Mikrokapsel Polielektrolit Berkinerja Tinggi Terenkode Titik Kuantum PEGylated untuk Bioimaging Lanjutan
Abstrak
Citra fluoresen adalah sumbangan diagnostik modern, memungkinkan visualisasi real-time dari dinamika molekular, selular, dan jaringan. Nanokristal semiconductor—titik kuantum (QD)—menggabungkan emisi dapat disesuaikan ukuran, serap lebar, dan fotostabilitas superior, menjadikannya fluorofor ideal untuk labeli biomolekul dan enkode mikropartikel. Dalam studi ini, kami menyajikan metode terpadu bebas pelarut untuk menyelipkan QD CdSe/ZnS yang terfungsionalisasi PEG dan larut air ke dalam membrana lapisan mikrokapsel polielektrolit melalui penambahan lapis demi lapis. Kapsel rongga yang dihasilkan menunjukkan ukuran seragam (rata-rata 4.45 ± 0.65 µm), kontrol muatan permukaan yang kuat, dan puncak fluoresensi 590 nm yang identik dengan QD bebas. Situsometrika aliran dan mikroskopi fluoresensi mengonfirmasi bahwa kapsel membentuk populasi homogen dengan intensitas sinyal tinggi (~10⁴ satuan PE), yang memungkinkan deteksi yang sederhana dalam instrumen laboratorium standar. Mikrokapsel terenkode QD PEGylated ini menjanjikan sebagai agen bioimaging dan teranostik yang terang dan fotostabil yang dapat difungsikan lebih lanjut untuk pengiriman merespons rangsang.
Pendahuluan
Pengiriman obat yang diarahkan dan citra resolusi tinggi membutuhkan penangkar yang dapat ditelusuri dengan presisi in vivo. Mikrokapsel polielektrolit, yang dirangka melalui penambahan lapis demi lapis elektrostatis, menawarkan platform serbaguna untuk menyisipkan agen fungsional, termasuk nanopartikel magnetik, logam, dan fluoresen. Titik kuantum, dengan spektrum emisi sempit dan simetris yang bertambah seiring ukuran partikel, memungkinkan deteksi multiplex menggunakan satu panjang gelombang eksitasi. Fotostabilitas dan hasil kuantum mereka (~40 %) setara dengan pewarna organik, sementara koefisien padat yang lebih besar memberikan kecerahan lebih tinggi per partikel.
Pembalutan fluoresen tradisional mikrokapsel biasanya bergantung pada konjugasi kovalen atau campuran fisik pewarna, yang dapat menderita kebocoran dan fotoblening. Menyematkan QD di dalam membrana kapsel menawarkan strategi enkode optik yang lebih andal, asalkan QD tetap larut air dan tetap ancur. Di sini kami melaporkan sintesis QD CdSe/ZnS PEGylated yang diakhiri karboksil, integrasinya ke dalam cangkang polielektrolit berlapis, dan karakterisasi komprehensif mikrokapsel fluoresen yang dihasilkan.
Metode
Tujuan, Desain, dan Lingkungan Studi
Pembuatan Mikrokapsel Polielektrolit Terenkode QD
QD CdSe/ZnS core/shell (puncak 590 nm) disintesis oleh Dr. P. Samokhvalov (NRNU MEPhI, Moscow) dan difurnir melalui ekstraksi kloroform berulang dan presipitasi sistein. QD kemudian difungsionalisasi PEG menggunakan derivatif PEG12-COOH yang diakhiri tiol (rasio massa 1:4.6) dan difurnir dengan saringan gel. Diameter hidrodinamik (18.7–23.3 nm) dan potensial ζ (−26.7 ± 0.8 mV) diukur dengan DLS dan mikro-elektroforesis Doppler laser (Zetasizer Nano ZS).
Penambahan lapis demi lapis dilakukan pada mikropartikel kalsium karbonat (CaCO₃). Lima lapis polielektrolit awal (PAH/PSS) dirangka, diikuti oleh adsorpsi QD PEGylated pada permukaan PAH. Lapis PAH/PSS tambahan menutup QD, dan inti CaCO₃ dihilangkan dengan 0.2 M EDTA (pH 6.5). Mikrokapsel rongga yang dihasilkan dimodifikasi permukaan dengan albumin serum sapi (BSA) dengan inkubasi dalam fosfat buffer 50 mM (pH 7.4, 1 % BSA) pada 4 °C selama 12 jam. Suspensi akhir dicuci lima kali dan disimpan pada 4 °C dalam kegelapan.
Mikroskopi Optik dan Fluoresensi
Morfologi dan distribusi ukuran mikrokapsel diperiksa menggunakan Axio Observer 3 (Zeiss) dengan lensa 40×/0.55. Citra fluoresensi menggunakan penerus cahaya merkuri HBO 100, set filter long-pass FITC, dan objektif minyak 100×/1.30 (Immersol 518F). Sampel yang dipotong (150 nm) disiapkan dengan embedding epoksi dan mikro-ulkrotomi (Leica EM UC6). Fluoresensi potongan dicatat dengan set filter TexasRed (eksitasi 560/40 nm, emisi 630/75 nm).
