelompok disuntik melalui perut dengan 10% chloral hydrate. Setelah anestesi, tikus ditempatkan dalam posisi terlentang, dan anggota badan difiksasi kemudian diperiksa dengan fotografi sinar-X. Perubahan bentuk dan densitas caput femur diamati. Kepadatan tulang tulang belakang femoralis kiri, kepala femoralis, dan tulang belakang diuji dengan alat pengukur kepadatan tulang sinar-X energi ganda. Pada 4 minggu setelah operasi, tikus di masing-masing kelompok dipuasakan selama 12 jam sebelum pengambilan darah. Sampel darah (5 mL) dikumpulkan melalui jantung di pagi hari dan ditempatkan ke dalam tabung koagulasi yang bersih. Serum dipisahkan dengan sentrifugasi 3000 r/min selama 15min. Kadar kalsium dan fosfor serum diukur dengan penganalisis biokimia otomatis.
Pengamatan Mikroskopik Elektron
Massa jaringan tulang tikus diikat dengan glutaraldehid 3,5%, didekalsifikasi dengan larutan asam klorida 5% dan asam osmik 1%, kemudian didehidrasi dengan aseton gradien, dicelup ganda dengan uranium asetat dan asam sitrat, dan terakhir ditempel dengan Epon-61. Setelah bagian semi-tipis disiapkan, bagian ultra-tipis diamati dengan mikroskop elektron transmisi.
TdT-Mediated dUTP-Biotin Nick End-Labeling (TUNEL) Assay
Bagian yang tertanam parafin telah diperlakukan sebelumnya dengan dewaxing konvensional dan dehidrasi. Potongan ditetaskan dengan pepsin (larutan asam klorida 0,25~0,5%) selama 25 menit, kemudian ditetesi dengan larutan campuran reaksi TUNEL 50 L dan ditetaskan dalam kotak basah selama 60 menit, dan ditetesi dengan agen peroksidase 50 L dan ditetaskan dalam kotak basah selama 30 min. Bagian-bagian tersebut dikembangkan dengan reagen DAB, apakah bagian-bagian tersebut diwarnai dan diamati di bawah mikroskop. Bagian ditambahkan dengan air untuk berhenti berkembang dan diwarnai dengan hematoxylin selama 2 menit. Kemudian bagian dicelupkan ke dalam etanol 95% I-II, etanol absolut I-II selama 3-5 menit, masing-masing xilena I-II selama 3-5 menit dan disegel dengan gom netral. Hasilnya dianalisis di bawah mikroskop cahaya.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Setelah tikus dibius, darah arteri paha diambil dan sampel serum dikumpulkan dengan sentrifugasi setelah 1 jam istirahat. Berdasarkan spesifikasi kit ELISA (Shanghai enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), tujuh sumur standar ditambahkan dengan berbagai standar konsentrasi (100 μL) secara bergantian, sumur kosong ditambahkan 100 μL larutan pengenceran standar, dan sumur yang tersisa ditambahkan dengan 100 μL sampel yang akan diuji. Plat enzim dilapisi dengan film dan ditempatkan selama 1 jam, dan kemudian cairannya dibuang. Sebuah solusi (100 μL) ditambahkan ke semua sumur, dan pelat enzim ditutup dengan film selama 1 h. Setelah dicuci, larutan 100 μL B ditambahkan ke semua sumur, dan plat enzim ditutup dengan film selama 30 min. Kemudian larutan substrat tetrametilbenzidin (90 μL) ditambahkan, pelat enzim ditutup dengan film selama 10-20 min dan larutan pengakhiran 50 μL ditambahkan ke semua sumur. Nilai densitas optik (OD) dari setiap sumur diukur dengan pembaca lempeng mikro, dan konsentrasi sampel yang sebenarnya dihitung.
Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda
Situs pengikatan dan hubungan target miR-410 dan Wnt-11 3′ untranslated region (UTR) diperkirakan menggunakan perangkat lunak bioinformatika http://www.targetscan.org. Urutan region promotor Wnt-11 3′UTR yang berisi situs pengikatan miR-410 disusun dan dimasukkan ke dalam pMIR-REPORT
TM
Plasmid vektor Luciferase (Ambion, Company, Austin, TX, USA) untuk memformulasi plasmid tipe liar Wnt-11 3′UTR (Wnt-11-WT). Dan plasmid mutan Wnt-11 3′UTR (Wnt-11-MUT) dibangun berdasarkan plasmid dan situs pengikatan mutasi. Ikuti langkah-langkah kit ekstraksi plasmid yang dibeli (Promega, Madison, Wisconsin, USA), dan sel-sel logaritmik diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur. Ketika pertemuan sel sekitar 70%, Lipofectamine 2000 diadopsi untuk transfeksi. Wnt-11-WT dan Wnt-11-MUT dicampur dengan mimik NC dan miR-410 mimik (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China), masing-masing, dan kemudian ditransfusikan bersama ke sel 293 T. Sel-sel dikumpulkan dan dilisiskan setelah ditransfeksi 48 h, dan aktivitas luciferase diuji dengan kit deteksi luciferase (BioVision, San Francisco, CA, USA) dan luminometer Glomax 20/20 (Promega, Madison, Wisconsin, USA).
Analisis Statistik
Semua data diproses oleh perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Data pengukuran disampaikan dengan mean ± standar deviasi. Analisis varians satu arah (ANOVA) dilakukan untuk perbandingan beberapa kelompok dan t uji untuk perbandingan dua kelompok dan perbedaan signifikan terkecil Fisher t uji (LSD-t) digunakan setelah ANOVA. P nilai <0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik.
Hasil
Perubahan Patologis pada Jaringan ONFH Sampel Klinis
Pewarnaan HE diadopsi untuk mengamati perubahan patologis kepala femur pada kelompok fraktur leher femur (kelompok kontrol) dan kelompok ONFH; hasilnya melaporkan bahwa pada kelompok kontrol, kepadatan trabekular tulang terdistribusi dengan baik, dan strukturnya utuh. Sedangkan pada kelompok ONFH, terdapat banyak kekosongan tulang pada serebelum tulang, dengan sel-sel tulang menurun, dan trabekula tulang terus berubah. Selain itu, ada banyak hiperplasia jaringan lain di sekitar tulang serebelum (Gbr. 1a).
Perubahan patologis pada jaringan ONFH sampel klinis. a Hasil pewarnaan HE pada masing-masing kelompok (200x). b Hasil pewarnaan TRAP dan jumlah sel TRAP-positif pada masing-masing kelompok (200 ×). c Hasil pewarnaan ALP dan jumlah sel positif ALP pada masing-masing kelompok (400x). *P <0,05 vs. kelompok kontrol
Pewarnaan TRAP mengungkapkan bahwa TRAP terutama ditemukan dalam osteoklas dan sering digunakan untuk mengidentifikasi osteoklas dewasa dalam bayam. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, jumlah osteoklas positif TRAP dalam kelompok ONFH meningkat, morfologi osteoklas beragam, dan sel-selnya besar dengan tampilan multinuklear. Cacat tulang yang jelas terlihat di serebelum tulang yang berdekatan dengan osteoklas, yang menunjukkan resorpsi tulang (Gbr. 1b).
Hasil pewarnaan ALP menunjukkan bahwa ALP merupakan enzim penanda untuk diferensiasi dan maturasi osteoblas, yang berperan dalam regulasi kalsifikasi maturasi matriks tulang. Oleh karena itu, ekspresi ALP umumnya digunakan untuk mengidentifikasi osteoblas. Partikel coklat atau kopi dapat dilihat di sitoplasma osteoblas dewasa. Sehubungan dengan kelompok kontrol, jumlah osteoblas positif ALP berkurang pada kelompok ONFH (Gbr. 1c).
MiR-410, ALP, BGLAP, dan Collα1 Terdegradasi dan Wnt-11, ACP5, CTSK, dan MMP9 Ditingkatkan dalam Jaringan ONFH Sampel Klinis
Analisis Western blot dan RT-qPCR menunjukkan bahwa ekspresi miR-410 pada kelompok ONFH berkurang relatif terhadap kelompok kontrol, sementara ekspresi Wnt-11 meningkat; ekspresi faktor terkait osteoblas ALP, BGLAP, dan Collα1 terdegradasi; dan faktor terkait osteoklas ekspresi ACP5, CTSK, dan MMP9 naik (semua P <0,05) (Gbr. 2a–c).
