Penargetan miR-410/Wnt-11 Mengatur Pembentukan Tulang dan Menghambat Osteoklast untuk Mengobati Nekrosis Kepala Femur
Abstrak
Latar Belakang
Sedikit yang diketahui mengenai peran fungsional mikroRNA-410 (miR-410) dalam nekrosis kepala femur (NKF); oleh karena itu, tujuan studi ini adalah untuk mengkaji penargetan miR-410 terhadap Wnt-11 untuk mengatur mekanisme osteogenik dan osteoklastik dalam pencegahan NKF.
Metode
Lima belas sampel NKF dan 15 sampel normal dikumpulkan. Perubahan patologis pada kepala femur, osteoblast, dan osteoklast dalam sampel klinis diamati. Model tikus NKF diinjeksi dengan agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, atau oe-Wnt-11. miR-410; Wnt-11; ekspresi faktor terkait osteoblast fosfatase alkaline (ALP), protein gamma-karboximutasi tulang (BGLAP), dan Collα1; serta ekspresi faktor terkait osteoklast fosfatase asam 5 (ACP5), katepsin K (CTSK), dan MMP9, serta Bcl-2 dan Bax, diuji dengan RT-qPCR dan analisis western blot. Indeks fungsi osteogenik ALP dan OCN bersama dengan indeks fungsi osteoklast NTX-1 dan CTX-1 dalam serum diuji dengan ELISA.
Hasil
miR-410, ALP, BGLAP, dan Collα1 menurun serta Wnt-11, ACP5, CTSK, dan MMP9 meningkat pada jaringan NKF sampel klinis. miR-410 yang ditingkatkan dan Wnt-11 yang diturunkan meningkatkan kepadatan mineral tulang (BMD) dan BV/TV tikus, meningkatkan tingkat BMD pada shaft femur, kepala femur, dan tulang belakang, serta meningkatkan kadar kalsium dan fosfor serum tikus, sambil menahan apoptosis osteosit, meningkatkan ekspresi OCN, ALP, BGLAP, dan Collα1 dan menurunkan ekspresi ACP5, CTSK, NTX-1, CTX-1, dan MMP9 pada tikus.
Kesimpulan
Studi ini menunjukkan bahwa meningkatkan miR-410 atau menurunkan Wnt-11 meningkatkan osteoblast dan mengurangi osteoklast untuk meredakan kejadian NKF. Oleh karena itu, miR-410 dapat berfungsi sebagai target potensial untuk pengobatan NKF.
Pendahuluan
Nekrosis kepala femur (NKF), sebagai salah satu penyakit yang paling umum mempengaruhi sendi pinggul, menyebabkan nyeri parah atau ketercacatan sendi dan terutama terjadi pada orang dewasa [1]. Terapi NKF dewasa, yang memiliki 8,12 juta pasien di Tiongkok, masih menjadi tantangan bagi bedah [2]. Banyak faktor risiko terkait dengan terjadinya NKF, seperti hiperlipidemia, penyakit autoimun, gangguan pengendalian, alkoholisme, dan hiperkortisonisme [3]. Perawatan bedah mencakup dekompresi inti dengan atau tanpa adjuvan, misalnya, sumsum tulang otot, sementara penggantian total pinggul (PTH) ditinggalkan untuk pasien lanjut usia atau nekrosis lanjutan yang tidak diobati dengan pemertahanan sendi [4]. Namun, NKF memiliki prognosis yang tidak memuaskan pada pasien tersebut yang sering memerlukan PTH [5]. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk mengeksplorasi target terapi yang akurat untuk pengobatan NKF.
MikroRNA (miRNA) adalah regulator utama fungsi sel dan ekspresi gen, yang memiliki fungsi besar pada homeostasis endotel dan mungkin menjadi pengobatan baru [6]. Sebuah studi telah melaporkan bahwa miR-410 telah ditemukan ekspresi abnormal dalam beberapa jenis kanker berbahaya manusia dan dapat digunakan sebagai inhibitor tumor pada kanker endometrium, kanker paru-paru, mieloma, dan kanker payudara [7,8,9,10]. Studi lain mengungkapkan bahwa ada efek neuroprotektif miR-410 pada model sel Parkinson yang diinduksi oleh 6-hidroksidopamin dengan menekan jalur sinyal PTEN/AKT/mTOR [11]. Selain itu, miR-410 telah terbukti mengatur perilaku biologis ganas pada anak-anak dengan leukemia limfositik akut melalui penargetan FKBP5 dan jalur sinyal AKT [12]. Sebuah artikel juga telah menunjukkan efek inhibitor miR-410 menargetkan angiotensin II tipe 1 pada kanker pankreas [13]. Protein Wnt adalah jenis lipoglikoprotein tersekresi kaya cysteine, yang memiliki fungsi besar pada perkembangan dan penyakit [14]. Wnt-11 termasuk jalur sinyal Wnt dan adalah regulator positif yang memerankan peran penting dalam karsinogenesis [15]. Ada studi yang melaporkan signifikansi klinis ekspresi antigen karsinoma sel skamosa dan Wnt11 pada kanker rahim kerang [16]. Selain itu, disajikan bahwa sinyal sinergi TGF-β1 dan Wnt11 menggerakkan ekspresi sm-α-actin pada otot halus melalui sinyal Rho kinase-actin-MRTF-A [17]. Berdasarkan literatur di atas, tujuan studi ini adalah untuk mengkaji peran miR-410 mengatur Wnt-11 pada pencegahan NKF, dan hipotesis diajukan bahwa miR-410 menargetkan Wnt-11 dapat mengatur mekanisme osteogenik dan osteoklastik dalam pencegahan NKF.
Materi dan Metode
Pernyataan Etika
Studi ini dilakukan di bawah persetujuan Dewan Tinjau Instansi Rumah Sakit Beijing Shijitan, Universitas Medika Ibukota, dan mengikuti prinsip Deklarasi Helsinki. Peserta memberikan persetujuan tertulis untuk berpartisipasi dalam studi ini. Semua eksperimen hewan sesuai dengan Pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari National Institutes of Health. Protokol diizinkan oleh Komite Etika Eksperimen Hewan Rumah Sakit Beijing Shijitan, Universitas Medika Ibukota.
Subjek Studi
Secara keseluruhan 30 pasien yang dirawat di departemen ortopedi Rumah Sakit Beijing Shijitan, Universitas Medika Ibukota, dari Januari 2017 hingga September 2018 dipilih. Di antara pasien ini, 15 pasien dengan NKF dirawat dengan bedah PTH, usia median pasien adalah 50,6 ± 4,3 tahun, dan berat badan adalah 57,0 ± 5,6 kg dengan 7 laki-laki dan 8 perempuan (kelompok NKF). Lainnya 15 pasien dengan femur cervix fracture dirawat dengan bedah PTH, usia median adalah 59,6 ± 3,3 tahun, dan berat badan adalah 50,0 ± 5,6 kg dengan 9 laki-laki dan 6 perempuan (kelompok kontrol). Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam jenis kelamin, usia, dan berat badan antara kedua kelompok (P > 0,05) yang comparable. Jaringan di area nekrosis subkondrol diambil dengan membelah sepanjang garis longitudinal kepala femur dan disimpan pada −80 °C. Setiap kelompok diperiksa oleh patologi dan biologi molekuler, masing-masing.
