Alat Bioimaging Berbasis Mikrokapsul Polielektrolit yang Dikodekan dengan Nanopartikel Semikonduktor Fluorescent:Desain dan Karakterisasi Sifat Fluoresen
Abstrak
Pencitraan fluoresen adalah teknik yang banyak digunakan untuk mendeteksi dan memantau proses distribusi, interaksi, dan transformasi pada tingkat molekuler, seluler, dan jaringan dalam diagnostik modern dan aplikasi biomedis lainnya. Sifat fotofisik unik dari nanocrystals semikonduktor fluoresen "titik kuantum" (QDs) menjadikannya fluorofor canggih untuk pelabelan fluoresen biomolekul atau pengkodean optik mikropartikel untuk digunakan sebagai bioimaging dan agen theranostik dalam pengiriman, visualisasi, diagnostik, dan pencitraan yang ditargetkan. Makalah ini melaporkan hasil pengembangan pendekatan yang ditingkatkan untuk penyandian optik mikrokapsul polielektrolit dengan stabil, ditutupi dengan turunan polietilenglikol multifungsi QD yang larut dalam air, serta karakterisasi sifat optik, sifat morfologi dan struktural dari mikrokapsul yang dikodekan. . Penyematan QD ke dalam membran mikrokapsul polimer melalui deposisi lapis demi lapis pada cangkang polielektrolit polimer yang terbentuk sebelumnya memungkinkan untuk mendapatkan partikel fluoresen cerah dengan muatan yang disesuaikan dan distribusi ukuran yang dapat dibedakan secara jelas oleh flow cytometry sebagai populasi homogen individu. Mikrokapsul fluoresen yang dikembangkan dapat digunakan dalam merancang lebih lanjut bioimaging dan agen teranostik yang sensitif terhadap berbagai rangsangan eksternal bersama dengan fotoeksitasi.
Pengantar
Pengembangan mikro dan nanopartikel polimer fluoresen untuk digunakan sebagai pembawa untuk pengiriman obat, protein, dan molekul asam nukleat yang ditargetkan menjadi perhatian khusus di bidang desain bioimaging dan agen theranostik [1,2,3]. Titik kuantum (QDs) adalah kristal koloid semikonduktor 2 hingga 10 nm dengan panjang gelombang puncak fluoresensi tergantung pada ukuran fisiknya. Spektrum penyerapan yang luas dan spektrum fluoresensi yang sempit dan simetris dengan posisinya tergantung pada ukuran partikel nano memungkinkan sumber radiasi tunggal digunakan untuk fluoresensi yang menarik dalam satu set QD dengan pita fluoresensi yang berbeda, yang dapat digunakan untuk deteksi multipleks. Oleh karena itu, QD sangat menarik dan menjanjikan fluorofor canggih untuk diagnostik dan pencitraan [4].
Penggunaan mikrokapsul polielektrolit sebagai pembawa berbagai komponen fungsional memungkinkan untuk mengembangkan sistem yang merespon berbagai fisik (ultrasound, medan magnet, laser, atau radiasi optik) atau kimia (pH, kekuatan ionik lingkungan mikro, dan polaritas pelarut) rangsangan [5, 6]. Mikrokapsul polielektrolit diperoleh dengan menggunakan deposisi lapis demi lapis dari polielektrolit polimer yang bermuatan berlawanan ke dalam matriks bola. Pembubaran berikutnya dari matriks menghasilkan struktur berongga yang membran polimer stabil terdiri dari kompleks interpolimer polielektrolit [7,8,9]. Teknik adsorpsi lapis demi lapis polielektrolit memungkinkan berbagai komponen fungsional, termasuk nanopartikel magnetik, logam (emas atau perak), atau fluoresen (misalnya, QDs) untuk digabungkan ke dalam membran polimer dan ketebalan membran dikontrol. seperti yang terbentuk [10, 11].