Karakterisasi Fluoresensi
Spektrum emisi QD bebas dan yang dikapsulasi dicatat pada pembaca plate multimodal Infinite 200 PRO (Tecan) menggunakan eksitasi 480 nm. Sampel diusapkan (2630 × g, 20 menit) sebelum pengukuran.
Situsometrika Aliran
Sampel (10⁶ manik/mL) dianalisis pada FACSCanto II (BD) dengan laser 488 nm. Sinyal maju (FSC), sisi (SSC), dan PE (585/42 nm) dicatat. Data diproses dalam FACSDiva.
Bahan
PEG12-HS yang dikarbonilasi (Thermo Fisher), PAH (Mw ≈ 15 kDa, Sigma-Aldrich), PSS (Mw ≈ 70 kDa, Sigma-Aldrich), PAA (Mw ≈ 15 kDa, Sigma-Aldrich), CaCl₂, Na₂CO₃, EDTA, BSA, dan semua reagen dibeli dari Sigma-Aldrich. Larutan disiapkan dengan air MilliQ (18.2 MΩ cm).
Analisis Statistik
Data dianalisis dengan MS Excel 2007 dan Origin Pro 2015; hasil dilaporkan sebagai mean ± SD dari tiga eksperimen independen.
Hasil dan Pembahasan
Pengembangan Mikrokapsel Polielektrolit Terenkode QD
Strategi lapis demi lapis menawarkan rute bebas pelarut dan biokompatibel untuk mengenkapsulasi QD dalam cangkang polielektrolit yang dapat dikontrol. Partikel kalsium karbonat pertama mendapatkan lapis PAH, diikuti oleh lapis PSS dan PAH bergantian untuk membangun cangkang 10 lapis. QD PEGylated, yang membawa muatan permukaan negatif, kemudian diadsorpsi pada lapis PAH terminal dan ditutup dengan lapis polielektrolit tambahan. Pengusiran inti CaCO₃ oleh EDTA menghasilkan kapsel rongga; lapisan BSA akhir memberikan biokompatibilitas dan mengurangi agregasi non-spesifik.
Gambar 1 mengilustrasikan urutan lapisan, evolusi potensial ζ, dan citra mikro fluoresensi representatif dari kapsel akhir.
Desain dan struktur mikrokapsel polielektrolit terenkode titik kuantum (QD): a Skema susunan lapis. b Perubahan potensial ζ selama rangkaian dan pemasangan QD. c Citra mikro fluoresensi mikrokapsel terenkode QD PEGylated. * potensial ζ setelah pengusiran inti; ** setelah lapisan BSA.
SEM potongan silang mengonfirmasi arsitektur rongga dan distribusi seragam QD di dalam membrana (Gambar 5).
Citra mikro potongan mikrokapsel terenkode QD. Panah pada (a) menunjukkan area yang diperbesar pada (b) dan (c).
DLS menunjukkan distribusi ukuran sempit dengan diameter rata-rata 4.45 ± 0.65 µm (Gambar 2), dapat dibandingkan dengan sel darah merah dan cocok untuk pengiriman intravena tanpa melanggar baris darah-jaringan. Di wilayah permeabilitas yang ditingkatkan (misalnya, tumor), kapsel ini dapat keluar dari pembuluh, memungkinkan imaging yang diarahkan.
Distribusi ukuran mikrokapsel polielektrolit yang dienkode optik dengan titik kuantum (n = 600).
Karakteristik Fluoresensi dan Struktural
Spektrum emisi kapsel yang dikapsulasi mempertahankan puncak 590 nm dari QD bebas (Gambar 3), yang menunjukkan bahwa matriks polielektrolit tidak mematikan fluoresensi. Situsometrika aliran menunjukkan pemisahan yang jelas antara kapsel terenkode QD (oranye) dan placebo (abu-abu) dalam saluran PE, dengan intensitas fluoresensi ~10⁴ satuan PE, sementara distribusi FSC/SSC tumpang tindih, mengonfirmasi ukuran dan granularitas yang identik (Gambar 4).
Deteksi mikrokapsel terenkode QD oleh situsometrika aliran: a Dot-plot (SSC-PE). b Histogram PE. c Dot-plot (SSC-FSC). d Histogram FSC. 2500 peristiwa per sampel.
Fotostabilitas tinggi QD, gabungan dengan hasil kuantum ~40 %, menghasilkan kecerahan yang setara atau melebihi pewarna organik konvensional sambil menghindari fotoblening. Kemampuan untuk mengenkode beberapa warna dengan penyesuaikan ukuran menawarkan spektral multiplexing yang tak terbatas.
Kesimpulan
Kami telah menunjukkan rute pembuatan yang dapat direproduksi dan bebas pelarut untuk mikrokapsel polielektrolit terenkode QD PEGylated dengan ukuran seragam, muatan permukaan stabil, dan fluoresensi cerah. Kapsel mudah terdeteksi oleh situsometer aliran standar dan mikroskop konfokal, menjadikannya kandidat kuat untuk bioimaging in vitro dan in vivo. Pekerjaan masa depan akan mengeksplorasi fungsionalisasi merespons rangsang dan integrasi ke dalam platform teranostik.