Pewarnaan Hematoxylin-Eosin (HE)
Sampel dienkaps dengan paraformaldehyd 4% dan dekalifikasi dengan asam etilena diamina tetraasetat 10%, dan larutan dekalifikasi diganti sekali seminggu. Warna sampel tulang diamati dan tingkat dekalifikasi diukur. Setelah dekalifikasi lengkap, sampel dienkaps dalam paraffin dan diiris dengan ketebalan 4 μm. Irisan yang dipanaskan direndam dalam xylene I dan xylene II selama 10 menit berturut-turut, dan irisan yang sudah dilem dari lilin direndam dalam alkohol mutlak I, alkohol mutlak II, alkohol 95%, alkohol 80%, dan alkohol 70% selama 2 menit, masing-masing. Kemudian irisan diwarnai dengan hematoxylin selama 3 menit dan diferensiasi dengan alkohol asam klorida 1% selama 2 menit. Selanjutnya, irisan direndam dalam alkohol 50%, 70%, dan 80% selama 2 menit berturut-turut dan direndam dalam eosina selama 5 detik. Selanjutnya, irisan direndam dalam alkohol 95%, alkohol mutlak I, dan alkohol mutlak II selama 3 menit dan kemudian direndam dalam xylene I dan xylene II selama 5 menit berturut-turut. Akhirnya, irisan dienkaps dengan gumpal netral dan diperiksa dengan mikroskop.
Pewarnaan Fosfatase Alkaline (ALP)
Satu irisan dipilih dalam setiap sampel dan dipanaskan pada 60 °C selama 60 menit. Irisan paraffin dilem dari lilin dengan xylene I dan xylene II selama 15 menit, masing-masing, dan direndam dalam alkohol mutlak I, alkohol mutlak II, etanol 95%, etanol 90%, etanol 80%, dan etanol 75% selama 5 menit berturut-turut, dan dibersihkan dengan air tislis tiga kali selama 2 menit untuk tiga kali. Irisan ditetapkan dengan beberapa cairan substrat yang disiapkan dalam kit pewarnaan ALP (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Tiongkok), sehingga cairan substrat sepenuhnya menutupi sampel, kemudian diinkubasi pada 37 °C menghindari cahaya selama 15 menit. Cairan pewarna yang berlebih dibuang, dan irisan segera ditetapkan dengan agen kromogenik A selama 5 menit dan dibersihkan dengan air tislis tiga kali selama 30 detik. Kemudian irisan diwarnai dengan agen kromogenik B selama 30 detik dan diperi counterstain dengan reagen selama 30 detik. Foto diperoleh di bawah mikroskop optik 200 ×, dan jumlah osteoblast dihitung melalui sistem analisis citra mikroskop (Image-Proplus 6.0).
Pewarnaan Fosfatase Asam Tahan Tararat (TRAP)
Satu irisan dipilih untuk setiap sampel dan dipanggang pada 60 °C selama 60 menit. Irisan paraffin dilem dari lilin dengan xylene I dan xylene II selama 15 menit, dan direndam dalam alkohol mutlak I, alkohol mutlak II, etanol 95%, etanol 90%, etanol 80%, dan etanol 75% selama 5 menit berturut-turut. Irisan ditetapkan dengan beberapa cairan penangkap yang disiapkan selama 30 detik. Irisan dimasukkan ke dalam rak pewarnaan dan ditempatkan dalam kotak gelap yang berisi larutan pewarnaan TRAP yang baru disiapkan (Sigma, St. Louis, MO, AS), larutan pewarnaan harus sepenuhnya menutupi irisan, dan kemudian irisan diinkubasi dalam bak air pada 37 °C selama 1 jam. Selanjutnya, irisan diberikan counterstain dengan hematoxylin selama 2 menit dan dikeringkan. Karena pewarnaan TRAP akan membusuk seiring waktu, irisan akan segera diperiksa oleh mikroskop tanpa dienkaps. Gambar diperoleh di bawah mikroskop optik 200 ×, dan jumlah osteoklast dihitung oleh sistem analisis citra mikroskop (Image-Proplus 6.0).
Pewarnaan Imunohistokimia
Setelah dekalifikasi, irisan dienkaps dalam lilin paraffin dan diiris dengan ketebalan 4 μm. Irisan dilem dari lilin dengan xylene konvensional, dihidrasi dengan alkohol bertingkat, diinkubasi dengan 3% H2O2 (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, AS) pada 7 °C selama 30 menit, dan kemudian direbus dengan larutan buffer asam sitrat 0,01 M pada 95 °C selama 20 menit. Irisan diblokir dengan cairan kerja serum domba normal selama 10 menit, dicampur dengan antibodi primer Wnt-11 (1:100, Invitrogen, Carlsbad, California, AS) pada 4 °C selama malam hari, antibodi sekunder (kit antibodi sekunder siap pakai (PV-6000), ZSGB-Bio, Beijing, Tiongkok) selama 20 menit, dan cairan kerja streptavidin ovalbumin yang dilabeli peroksidase hirudine (S-A/HRP, Beijing ComWin Biotech Co. Ltd, Beijing, Tiongkok) selama 2 menit. Irisan dikembangkan dengan diaminobenzidin (DAB) (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, AS), diberikan counterstain dengan hematoxylin (Shanghai Bogoo Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, Tiongkok), dan kemudian dienkaps. Larutan garam fosfat terbuffer (PBS) menggantikan antibodi primer sebagai kontrol negatif (NC). Di bawah mikroskop cahaya, sel positif terletak dengan reaksi coklat dalam sitoplasma, ekspresi positif kuat adalah coklat kehitaman, ekspresi positif lemah adalah coklat kehitaman muda, dan ekspresi negatif tidak memiliki pewarnaan. Pewarnaan sel diamati di bawah mikroskop cahaya, lima bidang kuat (400 ×) diamati untuk setiap irisan, dan 100 sel dihitung per bidang. Nilai rata-rata adalah hasil pengamatan setiap irisan. Sesuai dengan proporsi dan distribusi sel positif, ditetapkan sebagai berikut: negatif (−), pewarnaan satu sel, sel positif kurang dari 5%; lemah positif (+), pewarnaan berserakan atau massa sel kecil, jumlah sel positif adalah 5–24%; positif (++), pewarnaan sel berserat atau kluster, jumlah sel positif adalah 25–50%; dan positif kuat (+++), pewarnaan sel difusi, jumlah sel positif lebih dari 50%. Hasil imunohistokimia dievaluasi dengan skor double-blind oleh dua orang secara independen.