MiR-410, ALP, BGLAP, dan Collα1 menurun dan Wnt-11, ACP5, CTSK, dan MMP9 meningkat pada jaringan ONFH sampel klinis. a Deteksi miR-410, Wnt-11, dan gen terkait osteoblas dan osteoklas oleh RT-qPCR. b Wnt-11 dan protein terkait osteoblas dan osteoklas terdeteksi oleh analisis western blot. c Pita protein Wnt-11 dan protein terkait osteoblas dan osteoklas. d Ekspresi Wnt11 (400 ×) dan perbandingan tingkat protein-positif Wnt11 terdeteksi oleh pewarnaan imunohistokimia. *P <0,05 vs. kelompok kontrol
Ekspresi Wnt-11 diuji dengan imunohistokimia dan hasilnya menunjukkan bahwa protein Wnt-11 terutama diekspresikan dalam sitoplasma, dan ekspresi positif pada dasarnya berwarna kuning kecoklatan atau coklat. Berbeda dengan kelompok kontrol, tingkat positif ekspresi protein Wnt-11 pada kelompok ONFH meningkat (P <0,05) (Gbr. 2d).
MiR-410 yang diregulasi dan Wnt-11 yang diturunkan regulasinya Meningkatkan BMD dan BV/TV Tikus
Mikro-CT menunjukkan bahwa pada kelompok normal, penampilan kepala femoralis bulat, ketebalan leher seragam, dan struktur trabekula tulang terus menerus dan merata. Kepala femur tikus kelompok ONFH, kelompok agomir-NC, kelompok siRNA-NC dan kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 berangsur-angsur runtuh, daerah resorpsi tulang muncul secara bertahap, leher femur menjadi lebih tipis , dan trabekula tulang rusak dan kontinuitasnya hancur. Pada kelompok agomir-miR-410, kelompok Wnt-11-siRNA, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, penampilan tikus tetap utuh, tidak terjadi kolaps, tidak tampak area resorpsi tulang, trabekula tulang diatur secara normal, dan strukturnya lengkap (Gbr. 3a).
MiR-410 yang diekspresikan dengan tinggi dan Wnt-11 yang diekspresikan dengan buruk meningkatkan BMD dan BV/TV tikus. a Hasil micro-CT tikus pada masing-masing kelompok. b Hasil analisis BMD. c Hasil analisis BV/TV. *P <0,05 vs. kelompok normal.
+P <0,05 vs kelompok agomir-NC.
#P <0,05 vs kelompok siRNA-NC.
&P <0,05 vs. grup agomir-miR-410 + OE-NC
Hasil metrologi tulang melaporkan bahwa berbeda dengan kelompok normal, BMD dan BV/TV pada kelompok ONFH mengalami depresi (keduanya P <0,05). Sehubungan dengan kelompok agomir-NC dan kelompok siRNA-NC, BMD dan BV/TV meningkat pada kelompok agomir-miR-410 dan kelompok Wnt-11-siRNA (semua P <0,05). Dibandingkan dengan grup agomir-miR-410 + OE-NC, BMD dan BV/TV di grup agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 dijatuhkan (keduanya P <0,05) (Gbr. 3b, c).
Overekspresi miR-410 dan Ekspresi Wnt-11 yang Buruk Meningkatkan Level BMD dari Femoral Shaft, Femoral Head, dan Spinal Column, dan juga Meningkatkan Serum Kalsium dan Kadar Fosfor Tikus
Hasil rontgen tampak kepala femur pada kelompok normal berbentuk bulat, densitas caput femur seragam, dan strukturnya lengkap. Pada kelompok ONFH, kelompok agomir-NC, kelompok siRNA-NC, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt11, penampakan caput femur tikus semakin tipis dan muncul area resorpsi tulang. Penampilannya merata dan ketebalan caput femur tikus lengkap pada kelompok agomir-miR-410, kelompok Wnt11-siRNA, dan kelompok agomir-miR-410 + kelompok OE-NC (Gbr. 4a).
MiR-410 upregulated dan downregulated Wnt-11 meningkatkan tingkat kepadatan mineral tulang batang femoralis, kepala femoralis, dan tulang belakang, dan juga meningkatkan kadar kalsium dan fosfor serum tikus. a Hasil pengamatan rontgen hewan. b Comparison of the bone mineral density of the femoral shaft, femoral head, and spine in each group. c Comparison of the serum calcium and phosphorus levels in each group. *P <0.05 vs. the normal group.
+P <0.05 vs. the agomir-NC group.
#P <0.05 vs. the siRNA-NC group.
&P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group
BMD and serum calcium and phosphorus level determination reported that compared to the normal group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels, fell in the ONFH group (all P <0.05). In contrast with the agomir-NC group and siRNA-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as serum calcium and phosphorus levels, ascended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0.05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, was abated (all P <0.05) (Fig. 4b, c).