Mikrokapsul berlabel fluoresen menjanjikan agen bioimaging yang dapat digunakan untuk memantau transportasi dan pengiriman in vitro dan in vivo [12, 13]. Dalam metode pelabelan fluoresen (pengkodean optik) mikrokapsul yang tersedia, polimer dikonjugasi atau dicampur secara fisik dengan label fluoresen [14, 15]. Komponen fluoresen yang menentukan sifat optik mikrokapsul juga dapat digabungkan di dalamnya melalui pengendapan bersama polimer yang diberi label dengan pewarna fluoresen selama persiapan mikropartikel matriks, misalnya mikrosferolit kalsium karbonat [16]. Mereka juga dapat dienkapsulasi setelah matriks dihapus; untuk tujuan ini, difusi senyawa dengan berat molekul rendah dan tinggi melalui membran polimer dipastikan dengan meningkatkan kekuatan ionik atau pH lingkungan mikro. Namun, pengkodean optik mikrokapsul polielektrolit dengan nanokristal fluoresen lebih menjanjikan karena sifat optiknya yang unik dan efektivitasnya dalam bioimaging [17].
Metode pengkodean yang diketahui dengan memasukkan QD ke dalam membran polimer mikrokapsul polielektrolit menggunakan QD yang larut dalam air dengan ligan dengan berat molekul rendah, misalnya asam tioglikolat atau sistein [18, 19]. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan mikrokapsul polielektrolit fluoresen yang sangat stabil yang dikodekan secara optik dengan CdSe/ZnS (inti/kulit) QD yang larut dalam air yang permukaannya juga dimodifikasi dengan turunan tiol dari polietilen glikol (PEG) yang mengandung gugus terminal karboksil dan untuk memperkirakan karakteristik fluoresensi dan struktur mikrokapsul fluoresen yang dihasilkan.
Metode
Tujuan, Desain, dan Setting Studi
Fabrikasi Mikrokapsul Polielektrolit Berkode QD
CdSe/ZnS (inti/kulit) QD dengan fluoresensi maksimum pada 590 nm dilapisi dengan trioctylphosphine oxide (TOPO) disintesis oleh Dr. P. Samokhvalov di Laboratory of Nano-Bioengineering NRNU MEPhI (Moskow, Rusia). Pemurnian dan pelarutan QD dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [20, 21]. TOPO dihilangkan dari permukaan QD dengan melarutkan QD dalam kloroform dan kemudian mengendapkannya dengan metanol; prosedur diulang tiga kali. Setelah itu, QDs dilarutkan lagi dalam kloroform dan diendapkan dengan larutan sistein dalam metanol pada rasio massa QD-sistein 1:0,13. Endapan QD dicuci dari kelebihan sistein dengan metanol dan dikeringkan dalam konsentrator vakum. QD kering disuspensikan kembali dalam air dengan penambahan 0,1 M natrium hidroksida. Setelah itu, dispersi disonikasi menggunakan penangas ultrasound dan disaring (ukuran pori, 0,22 μm). Pada dispersi yang dihasilkan, turunan tiol dari PEG yang mengandung gugus karboksil terminal ditambahkan pada perbandingan massa 1:4,6. Campuran diinkubasi semalaman pada suhu 4 °C dan QD PEGylated dimurnikan menggunakan kromatografi filtrasi gel. Kandungan QD dari sampel yang diperoleh ditentukan secara spektrofotometri pada panjang gelombang eksiton pertama. QD terlarut dicirikan oleh diameter hidrodinamik dan potensi menggunakan hamburan cahaya dinamis dan mikroelektroforesis laser Doppler dengan menggunakan Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK).
Pengkodean QD dilakukan dengan menggunakan teknik modifikasi deposisi lapis demi lapis dari polikation bermuatan berlawanan dan polimer polianion, serta QD yang larut dalam air yang difungsikan dengan turunan tiol karboksilasi dari PEG, ke permukaan mikropartikel kalsium karbonat yang diperoleh seperti dijelaskan sebelumnya [22]. Lapisan polielektrolit polimer terbentuk dari polikation poli(alillamin hidroklorida) (PAH) dan polianion poli(natrium 4-stirenasulfonat) (PSS) atau asam poliakrilat (PAA); fluorofor adalah PEGylated CdSe/ZnS QDs yang larut dalam air dengan puncak fluoresensi pada panjang gelombang 590 nm, potensi -26.7 ± 0.8 mV, dan diameter hidrodinamik dari 18,7 hingga 23,3 nm. Selama mikrokapsul yang dikodekan QD, proses pembuatan setelah setiap deposisi lapisan muatan permukaan mikropartikel (-potensial) dikendalikan menggunakan mikroelektroforesis laser Doppler.