Reaksi Rantai Polimerase Kuantitatif Transkripsi Balik (RT-qPCR)
RNA total diekstraksi dari sampel jaringan dengan kit ekstraksi Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California, AS). Konsentrasi dan kekuatan RNA ditentukan. Primer dirancang dan dibuat oleh Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Jepang) (Berkas Tambahan 1: Tabel S1). Kemudian RNA ditranskripsi balik menjadi cDNA menggunakan kit PrimeScript RT (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, Tiongkok). Larutan reaksi digunakan untuk PCR kuantitatif fluoresens, dengan merujuk pada instruksi kit SYBR® Premix Ex TaqTM II (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, Tiongkok). PCR kuantitatif fluoresens dilakukan pada sistem ABI PRISM® 7300 (Applied Biosystems, Massachusetts, AS). U6 adalah kontrol pemuatan miR-410, dan gliseraldehida fosfat dehidrogenase (GAPDH) adalah parameter internal Wnt-11, ALP, protein gamma-karboximutasi tulang (BGLAP), Collα1, fosfatase asam tahan tararat 5 (ACP5), katepsin K (CTSK), matriks metalopeptidase (MMP)9, Bcl-2, dan Bax. Tingkat transkripsi relatif gen target dihitung dengan metode 2−△△Ct [18].
Analisis Western Blot
Protein total diekstraksi dari jaringan kepala femur. Konsentrasi protein setiap sampel diukur dan pemuatan sampel disesuaikan dengan air deionisasi untuk memastikan ukuran konsisten. Gel pemisah dan spasi natrium dodecyl sulfat (10%) disiapkan. Setelah mandi es dan sentrifugasi, sampel dipisahkan oleh elektroforesis dengan jumlah mikrosampler yang sama, dan kemudian protein pada gel dipindahkan ke membran nitrocelulosa. Membran nitrocelulosa dienkaps dengan serbuk susu tanpa lemak 5% pada 4 °C selama malam hari dan dicampur dengan antibodi primer Wnt-11 (1:150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, AS), ALP (1:100, Sigma, St. Louis, MO, AS), BGLAP, Collα1 dan MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam, Cambridge, MA, AS), dan Bcl-2 dan Bax (1:500, Proteintech, Chicago, AS) dan diinkubasi selama malam hari. Dan sampel diberi antibodi sekunder IgG (1:1000, Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd., Hubei, Tiongkok) yang dilabeli HRP dan diinkubasi selama 1 jam. Membran direndam dalam larutan reaksi kemiluminesi ditingkatkan (Pierce, Rockford, IL, AS) selama 1 menit. Setelah membuang cairan, sampel ditutupi dengan film pelestari makanan. Setelah dikembangkan dan diketapkan, hasil diamati. GAPDH adalah parameter internal, dan citra stempel protein dianalisis oleh perangkat lunak ImageJ2x.
Pembuatan Model Tikus NKF
Sembilan puluh tikus Sprague-Dawley (SD) jantan (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, Tiongkok), berat antara 300 g dan 350 g, dipilih. Lingkungan diatur pada 18–25 °C dan kelembaban 45–70%. Tikus dipelihara dalam kandang terpisah menghindari kebisingan. Setelah 1 minggu adaptasi pemeliharaan, eksperimen lanjutan dilakukan.
Model dibuat dengan NKF traumatis. Metode pemodelan adalah sebagai berikut: tikus SD dianesteshi dengan rongga perut, diikuti oleh pengepakan rambut dan persiapan kulit. Kulit tikus dipotong, jaringan dipisahkan, dan ikatan bundar dipotong setelah paparan kepala femur. Periostium leher femur tikus dicabut, dan pasokan darah sekitar kepala femur dihancurkan. Kapsul sendi, otot, dan kulit jahit lapis demi lapis dan sterilisasi kembali.
Pengelompokan Hewan
Tujuh puluh tikus SD yang berhasil dimodelkan didistribusikan menjadi tujuh kelompok, dengan 10 tikus dalam setiap kelompok: kelompok NKF; kelompok agomir-NC (0,5 mL agomir NC miR-410 (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, Tiongkok) diinjeksi di sekitar sendi pinggul 1 minggu setelah NKF berhasil dirintis), kelompok agomir-miR-410 (0,5 mL agomir miR-410 (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, Tiongkok) diinjeksi di sekitar sendi pinggul 1 minggu setelah NKF berhasil dirintis), kelompok siRNA-NC (NC dari 0,4 mL vektor Wnt-11 yang disisihkan (mengandung 1 × 109 unit pembentukan plak (PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Tiongkok) diinjeksi di sekitar sendi pinggul 1 minggu setelah NKF berhasil dirintis), kelompok Wnt-11-siRNA (0,4 mL vektor Wnt-11 yang disisihkan (mengandung 1 × 109 PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Tiongkok) diinjeksi di sekitar sendi pinggul 1 minggu setelah NKF berhasil dirintis), kelompok agomir-miR-410 + overexpressed (OE)-NC (0,5 mL agomir miR-410 dan NC dari 0,4 mL vektor Wnt-11 yang ditingkatkan (mengandung 1 × 109 PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Tiongkok) diinjeksi di sekitar sendi pinggul 1 minggu setelah NKF berhasil dirintis), dan kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (0,5 mL agomir miR-410 dan 0,4 mL vektor Wnt-11 yang ditingkatkan (mengandung 1 × 109 PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Tiongkok) diinjeksi di sekitar sendi pinggul 1 minggu setelah NKF berhasil dirintis). Sementara itu, kelompok normal (hanya larutan garam yang diinjeksi ke rongga perut, 10 tikus) ditetapkan sebagai kontrol. Setelah 4 minggu NKF, mikro-CT, analisis osteonometri, pengamatan sinar-X, densitometri tulang, dan penentuan kadar kalsium dan fosfor serum dilakukan.
Pengujian Mikro-CT dan Analisis Osteonometri
Kepala femur kanan tikus ditempatkan pada mesin mikro-CT (General Electric (GE) Company, Massachusetts, AS), dan fantom standar yang diacak juga dipindai. Parameter pemindaian adalah sebagai berikut: resolusi 27 μm × 27 μm × 27 μm, arus pemindaian 450 mA, tegangan pemindaian 80 kV, dan waktu pemindaian tunggal 88 menit. Mikrostruktur kepala femur tikus diamati secara detail. Setelah kalibrasi sesuai spesifikasi, tiga wilayah minat (ROI) kubus dipilih secara acak dari berbagai kelompok tikus untuk rekonstruksi (0,5 × 0,5 × 0,5 cm3). Pengolahan citra dilakukan dengan perangkat lunak mesin GE Microview, dan ROI direkonstruksi dan dianalisis oleh metrologi tulang. Parameter kepadatan mineral tulang (BMD) dan fraksi volume tulang (BV/TV) dipilih.