Silencing Wnt-11 and Upregulating miR-410 Alleviate the Pathological Changes of Rat Tissues and Restrain Apoptosis of Osteocytes
The results of HE staining showed that the bone trabeculae were neat and clear and arranged regularly and tightly. Bone cells filled the bone lacunae, and the calcified zone was well connected to the subcartilage bone trabeculae in the normal group. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the bone trabecula was sparse; thinned, and even broken; the structure was disordered; and some fragments appeared. Some osteocytes in the bone lacuna were necrotic and a large number of bone lacuna was in emptiness that no bone cells filled in, and obvious proliferation of granulation tissue was observed in the necrosis bone trabecular space, which was wrapped around the necrotic bone trabeculae. In the agomir-miR-410 group, the Wnt-11-siRNA group, and the agomir-miR-410 + OE-NC group, the appearance of the rats remained intact, no obvious bone resorption area appeared and the bone trabeculae were arranged normally and the structure was complete (Fig. 5a).
Poor expression of Wnt-11 and overexpression of miR-410 alleviate pathological changes of rats tissues and restrain apoptosis of osteocytes. a Morphological observation of the femoral head of rats in each group (200 ×). b Ultrastructural observation of bone cells in rats of each group (8000 ×). c The results of TUNEL staining (200 ×). d Detection of apoptosis rate by TUNEL assay. e Detection of the Bax and Bcl-2 mRNA expression by RT-qPCR. f , g Detection of the Bax and Bcl-2 protein expression by western blot analysis. *P <0.05 vs. the normal group.
+P <0.05 vs. the agomir-NC group.
#P <0.05 vs. the siRNA-NC group.
&P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group
Electron microscopic observation observed that the shape of the bone cells in the normal group was consistent with the lacunae, and there was a small gap between the cell and the lacunae wall. The organelles were abundant, the cells in the lacunae were normal, the nucleus was egg-shaped, the nuclear membrane was intact, the chromatin did not agglutinate, and the cytoplasmic pseudo-foot stretched to the peripheral bone small tube and was connected with the adjacent bone cells. Osteoblasts were located on the surface of the bone trabecula, the sample was long, and there were many organelles. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, a large number of lipid deposits were found in the cytoplasm of osteoblasts, the gap between capsule and lacunae well was further widened, edema bright bands appeared between the nuclear membrane and cytoplasm, nuclear margination showed with compression, nuclear membrane was intact, mitochondria in cytoplasm was swollen, and the endoplasmic reticulum and Gore apparatus disappeared. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the morphology of rat osteoblasts was normal, chromatin aggregation was found in the nucleus of a small number of cells, no obvious lipid droplets were found in the cytoplasm, and the nuclear membrane was intact (Fig. 5b).
The results of TUNEL staining demonstrated that compared to the normal group, the apoptosis rate of osteocytes in the ONFH group was raised (P <0.05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the apoptosis rate of osteocytes abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (both P <0.05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the apoptosis rate of osteocytes enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 5c, d).
Western blot analysis and RT-qPCR reported that the Bcl-2 expression reduced and Bax expression raised in the ONFH group compared to the normal group (both P <0.05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, Bcl-2 expression ascended and Bax expression descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0.05). In contrast with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the Bcl-2 expression declined and Bax expression appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 5e–g).
Overexpression of miR-410 and Low Expression of Wnt-11 Increase the Number of Osteoblasts and Decrease the Number of Osteoclasts
TRAP staining revealed that in the normal group, the morphology of osteoclasts with positive TRAP staining was different, most of them were shuttle or fusiform, few large osteoclasts were polygons, and most of them were distributed around the bone cerebellum. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, TRAP-positive cells were ascended, the morphology of cells was diverse in large polygons and polykaryotes, bone resorption was found in the bone trabeculae adjacent to osteoclasts, and typical resorption lacunae were formed. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of cells positive for TRAP staining was reduced, the cells were in a long strip shape and the morphology was more regular, the polygonous polynuclear osteoclasts were rare, and the bone structure of adjacent bone trabeculae was relatively complete (Fig. 6a).
Overexpression of miR-410 and low expression of Wnt-11 increase the number of osteoblasts and decrease the number of osteoclasts. a Results of TRAP staining in osteoclasts of rats (200 ×). b Count of positive cells in TRAP staining. c Results of ALP staining in osteoblasts of rats in each group (200 ×). d Count of positive cells determined by ALP staining. *P <0.05 vs. the normal group.
+P <0.05 vs. the agomir-NC group.
#P <0.05 vs. the siRNA-NC group.