Mikropartikel kalsium karbonat disuspensikan kembali dalam air ultra murni, dan 0,5 mL larutan PAH 2 mg/mL dalam 0,5 M NaCl ditambahkan. Suspensi disonikasi dalam rendaman ultrasound dan diinkubasi selama 20 menit sambil diaduk pada suhu kamar. Setelah itu, kelebihan polimer dicuci dengan sentrifugasi diikuti dengan resuspensi dalam air MilliQ. Untuk menerapkan lapisan berikutnya, yang terdiri dari polianion polimer, manik-manik mikro disuspensikan kembali dalam 0,5 mL air ultra murni, dan suspensi dicampur dengan 0,5 mL larutan PSS 2 mg/mL dalam 0,5 M NaCl, disonikasi dalam penangas ultrasound untuk 60 detik, diinkubasi selama 20 menit sambil diaduk pada suhu kamar, dan dicuci dari kelebihan polimer seperti dijelaskan di atas. Pencucian mikropartikel setelah setiap tahap aplikasi polielektrolit diulang tiga kali. Sebelum pengkodean, lima lapisan polielektrolit diaplikasikan pada mikropartikel kalsium karbonat, lapisan kelima terdiri dari polikation. Setelah itu, QD terlarut ditambahkan, dan campuran diinkubasi sambil diaduk secara permanen selama 80 menit. Kemudian, enam lapisan berturut-turut dari polimer bermuatan berlawanan diterapkan, yang keenam terdiri dari polianion PSS atau PAA. Mikrokapsul polielektrolit berongga yang dikodekan dengan QD diperoleh dengan melarutkan inti kalsium karbonat dari manik-manik mikro yang dihasilkan dengan mencucinya dengan disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA) 0,2 M (pH 6,5). Setelah itu, permukaan mikrokapsul juga dimodifikasi dengan bovine serum albumin (BSA) (Sigma-Aldrich, USA) dengan mendispersikan mikropartikel dalam larutan buffer fosfat 50 mM (pH 7,4) yang mengandung 1% BSA dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 4 °C selama 12 jam dalam gelap. Sesaat sebelum digunakan, suspensi mikrokapsul berongga dicuci dengan BSA berlebih lima kali dengan larutan dapar fosfat 50 mM (pH 7,4). Mikrokapsul polielektrolit yang diperoleh disimpan pada suhu 4 °C di tempat gelap.
Mikroskopi Optik dan Fluoresensi dari Mikrokapsul Polielektrolit Berkode QD
Morfologi dan distribusi ukuran mikropartikel dianalisis menggunakan mikroskop optik dan fluoresensi. Untuk memperkirakan distribusi ukuran mikropartikel, kami memperbaiki 5 μL suspensi mikropartikel dalam 10 μL 50% gliserol pada slide. Sampel diperiksa dengan mikroskop Axio Observer 3 (Carl Zeiss, Jerman) dengan lensa LD A-Plan 40x/0.55 M27 dalam bidang cahaya. Gambar fluoresen diperoleh menggunakan iluminator merkuri HBO 100 (Burner Mercury) dengan set filter longpass XF115-2 FITC, termasuk filter dichroic 505DRLP, filter eksitasi 475AF40, dan filter emisi 510ALP (Omega Optical, AS), EC Plan -Lensa Neofluar 100x/1,30 Oil Iris M27 (WD = 0.20 mm), bukaan numerik yang dapat disesuaikan dari 0,7 hingga 1,3, dan oli imersi Immersol 518F (Carl Zeiss, Jerman).