Pengamatan Sinar-X, Penentuan BMD, dan Penentuan Tingkat Kalsium dan Fosfor Serum
Empat minggu setelah operasi, tikus di setiap kelompok diinjeksi melalui perut dengan hidrat kloral 10%. Setelah anestesi, tikus ditempatkan dalam posisi supine, anggota badan diikat dan kemudian diperiksa dengan foto sinar-X. Perubahan bentuk dan kepadatan kepala femur diamati. Kepadatan tulang pada leher femur kiri, kepala femur, dan tulang belakang diuji dengan instrumen pengukur densitas tulang energi ganda. Pada 4 minggu setelah operasi, tikus di setiap kelompok dikebat selama 12 jam sebelum pengambilan darah. Sampel darah (5 mL) diambil melalui jantung pada pagi hari dan dimasukkan ke dalam tabung gerinjan vakum bersih. Serum dipisahkan dengan sentrifugasi 3000 r/min selama 15 menit. Tingkat kalsium dan fosfor serum diukur dengan analyzer biokimia otomatis.
Pengamatan Mikroskop Elektron
Massa jaringan tulang tikus dienkaps dengan gluteraldehida 3,5%, dekalifikasi dengan larutan asam klorida 5% dan asam osmih 1%, kemudian dihidrasi dengan aseton bertingkat, diwarnai dua kali dengan asetat uranium dan asam sitrat, dan terakhir dienkaps dengan Epon-61. Setelah irisan semi-halus disiapkan, irisan ultra-halus diamati oleh mikroskop transmisi elektron.
Tes TdT-Mediated dUTP-Biotin Nick End-Labeling (TUNEL)
Irisan yang dienkaps dengan paraffin dipra-proses dengan lem dari lilin dan dehidrasi konvensional. Irisan diinkubasi dengan pepsin (0,25~0,0% larutan asam klorida) selama 25 menit, kemudian ditetapkan 50 μL larutan reaksi TUNEL yang dicampur dan diinkubasi dalam kotak lembap selama 60 menit, dan ditetapkan 50 μL agen-peroksidase dan diinkubasi dalam kotak lembap selama 30 menit. Irisan dikembangkan dengan reagen DAB, apakah irisan berwarna dan diamati di bawah mikroskop. Irisan ditambahkan air untuk menghentikan perkembangan dan diwarnai dengan hematoxylin selama 2 menit. Kemudian irisan direndam dalam etanol 95% I–II, etanol mutlak I–II selama 3–5 menit, masing-masing, xylene I–II selama 3–5 menit dan dienkaps dengan gumpal netral. Hasil dianalisis di bawah mikroskop cahaya.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Setelah tikus dianesteshi, darah dari arteri paha diambil dan sampel serum dikumpulkan dengan sentrifugasi setelah istirahat 1 jam. Berdasarkan spesifikasi kit ELISA (Shanghai enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Tiongkok), tujuh lubang standar diberi berbagai standar konsentrasi (100 μL) berturut-turut, lubang kosong diberi 100 μL larutan pengencer standar, dan lubang yang tersisa diberi 100 μL sampel yang akan diuji. Plate enzim dienkaps dengan film dan ditempatkan selama 1 jam, dan kemudian cairan dibuang. Larutan (100 μL) ditambahkan ke semua lubang, dan plate enzim ditutupi dengan film selama 1 jam. Setelah dicuci, 100 μL larutan B ditambahkan ke semua lubang, dan plate enzim ditutupi dengan film selama 30 menit. Kemudian larutan substrat tetrametilbenzidin (90 μL) ditambahkan, plate enzim ditutupi dengan film selama 10–20 menit dan 50 μL larutan penghenti ditambahkan ke semua lubang. Nilai densitas optik (OD) setiap lubang diukur dengan pembaca plate, dan konsentrasi aktual sampel dihitung.
Tes Laporan Gen Dual Luciferase
Tempat ikatan dan hubungan target miR-410 dan 3′ wilayah tidak terjemahkan (UTR) Wnt-11 diramalkan menggunakan perangkat lunak bioinformatika https://www.targetscan.org. Urutan wilayah promotor 3′UTR Wnt-11 yang berisi tempat ikatan miR-410 disusun dan dimasukkan ke dalam vektor plasmid pMIR-REPORTTM Luciferase (Ambion, Company, Austin, TX, AS) untuk formulasi plasmid Wnt-11 3′UTR tipe liar (Wnt-11-WT). Dan plasmid Wnt-11 3′UTR mutan (Wnt-11-MUT) dibangun berdasarkan plasmid dan tempat ikatan mutan. Ikuti langkah-langkah kit ekstraksi plasmid yang dibeli (Promega, Madison, Wisconsin, AS), dan sel logaritmik ditanam pada plate 96-lubang. ketika ke padatan sel sekitar 70%, Lipofectamine 2000 diadopsi untuk transfeeksi. Wnt-11-WT dan Wnt-11-MUT dicampur dengan mimics NC dan miR-410 mimics (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Tiongkok), masing-masing, dan kemudian ditransfeeksi bersama ke sel 293 T. Sel dikumpulkan dan dilisis setelah ditransfeeksi 48 jam, dan aktivitas luciferase diuji dengan kit deteksi luciferase (BioVision, San Francisco, CA, AS) dan luminometer Glomax 20/20 (Promega, Madison, Wisconsin, AS).
Analisis Statistik
Semua data diproses dengan perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, AS). Data pengukuran disampaikan dengan rata-rata ± simpangan baku. Analisis variansi satu arah (ANOVA) dilakukan untuk perbandingan kelompok ganda dan uji t untuk perbandingan dua kelompok dan uji t perbedaan yang tidak signifikan Fisher (LSD-t) digunakan setelah ANOVA. Nilai P < 0,05 menunjukkan perbedaan yang berarti secara statistik.
Hasil
Perubahan Patologis pada Jaringan NKF Sampel Klinis
Pewarnaan HE digunakan untuk mengamati perubahan patologis pada kepala femur dalam kelompok femur cervix fracture (kelompok kontrol) dan kelompok NKF; hasilnya melaporkan bahwa dalam kelompok kontrol, kepadatan trabekula tulang terdistribusi dengan baik, dan struktur utuh. Sementara dalam kelompok NKF, terdapat banyak ruang tulang kosong pada serebelum tulang, dengan sel tulang berkurang, dan trabekula tulang terus berubah. Selain itu, terdapat proliferasi jaringan lain di sekitar serebelum tulang (Gambar 1a).
Perubahan patologis pada jaringan NKF sampel klinis. a Hasil pewarnaan HE dalam setiap kelompok (200 ×). b Hasil pewarnaan TRAP dan hitungan sel positif TRAP dalam setiap kelompok (200 ×). c Hasil pewarnaan ALP dan hitungan sel positif ALP dalam setiap kelompok (400 ×). *P < 0,05 vs. kelompok kontrol
Pewarnaan TRAP menunjukkan bahwa TRAP terutama ditemukan pada osteoklast dan sering digunakan untuk mengidentifikasi osteoklast matang dalam amaranth. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, jumlah osteoklast positif TRAP dalam kelompok NKF meningkat, morfologi osteoklast beragam, dan sel besar dengan penampilan multinukleus. Cacat tulang yang jelas diamati pada serebelum tulang yang berdekatan dengan osteoklast, yang menunjukkan resorpsi tulang (Gambar 1b).