&P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group
ALP staining presented that in the normal group, in osteoblasts, which were positive for ALP staining, the morphology was small and round. The cells were distributed in aggregation, most of which were located in the bone trabecular space of bone marrow cavity and on the surface of some bone trabeculae. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the number of osteoblasts positive for ALP staining was dispersedly distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblast-positive cells enhanced, and they were distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity and the surface of the part of the bone trabecular (Fig. 6c).
By comparison with the normal group, the number of osteoblasts per unit area was suppressed and the number of osteoclasts was heightened in the ONFH group (both P <0.05). In relation to the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the number of osteoblasts per unit area was heightened and the number of osteoclasts was declined in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0.05). In contrast to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblasts per unit area was declined and the number of osteoclasts was raised in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 6b, d).
Highly Expressed miR-410 and Lowly Expressed Wnt-11 Elevate the Expression of Osteocalcin (OCN), ALP, BGLAP, and Collα1, as well as Abate C- and N-terminal Telopeptides of Type I collagen (NTX-1, CTX-1), ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH Rats
The results of ELISA revealed that in relation to the normal group, the level of osteogenic function index ALP and OCN degraded while the levels of osteoclast function index NTX-1 and CTX-1 heightened in the ONFH group (all P <0.05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, ALP and OCN ascended and NTX-1 and CTX-1 descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0.05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, ALP and OCN dropped and NTX-1 and CTX-1 appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7a).
Highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 elevate the expression of OCN, ALP, BGLAP, and Collα1 as well as abate NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH rats. a Detection of osteogenesis and osteoclast function indices in the serum of rats in each group by ELISA. b Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes by RT-qPCR. c , d Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes protein expression by western blot analysis. *P <0.05 vs. the normal group.
+P <0.05 vs. the agomir-NC group.
#P <0.05 vs. the siRNA-NC group.
&P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group
The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, the expression of osteoblast-related factors ALP, BGLAP, and Collα1 degraded, and osteoclast-related factors ACP5, CTSK, and MMP9 expression ascended (all P <0.05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 elevated, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0.05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 depressed, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression heightened in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7b–d).
Elevated Wnt-11 and Decreased miR-410 are Found in ONFH Tissues of Rats as well as Wnt-11 is the Target Gene of miR-410
The targeting relationship between miR-410 and Wnt-11 gene was analyzed by an online analysis software. It was displayed that a specific binding region existed between Wnt-11 gene sequence and miR-410 sequence, implying that Wnt-11 was the target gene of miR-410 (Fig. 8a). Luciferase activity assay was utilized to verify this relationship (Fig. 8b). The results presented that compared to the NC group, the luciferase activity depressed in the miR-410 mimics group (P <0.05), but there was no significant difference in the luciferase activity of MUT 3′UTR (P> 0.05), indicating that miR-410 could specifically bind to Wnt-11.
Increased Wnt-11 and decreased miR-410 are found in ONFH tissues as well as Wnt-11 is the target gene of miR-410. a Prediction of binding sites of miR-410 on Wnt-11 3′UTR. b Luciferase activity detection for verifying the relationship between miR-410 and Wnt-11. c Detection of miR-410 and Wnt-11 expression by RT-qPCR. d , e Wnt-11 protein expression determined by western blot analysis. f Expression of Wnt-11 in femoral head of rats in each group detected by immunohistochemistry (200 ×). g Comparison of the positive rate of Wnt-11 protein expression in each group. *P <0.05 vs. the normal group.
+P <0.05 vs. the agomir-NC group.
#P <0.05 vs. the siRNA-NC group.
&P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group
The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, miR-410 expression declined and Wnt-11 expression raised in the ONFH group (both P <0.05). By comparison with the agomir-NC group, miR-410 raised and Wnt-11 reduced in the agomir-miR-410 group (both P <0.05). In contrast with the siRNA-NC group, Wnt-11 declined in the Wnt-11-siRNA group (P <0.05). Wnt-11 enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group relative to that in the agomir-miR-410 + OE-NC group (P <0.05) (Fig. 8c–e).
>Wnt-11 expression was verified by immunohistochemistry. Wnt-11 protein was mainly expressed in the cytoplasm, and the positive expression was mainly brownish yellow or brown. Compared to the normal group, the positive rate of Wnt-11 protein expression in the ONFH group was raised (P <0.05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the positive rate of the Wnt-11 protein expression descended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (both P <0.05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the positive rate of Wnt-11 protein expression enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 8f, g).