Karakteristik morfologi dari mikrokapsul yang diperoleh dipelajari dalam bagian mikrokapsul polielektrolit yang dikodekan secara optik dengan permukaan bebas BSA yang difiksasi dalam media penyisipan epoksi. Untuk tujuan ini, suspensi mikrokapsul didehidrasi secara berurutan dengan larutan etanol berair 30, 50, 70, dan 95% dan kemudian diperlakukan dengan etanol absolut (Acros Organics, USA) tiga kali untuk memastikan dehidrasi lengkap. Setiap tahap dehidrasi berlangsung selama 15 menit. Sampel dehidrasi mikrokapsul dipindahkan ke campuran epoksi-etanol 1:1 selama 12 jam dan kemudian ke campuran epoksi-etanol 3:1 selama 3 jam. Kemudian, sampel dipindahkan ke media epoksi embedding bersih, dan blok epoksi dipolimerisasi pada suhu 45 °C selama 12 jam dan pada suhu 60 °C selama 72 jam. Kemudian, bagian 150-nm dipotong dari blok-blok yang mengandung mikrokapsul polielektrolit berkode QD berfluoresensi dengan menggunakan ultramikrotom Leica EM UC6 (Leica Microsystems, Austria) yang dilengkapi dengan pisau berlian Ultra AFM 35 (Diatome, Swiss) dengan lebar 2,0 mm. Potongan dipindahkan ke slide dan diperiksa di bawah mikroskop fluoresen Axio Vert.A1 (Carl Zeiss, Jerman) menggunakan iluminator merkuri HBO 100 (Burner Mercury) untuk eksitasi dan set filter fluoresen TexasRed 45 HQ (d = 25 bebas pergeseran (E), BP eksitasi 560/40, pemisah berkas FT 585, dan BP emisi 630/75) (Carl Zeiss, Jerman) untuk merekam fluoresensi. Gambar fluoresen diperoleh menggunakan lensa Carl Zeiss EC Plan-Neofluar100x/1.30 Oil Ph3 dan minyak imersi Immersol 518F (Carl Zeiss, Jerman). Gambar dianalisis dan diproses menggunakan perangkat lunak Zen (Carl Zeiss, Jerman) dan Image J 1.48 v (AS).
Karakteristik Fluoresensi Mikrokapsul Berkode QD
Karakteristik fluoresensi dari QD asli yang digunakan untuk pengkodean dan mikrokapsul yang disandikan QD dianalisis menggunakan pembaca pelat multimodal 200 PRO Tak Terbatas (TECAN, Swiss). Sebelum pengukuran, pelat dengan sumur yang berisi suspensi mikrokapsul dan mikrosfer berkode QD disentrifugasi menggunakan sentrifugasi 5810 R (Eppendorf, USA) dengan rotor -2-DWP pada 2630×g selama 20 mnt. Maksimal fluoresensi QD dan QD bebas yang tertanam dalam cangkang polimer mikrokapsul polielektrolit ditentukan pada panjang gelombang eksitasi 480 nm; mode pemindaian bawah digunakan untuk analisis sampel.
Flow Cytometry
Sitometer aliran FACSCanto II (Becton Dickinson, USA) yang dilengkapi dengan laser argon biru (488 nm) sebagai sumber eksitasi digunakan untuk menganalisis sampel mikropartikel kalsium karbonat asli, mikropartikel dengan cangkang polielektrolit yang mengandung QD, dan Mikrokapsul berongga yang dikodekan QD. Kami menganalisis 0,5 mL alikuot dari suspensi yang mengandung 10
6
microbeads/mikrokapsul; jumlah peristiwa yang dikumpulkan adalah 2500. Intensitas fluoresensi dicatat dalam saluran cahaya hamburan maju (FSC), cahaya hamburan samping (SSC), dan fikoeritrin (PE, 585/42 nm) standar. Data diproses menggunakan perangkat lunak FACSDiva (Becton Dickinson, USA).
Materi
Kami menggunakan turunan tiol karboksilasi dari PEG yang mengandung spacer PEG 12-monomer (Thermo Fisher Scientific, USA), poli(allylamine hidroklorida) (PAH) dengan Mw ≈ 15.000 Da (Sigma-Aldrich, Jepang), poli(natrium 4-stirenasulfonat) (PSS) dengan Mw ≈ 70.000 Da (Sigma-Aldrich, AS), dan asam poliakrilat (PAA) dengan Mw ≈ 15.000 Da (Sigma-Aldrich, AS). Natrium karbonat, kalsium klorida, asam etilendiamintetraasetat dinatrium garam dehidrasi, bovine serum albumin (BSA), media embedding epoksi, dan reagen lainnya berasal dari Sigma-Aldrich (USA). Semua solusi kerja disiapkan menggunakan air MilliQ (18,2 mΩ cm) yang diperoleh melalui sistem pemurnian air Direct-Q (Millipore, Prancis) dan disaring melalui filter dengan ukuran pori 0,22 μm.
Analisis Statistik
Paket perangkat lunak MS Office Excel 2007 dan Origin Pro 2015 digunakan untuk analisis statistik data. Hasilnya disajikan sebagai rata-rata dan simpangan baku untuk tiga percobaan independen.