Hasil pewarnaan ALP menunjukkan bahwa ALP adalah enzim penanda diferensiasi dan maturasi osteoblast, yang terlibat dalam pengaturan maturasi kalsifikasi matriks tulang. Oleh karena itu, ekspresi ALP biasanya digunakan untuk mengidentifikasi osteoblast. Butiran coklat atau kopi dapat dilihat dalam sitoplasma osteoblast matang. Hubungan dengan kelompok kontrol, jumlah osteoblast positif ALP berkurang dalam kelompok NKF (Gambar 1c).
miR-410, ALP, BGLAP, dan Collα1 Menurun dan Wnt-11, ACP5, CTSK, dan MMP9 Meningkat pada Jaringan NKF Sampel Klinis
Analisis western blot dan RT-qPCR menunjukkan bahwa ekspresi miR-410 dalam kelompok NKF menurun dibandingkan dengan kelompok kontrol, sementara ekspresi Wnt-11 meningkat; ekspresi faktor terkait osteoblast ALP, BGLAP, dan Collα1 menurun; dan ekspresi faktor terkait osteoklast ACP5, CTSK, dan MMP9 meningkat (semua P < 0,05) (Gambar 2a–c).
miR-410, ALP, BGLAP, dan Collα1 menurun dan Wnt-11, ACP5, CTSK, dan MMP9 meningkat pada jaringan NKF sampel klinis. a Deteksi miR-410, Wnt-11, dan gen terkait osteoblast dan osteoklast oleh RT-qPCR. b Wnt-11 dan protein terkait osteoblast dan osteoklast terdeteksi oleh analisis western blot. c Bentuk pita protein Wnt-11 dan protein terkait osteoblast dan osteoklast. d Ekspresi Wnt11 (400 ×) dan perbandingan tingkat positif protein Wnt11 terdeteksi oleh pewarnaan imunohistokimia. *P < 0,05 vs. kelompok kontrol
Ekspresi Wnt-11 diuji oleh imunohistokimia dan hasilnya menunjukkan bahwa protein Wnt-11 terutama diekspresi dalam sitoplasma, dan ekspresi positif pada dasarnya coklat kehitaman atau coklat. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, tingkat positif ekspresi protein Wnt-11 dalam kelompok NKF meningkat (P < 0,05) (Gambar 2d).
miR-410 yang Ditingkatkan dan Wnt-11 yang Diturunkan Meningkatkan BMD dan BV/TV Tikus
Mikro-CT menunjukkan bahwa dalam kelompok normal, tampilan kepala femur bulat, ketebalan leher seragam, dan struktur trabekula tulang berkelanjutan dan terdistribusi merata. Kepala femur tikus dalam kelompok NKF, kelompok agomir-NC, kelompok siRNA-NC, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 secara berturut-turut runtuh, area resorpsi tulang muncul secara berturut-turut, leher femur menjadi lebih tipis, dan trabekula tulang patah dan kontinuitas dihancurkan. Dalam kelompok agomir-miR-410, kelompok Wnt-11-siRNA, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, tampilan tikus tetap utuh, tidak terjadi runtuhan, tidak ada area resorpsi tulang yang jelas, trabekula tulang diatur secara normal, dan struktur utuh (Gambar 3a).
miR-410 yang sangat diekspresi dan Wnt-11 yang ekspresinya rendah meningkatkan BMD dan BV/TV tikus. a Hasil mikro-CT tikus dalam setiap kelompok. b Hasil analisis BMD. c Hasil analisis BV/TV. *P < 0,05 vs. kelompok normal. +P < 0,05 vs. kelompok agomir-NC. #P < 0,05 vs. kelompok siRNA-NC. &P < 0,05 vs. kelompok agomir-miR-410 + OE-NC
Hasil metrologi tulang melaporkan bahwa dibandingkan dengan kelompok normal, BMD dan BV/TV dalam kelompok NKF menurun (keduanya P < 0,05). Hubungan dengan kelompok agomir-NC dan kelompok siRNA-NC, BMD dan BV/TV meningkat dalam kelompok agomir-miR-410 dan kelompok Wnt-11-siRNA (semua P < 0,05). Dengan membandingkan dengan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, BMD dan BV/TV dalam kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 menurun (keduanya P < 0,05) (Gambar 3b, c).
miR-410 yang Ditingkatkan dan Wnt-11 yang Ekspresinya Rendah Meningkatkan Tingkat BMD pada Shaft Femur, Kepala Femur, dan Tulang Belakang, serta Meningkatkan Tingkat Kalsium dan Fosfor Serum Tikus
Sinar-X mengamati bahwa tampilan kepala femur dalam kelompok normal bulat, kepadatan kepala femur seragam, dan struktur utuh. Dalam kelompok NKF, kelompok agomir-NC, kelompok siRNA-NC, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt11, tampilan kepala femur tikus menjadi lebih tipis dan area resorpsi tulang muncul. Tampilan seragam dan ketebalan kepala femur tikus utuh dalam kelompok agomir-miR-410, kelompok Wnt11-siRNA, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC (Gambar 4a).
miR-410 yang ditingkatkan dan Wnt-11 yang diturunkan meningkatkan tingkat kepadatan mineral tulang pada shaft femur, kepala femur, dan tulang belakang, serta meningkatkan tingkat kalsium dan fosfor serum tikus. a Hasil pengamatan sinar-X hewan. b Perbandingan kepadatan mineral tulang shaft femur, kepala femur, dan tulang belakang dalam setiap kelompok. c Perbandingan tingkat kalsium dan fosfor serum dalam setiap kelompok. *P < 0,05 vs. kelompok normal. +P < 0,05 vs. kelompok agomir-NC. #P < 0,05 vs. kelompok siRNA-NC. &P < 0,05 vs. kelompok agomir-miR-410 + OE-NC
Penentuan BMD dan tingkat kalsium dan fosfor serum melaporkan bahwa dibandingkan dengan kelompok normal, BMD shaft femur, kepala femur, dan tulang belakang, serta tingkat kalsium dan fosfor serum, menurun dalam kelompok NKF (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok agomir-NC dan kelompok siRNA-NC, BMD shaft femur, kepala femur, dan tulang belakang, serta tingkat kalsium dan fosfor serum, meningkat dalam kelompok agomir-miR-410 dan kelompok Wnt-11-siRNA (semua P < 0,05). Hubungan dengan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, BMD shaft femur, kepala femur, dan tulang belakang, serta tingkat kalsium dan fosfor serum dalam kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11, menurun (semua P < 0,05) (Gambar 4b, c).