Discussion
ONFH, a kind of bone destruction disease, is caused by blood supply failure and coagulation and fibrinolysis system disorder and finally causes the femoral head to collapse [19]. A previous study has discussed miRNA expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by hormone in mice with ONFH [20]. Also, a recent study has provided a proof that the expression profile of miRNA of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in osteogenesis related to steroid-induced ONFH [21]. Furthermore, it was revealed the Li-nHA/GM/rhEPO stents can elevate both Wnt and HIF-1/VEGF pathways and promote osteogenesis and angiogenesis, which is beneficial to the repair of ONFH induced by glucocorticoids [22]. Based on these facts, the study aimed to explore the effects of miR-410 in the prevention of ONFH by targeting Wnt-11.
Our study has provided substantial evidence in relation to the notion that miR-410, ALP, BGLAP, and Collα1 degraded and Wnt-11, ACP5, CTSK, and MMP9 enhanced in ONFH tissues. A recent study has promoted that the expression of miR-410 in osteosarcoma is declined, and the anti-tumor effect is shown [23]. Another study has presented miR-410 expression was reduced in human estrogen receptor-positive tissues of breast cancer [24]. It is reported that secreted factor Wnt-11 expression is ascended in several types of cancer, containing colorectal cancer, where it advances the migration and invasion of cancer cells [25]. Similarly, a previous study has proved that Wnt-11 expression is heightened in hormone-independent prostate cancer [26]. ALP is a useful index for the state diagnosis and clinical prognosis of the disease [27]. OCN (bone gamma-carboxyglutamate protein; BGLAP) is a widely conserved molecule related to mineralization of bone matrix [28]. ACP5 is necessary for osteoclast differentiation and bone resorption, and it promotes cell movement by regulating adhesion kinase phosphorylation [29]. CTSK is a critical protease in charge of osteopontin, degrading type I collagen and other bone matrix proteins [30]. MMPs can degrade and modify most of the components of extracellular matrix and basement membrane and push forward an immense influence on cancer invasion and metastasis [31]. Also, our study revealed that Wnt-11 is the target gene of miR-410. Similarly, Zhang et al. found that miR-410 targeted the inferred binding site in the Wnt3a 3′-UTR to modulate the Wnt signaling pathway [32].
In addition, it was revealed that upregulated miR-410 and downregulated Wnt-11 increased BMD and BV/TV of ONFH rats. It has been suggested previously that a decrease of spinal BMD and an increase of urinary DPD/Cr ratio in non-traumatic ONFH patients [33]. Another study has verified that BMD of the femoral head and lumbar vertebrae in the ONFH group were degraded relative to that in the control group [34]. Additionally, imaging analysis revealed muscone can restore BMD and BV/TV ratio of the necrotic femoral head, while histologic examination further confirmed the protective effect of muscone on alcohol-induced ONFH [35]. A result emerged from our data that highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 restrained apoptosis of osteocytes. A study has demonstrated that silencing miR-410 can induce cell proliferation and reduce the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein [36]. It is reported that the descended miR-410 expression and ascended SOCS3 expression could reduce the expression of anti-apoptosis factor Bcl-2 and promoted the apoptosis of cells [37]. In addition, in androgen deficient LNCaP cells, the downregulation of Wnt-11 can prevent neuroendocrine-like differentiation and lead to apoptosis of prostate cancer cells [26]. The study also showed that the downregulation of Wnt-11 and upregulation of miR-410 enhanced ALP, BGLAP, and Collα1 expression and reduced ACP5, CTSK, and MMP9 expression. A study has indicated that Wnt-11 expression heightened in cervical cancer cells may result in activation and phosphorylation of JNK-1 by activating Wnt/Jnk pathway and boosts the proliferation and migration/invasion of tumor cells [15]. It has been suggested that Wnt-11 gene silencing in colorectal cancer cell lines reduced the invasive ability of cells [25]. Furthermore, the overexpression of miR-410 can restrain the invasion, migration, proliferation, and epithelial mesenchymal transformation of osteosarcoma cells via directly targeting TRIM44 [23]. Furthermore, a previous study stated that upregulated miR-410 inhibited the growth of cholangiocarcinoma in a xenograft mouse model by inducing apoptosis [38].
Conclusion
In summary, our investigation revealed that miR-410 was lowly expressed and Wnt-11 was highly expressed in ONFH, and upregulating miR-410 or downregulating Wnt-11 increased osteoblasts and reduced osteoclasts to alleviate ONFH. However, clinical researches might be further carried out to detect the efficacy of miR-410 and Wnt-11 for the treatment of ONFH.