Penekanan Wnt-11 dan Pengaturan miR-410 Meredakan Perubahan Patologis Jaringan Tikus dan Menahan Apoptosis Osteosit
Hasil pewarnaan HE menunjukkan bahwa trabekula tulang rapi dan jelas dan diatur secara teratur dan rapat. Sel tulang mengisi ruang tulang, dan zona terkalsifikasi terhubung dengan baik dengan trabekula tulang subkondrol dalam kelompok normal. Dalam kelompok NKF, kelompok agomir-NC, kelompok siRNA-NC, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11, trabekula tulang jarang; tipis, dan bahkan patah; struktur tidak teratur; dan beberapa pecahan muncul. Beberapa osteosit dalam ruang tulang nekrotik dan sejumlah besar ruang tulang kosong yang tidak diisi oleh sel tulang, dan proliferasi jaringan granulasi yang jelas diamati dalam ruang trabekula tulang nekrotik, yang dibungkus oleh trabekula tulang nekrotik. Dalam kelompok agomir-miR-410, kelompok Wnt-11-siRNA, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, tampilan tikus tetap utuh, tidak ada area resorpsi tulang yang jelas dan trabekula tulang diatur secara normal dan struktur utuh (Gambar 5a).
Wnt-11 yang ekspresinya rendah dan miR-410 yang ekspresi berlebih meredakan perubahan patologis jaringan tikus dan menahan apoptosis osteosit. a Pengamatan morfologis kepala femur tikus dalam setiap kelompok (200 ×). b Pengamatan ultrastruktur sel tulang tikus dalam setiap kelompok (8000 ×). c Hasil pewarnaan TUNEL (200 ×). d Deteksi tingkat apoptosis dengan tes TUNEL. e Deteksi ekspresi mRNA Bax dan Bcl-2 oleh RT-qPCR. f, g Deteksi ekspresi protein Bax dan Bcl-2 oleh analisis western blot. *P < 0,05 vs. kelompok normal. +P < 0,05 vs. kelompok agomir-NC. #P < 0,05 vs. kelompok siRNA-NC. &P < 0,05 vs. kelompok agomir-miR-410 + OE-NC
Pengamatan mikroskop elektron mengamati bahwa bentuk sel tulang dalam kelompok normal serupa dengan ruang tulang, dan terdapat celah kecil antara sel dan dinding ruang tulang. Organel melimpah, sel dalam ruang tulang normal, inti berbentuk telur, membran inti utuh, kromatin tidak menggumpal, dan pseudopod sitoplasma meregang ke saluran tulang kecil perifer dan terhubung dengan sel tulang berdekatan. Osteoblast terletak pada permukaan trabekula tulang, sampel panjang, dan banyak organel. Dalam kelompok NKF, kelompok agomir-NC, kelompok siRNA-NC, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11, sejumlah besar depo lipid ditemukan dalam sitoplasma osteoblast, celah antara kapsul dan ruang tulang semakin lebar, pita edema muncul antara membran inti dan sitoplasma, margination inti muncul dengan kompresi, membran inti utuh, mitokondria dalam sitoplasma bengkak, dan retikulum endoplasmik serta aparat Golgi menghilang. Dalam kelompok agomir-miR-410, kelompok Wnt-11-siRNA, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, morfologi osteoblast tikus normal, agregasi kromatin ditemukan dalam inti sejumlah kecil sel, tidak ada titik drop lipid yang jelas ditemukan dalam sitoplasma, dan membran inti utuh (Gambar 5b).
Hasil pewarnaan TUNEL menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok normal, tingkat apoptosis osteosit dalam kelompok NKF meningkat (P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok agomir-NC dan kelompok siRNA-NC, tingkat apoptosis osteosit berkurang dalam kelompok agomir-miR-410 dan kelompok Wnt-11-siRNA (keduanya P < 0,05). Hubungan dengan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, tingkat apoptosis osteosit meningkat dalam kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Gambar 5c, d).
Analisis western blot dan RT-qPCR melaporkan bahwa ekspresi Bcl-2 berkurang dan ekspresi Bax meningkat dalam kelompok NKF dibandingkan dengan kelompok normal (keduanya P < 0,05). Dengan membandingkan dengan kelompok agomir-NC dan kelompok siRNA-NC, ekspresi Bcl-2 meningkat dan ekspresi Bax menurun dalam kelompok agomir-miR-410 dan kelompok Wnt-11-siRNA (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, ekspresi Bcl-2 menurun dan ekspresi Bax bertambah dalam kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (keduanya P < 0,05) (Gambar 5e–g).
miR-410 yang Ditingkatkan dan Wnt-11 yang Ekspresinya Rendah Meningkatkan Jumlah Osteoblast dan Mengurangi Jumlah Osteoklast
Pewarnaan TRAP menunjukkan bahwa dalam kelompok normal, morfologi osteoklast dengan pewarnaan TRAP positif beragam, sebagian besar berbentuk shuttle atau fusiform, beberapa osteoklast besar poligon, dan sebagian besar terdistribusi di sekitar serebelum tulang. Dalam kelompok NKF, kelompok agomir-NC, kelompok siRNA-NC, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11, sel positif TRAP meningkat, morfologi sel beragam dalam poligon besar dan poli karyon, resorpsi tulang ditemukan pada trabekula tulang yang berdekatan dengan osteoklast, dan ruang resorpsi tipikal terbentuk. Dalam kelompok agomir-miR-410, kelompok Wnt-11-siRNA, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, jumlah sel positif pewarnaan TRAP berkurang, sel berbentuk strip panjang dan morfologi lebih teratur, osteoklast poli karyon poligon langka, dan struktur trabekula tulang berdekatan relatif utuh (Gambar 6a).
miR-410 yang ditingkatkan dan Wnt-11 yang ekspresinya rendah meningkatkan jumlah osteoblast dan mengurangi jumlah osteoklast. a Hasil pewarnaan TRAP pada osteoklast tikus (200 ×). b Hitungan sel positif pada pewarnaan TRAP. c Hasil pewarnaan ALP pada osteoblast tikus dalam setiap kelompok (200 ×). d Hitungan sel positif yang ditentukan oleh pewarnaan ALP. *P < 0,05 vs. kelompok normal. +P < 0,05 vs. kelompok agomir-NC. #P < 0,05 vs. kelompok siRNA-NC. &P < 0,05 vs. kelompok agomir-miR-410 + OE-NC
Pewarnaan ALP menunjukkan bahwa dalam kelompok normal, pada osteoblast yang positif pewarnaan ALP, morfologi kecil dan bundar. Sel terdistribusi dalam agregasi, sebagian besar terletak dalam ruang trabekula tulang kaus sumsum tulang dan pada permukaan beberapa trabekula tulang. Dalam kelompok NKF, kelompok agomir-NC, kelompok siRNA-NC, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11, jumlah osteoblast positif pewarnaan ALP terdistribusi secara serempak dalam ruang trabekula kaus sumsum tulang. Dalam kelompok agomir-miR-410, kelompok Wnt-11-siRNA, dan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, jumlah sel positif osteoblast meningkat, dan mereka terdistribusi dalam ruang trabekula kaus sumsum tulang dan permukaan bagian trabekula tulang (Gambar 6c).
Dibandingkan dengan kelompok normal, jumlah osteoblast per satuan luas tertekan dan jumlah osteoklast meningkat dalam kelompok NKF (keduanya P < 0,05). Hubungan dengan kelompok agomir-NC dan kelompok siRNA-NC, jumlah osteoblast per satuan luas meningkat dan jumlah osteoklast menurun dalam kelompok agomir-miR-410 dan kelompok Wnt-11-siRNA (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, jumlah osteoblast per satuan luas menurun dan jumlah osteoklast meningkat dalam kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (keduanya P < 0,05) (Gambar 6b, d).
miR-410 yang Sangat Diekspresi dan Wnt-11 yang Ekspresinya Rendah Meningkatkan Ekspresi Osteokalcin (OCN), ALP, BGLAP, dan Collα1, serta Menurunkan Telopeptida C- dan N-terminal Kolagen Tipe I (NTX-1, CTX-1), ACP5, CTSK, dan Ekspresi MMP9 pada Tikus NKF
Hasil ELISA menunjukkan bahwa hubungannya dengan kelompok normal, tingkat indeks fungsi osteogenik ALP dan OCN menurun sementara tingkat indeks fungsi osteoklast NTX-1 dan CTX-1 meningkat dalam kelompok NKF (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok agomir-NC dan kelompok siRNA-NC, ALP dan OCN meningkat dan NTX-1 dan CTX-1 menurun dalam kelompok agomir-miR-410 dan kelompok Wnt-11-siRNA (semua P < 0,05). Dengan membandingkan dengan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, ALP dan OCN menurun dan NTX-1 dan CTX-1 bertambah dalam kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (semua P < 0,05) (Gambar 7a).
miR-410 yang sangat diekspresi dan Wnt-11 yang ekspresinya rendah meningkatkan ekspresi OCN, ALP, BGLAP, dan Collα1 serta menurunkan ekspresi NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK, dan MMP9 pada tikus NKF. a Deteksi indeks fungsi osteogenesis dan osteoklast dalam serum tikus dalam setiap kelompok oleh ELISA. b Deteksi gen terkait osteoblast dan osteoklast oleh RT-qPCR. c, d Deteksi ekspresi protein gen terkait osteoblast dan osteoklast oleh analisis western blot. *P < 0,05 vs. kelompok normal. +P < 0,05 vs. kelompok agomir-NC. #P < 0,05 vs. kelompok siRNA-NC. &P < 0,05 vs. kelompok agomir-miR-410 + OE-NC
Hasil analisis western blot dan RT-qPCR mengungkapkan bahwa hubungannya dengan kelompok normal, ekspresi faktor terkait osteoblast ALP, BGLAP, dan Collα1 menurun, dan ekspresi faktor terkait osteoklast ACP5, CTSK, dan MMP9 meningkat (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok agomir-NC dan kelompok siRNA-NC, ekspresi ALP, BGLAP, dan Collα1 meningkat, dan ekspresi ACP5, CTSK, dan MMP9 berkurang dalam kelompok agomir-miR-410 dan kelompok Wnt-11-siRNA (semua P < 0,05). Dengan membandingkan dengan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, ekspresi ALP, BGLAP, dan Collα1 tertekan, dan ekspresi ACP5, CTSK, dan MMP9 meningkat dalam kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (semua P < 0,05) (Gambar 7b–d).
Wnt-11 yang Tinggi dan miR-410 yang Rendah Ditemukan pada Jaringan NKF Tikus serta Wnt-11 adalah Gen Target miR-410
Hubungan penargetan antara miR-410 dan gen Wnt-11 dianalisis oleh perangkat lunak analisis online. Ditampilkan bahwa terdapat wilayah ikatan spesifik antara urutan gen Wnt-11 dan urutan miR-410, yang mengimplikasikan bahwa Wnt-11 adalah gen target miR-410 (Gambar 8a). Tes aktivitas luciferase digunakan untuk memverifikasi hubungan ini (Gambar 8b). Hasil menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok NC, aktivitas luciferase tertekan dalam kelompok miR-410 mimics (P < 0,05), tetapi tidak ada perbedaan yang signifikan dalam aktivitas luciferase MUT 3′UTR (P > 0,05), yang menunjukkan bahwa miR-410 dapat secara spesifik terikat pada Wnt-11.
Wnt-11 yang meningkat dan miR-410 yang menurun ditemukan pada jaringan NKF serta Wnt-11 adalah gen target miR-410. a Ramalan tempat ikatan miR-410 pada Wnt-11 3′UTR. b Deteksi aktivitas luciferase untuk memverifikasi hubungan antara miR-410 dan Wnt-11. c Deteksi ekspresi miR-410 dan Wnt-11 oleh RT-qPCR. d, e Ekspresi protein Wnt-11 ditentukan oleh analisis western blot. f Ekspresi Wnt-11 pada kepala femur tikus dalam setiap kelompok terdeteksi oleh imunohistokimia (200 ×). g Perbandingan tingkat positif ekspresi protein Wnt-11 dalam setiap kelompok. *P < 0,05 vs. kelompok normal. +P < 0,05 vs. kelompok agomir-NC. #P < 0,05 vs. kelompok siRNA-NC. &P < 0,05 vs. kelompok agomir-miR-410 + OE-NC
Hasil analisis western blot dan RT-qPCR mengungkapkan bahwa hubungannya dengan kelompok normal, ekspresi miR-410 menurun dan ekspresi Wnt-11 meningkat dalam kelompok NKF (keduanya P < 0,05). Dengan membandingkan dengan kelompok agomir-NC, miR-410 meningkat dan Wnt-11 berkurang dalam kelompok agomir-miR-410 (keduanya P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok siRNA-NC, Wnt-11 berkurang dalam kelompok Wnt-11-siRNA (P < 0,05). Wnt-11 meningkat dalam kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 relatif terhadap kelompok agomir-miR-410 + OE-NC (P < 0,05) (Gambar 8c–e).
Ekspresi Wnt-11 diverifikasi oleh imunohistokimia. Protein Wnt-11 terutama diekspresi dalam sitoplasma, dan ekspresi positif terutama coklat kehitaman atau coklat. Dibandingkan dengan kelompok normal, tingkat positif ekspresi protein Wnt-11 dalam kelompok NKF meningkat (P < 0,05). Dengan membandingkan dengan kelompok agomir-NC dan kelompok siRNA-NC, tingkat positif ekspresi protein Wnt-11 menurun dalam kelompok agomir-miR-410 dan kelompok Wnt-11-siRNA (keduanya P < 0,05). Hubungannya dengan kelompok agomir-miR-410 + OE-NC, tingkat positif ekspresi protein Wnt-11 meningkat dalam kelompok agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Gambar 8f, g).
Diskusi
NKF, jenis penyakit penghancuran tulang, disebabkan oleh kegagalan pasokan darah dan gangguan sistem koagulasi dan fibrinolisis dan akhirnya menyebabkan runtuhnya kepala femur [19]. Sebuah studi sebelumnya telah membahas ekspresi miRNA dalam sel akar mesenkim sumsum tulang yang diinduksi oleh hormon pada tikus dengan NKF [20]. Juga, studi terbaru telah memberikan bukti bahwa profil ekspresi miRNA sel akar mesenkim sumsum tulang dalam osteogenesis terkait NKF yang diinduksi steroid [21]. Selain itu, terungkap bahwa stent Li-nHA/GM/rhEPO dapat meningkatkan jalur Wnt dan HIF-1/VEGF dan mempromosikan osteogenesis serta angiogenesis, yang bermanfaat untuk perbaikan NKF yang diinduksi glukokortikoid [22]. Berdasarkan fakta ini, studi ini bertujuan untuk mengeksplorasi efek miR-410 dalam pencegahan NKF dengan menargetkan Wnt-11.
Studi kami telah memberikan bukti yang substansial terkait dengan gagasan bahwa miR-410, ALP, BGLAP, dan Collα1 menurun dan Wnt-11, ACP5, CTSK, dan MMP9 meningkat pada jaringan NKF. Studi terbaru telah mempromosikan bahwa ekspresi miR-410 dalam osteosarcoma menurun, dan efek anti-tumor ditunjukkan [23]. Studi lain telah menyajikan bahwa ekspresi miR-410 berkurang pada jaringan kanker payudara positif reseptor estrogen manusia [24]. Dilaporkan bahwa ekspresi faktor terserbu Wnt-11 meningkat pada beberapa jenis kanker, termasuk kanker kolorektal, di mana ia mempercepat migrasi dan invasi sel kanker [25]. Demikian pula, studi sebelumnya telah membuktikan bahwa ekspresi Wnt-11 meningkat pada kanker prostat independen hormon [26]. ALP adalah indeks yang berguna untuk diagnosis keadaan dan prognosis klinis penyakit [27]. OCN (protein gamma-karboximutasi tulang; BGLAP) adalah molekul yang luas terkait dengan terkalsifikasi matriks tulang [28]. ACP5 diperlukan untuk diferensiasi osteoklast dan resorpsi tulang, dan ia mempromosikan pergerakan sel dengan mengatur fosforilasi kinasi adhesi [29]. CTSK adalah protease kritis yang bertanggung jawab atas osteopontin, degradasi kolagen tipe I dan protein matriks tulang lainnya [30]. MMP dapat mengurai dan memodifikasi sebagian besar komponen matriks selular dan membran dasar dan mendorong pengaruh besar pada invasi dan metastase kanker [31]. Juga, studi kami mengungkapkan bahwa Wnt-11 adalah gen target miR-410. Demikian pula, Zhang et al. menemukan bahwa miR-410 menargetkan tempat ikatan yang diramalkan dalam Wnt3a 3′-UTR untuk mengatur jalur sinyal Wnt [32].
Selain itu, terungkap bahwa miR-410 yang ditingkatkan dan Wnt-11 yang diturunkan meningkatkan BMD dan BV/TV tikus NKF. Sebelumnya telah disarankan bahwa penurunan BMD tulang belakang dan peningkatan rasio DPD/Cr urin pada pasien NKF non-traumatis [33]. Studi lain telah memverifikasi bahwa BMD kepala femur dan tulang belakang dalam kelompok NKF menurun dibandingkan dengan kelompok kontrol [34]. Selain itu, analisis citra mengungkapkan bahwa muscone dapat memulihkan BMD dan rasio BV/TV kepala femur nekrotik, sementara pemeriksaan histologis lebih lanjut mengkonfirmasi efek pelindung muscone pada NKF yang diinduksi alkohol [35]. Hasil muncul dari data kami bahwa miR-410 yang sangat diekspresi dan Wnt-11 yang ekspresinya rendah menahan apoptosis osteosit. Sebuah studi telah menunjukkan bahwa penekanan miR-410 dapat menginduksi proliferasi sel dan mengurangi apoptosis sel endotel vena tali tali manusia yang diinduksi oleh lipoprotein padat teroksidasi [36]. Dilaporkan bahwa ekspresi miR-410 yang menurun dan ekspresi SOCS3 yang meningkat dapat mengurangi ekspresi faktor anti-apoptosis Bcl-2 dan mempromosikan apoptosis sel [37]. Selain itu, pada sel LNCaP defisiensi androgen, penurunan Wnt-11 dapat mencegah diferensiasi seperti neuroendokrin dan menyebabkan apoptosis sel kanker prostat [26]. Studi ini juga menunjukkan bahwa penurunan Wnt-11 dan peningkatan miR-410 meningkatkan ekspresi ALP, BGLAP, dan Collα1 dan mengurangi ekspresi ACP5, CTSK, dan MMP9. Sebuah studi telah menunjukkan bahwa ekspresi Wnt-11 yang meningkat pada sel kanker rahim kerang dapat mengakibatkan aktivasi dan fosforilasi JNK-1 dengan mengaktifkan jalur Wnt/Jnk dan meningkatkan proliferasi serta migrasi/invasi sel tumor [15]. Disarankan bahwa penekanan gen Wnt-11 pada baris sel kanker kolorektal mengurangi kemampuan invasi sel [25]. Selain itu, ekspresi berlebih miR-410 dapat mencegah invasi, migrasi, proliferasi, dan transformasi epitel-mesenkim sel osteosarcoma dengan secara langsung menargetkan TRIM44 [23]. Selain itu, studi sebelumnya menyatakan bahwa peningkatan miR-410 menghambat pertumbuhan kolangiocarcinoma dalam model tikus xenograft dengan menginduksi apoptosis [38].
Kesimpulan
Secara ringkas, penyelidikan kami mengungkapkan bahwa miR-410 ekspresinya rendah dan Wnt-11 ekspresinya tinggi pada NKF, dan meningkatkan miR-410 atau menurunkan Wnt-11 meningkatkan osteoblast dan mengurangi osteoklast untuk meredakan NKF. Namun, penelitian klinis mungkin perlu dilakukan lebih lanjut untuk mendeteksi efek miR-410 dan Wnt-11 untuk pengobatan NKF.
Ketersediaan Data dan Bahan
Tidak berlaku
Riwayat Perubahan
Singkatan
ALP:
Fosfatase alkaline
ANOVA:
Analisis variansi
BMD:
Kepadatan mineral tulang
EDTA:
Asam etilena diamina tetraasetat
ELISA:
Enzyme-linked immunosorbent assay
GAPDH:
Gliseraldehida fosfat dehidrogenase
GE:
General Electric
HE:
Hematoxylin-eosin
LSD-t:
Uji t perbedaan yang tidak signifikan
miR-410:
MikroRNA-410
miRNAs:
MikroRNA
NC:
Kontrol negatif
OD:
Densitas optik
ONFH:
Nekrosis kepala femur
PBS:
Larutan garam fosfat terbuffer
ROI:
Wilayah minat
RT-qPCR:
Reaksi rantai polimerase kuantitatif transkripsi balik