Hasil dan Diskusi
Pengembangan Mikrokapsul Polielektrolit Berkode QD
Kami menggunakan teknik deposisi lapis demi lapis untuk mendapatkan agen bioimaging dalam bentuk mikropartikel fluoresen yang dikodekan QD karena metode yang disarankan tidak memerlukan pelarut organik, memungkinkan penggunaan polimer biokompatibel [23, 24], dan memastikan imobilisasi yang efisien dari QD dalam cangkang polimer [21]. Pembuatan mikrokapsul polielektrolit fluoresen yang dikodekan secara optik dengan QD yang dimodifikasi permukaan yang larut dalam air terdiri dari penerapan lima lapisan polielektrolit yang bermuatan berlawanan ke permukaan mikropartikel kalsium karbonat yang berfungsi sebagai matriks sebagai langkah pertama, diikuti dengan pengkodean cangkang polielektrolit dengan negatif QD bermuatan, melapisi lapisan QD dengan lapisan pelindung polielektrolit bermuatan berlawanan, pelarutan matriks inti mikropartikel, dan, akhirnya, modifikasi permukaan mikrokapsul dengan BSA (Gbr. 1). Muatan permukaan negatif dari mikropartikel kalsium karbonat memastikan adsorpsi PAH karena interaksi elektrostatik polikation dengan permukaan mikropartikel. Potensi positif dari permukaan yang dihasilkan dari adsorpsi PAH ke partikel memungkinkan penerapan polianion PSS selanjutnya, serta QD yang dimodifikasi dengan HS-PEG12 -COOH, yang juga memiliki muatan permukaan negatif karena gugus karboksil dan, karenanya, dapat diadsorbsi ke lapisan polikation PAH. Penyematan QD dalam membran polielektrolit polimer dilakukan dengan menerapkan lapisan penutup polielektrolit tambahan (setidaknya empat hingga enam di antaranya), seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1a, b.
Desain dan struktur mikrokapsul polielektrolit yang dikodekan dengan titik kuantum (QD):a Diagram skema dari susunan lapisan dalam membran mikrokapsul polimer. b Perubahan -potensial permukaan mikropartikel kalsium karbonat selama pelapisan elektrolit polimer dan pengkodean QD. c Mikrofotograf fluoresen dari mikrokapsul polielektrolit yang dikodekan dengan CdSe/ZnS QD yang dilarutkan dengan HS-PEG12 -COOH. * Potensi dari permukaan mikrokapsul setelah inti dikeluarkan; ** tahap tambahan dalam pembuatan mikrokapsul polielektrolit berkode QD dengan permukaan yang dimodifikasi BSA
Mikrokapsul berongga yang mengandung QD amobil dalam membran polimernya diperoleh dengan melarutkan mikropartikel kalsium karbonat dengan EDTA 0,2 M (pH 6,5) dan pembentukan kompleks garam kalsium yang larut dalam air dari asam etilendiamintetraasetat, yang difusi melalui membran polimer menghasilkan pembentukan rongga di dalam mikrokapsul. Untuk mendapatkan mikrokapsul polielektrolit yang dikodekan QD dengan permukaan yang dimodifikasi BSA, polianion PAA dilapisi ke lapisan ke-11 dari polikation PAH. PAA digunakan karena nilai konstanta disosiasinya pada interaksi dengan permukaan mikrokapsul. Nilai pKa PAA (pKa ≈ 4.7) lebih rendah dan, karenanya, lebih asam dibandingkan dengan PSS (pKa ≈ 7.5) [25, 26], yang menghasilkan potensi yang lebih tinggi dari permukaan mikrokapsul. Muatan permukaan yang dimodifikasi PAA memfasilitasi adsorpsi pasif BSA karena interaksi elektrostatik antara BSA dan PAA. Namun, perakitan antara PAA dan BSA menghasilkan penurunan muatan permukaan negatif mikrokapsul (Gbr. 1b). Setelah deposisi BSA ke permukaan mikrokapsul, terjadi pelindungan lapisan PAA bermuatan negatif oleh gugus amino positif elektrostatis BSA, oleh karena itu, potensi dari mikrokapsul berkode QD berlapis BSA kemungkinan besar ditentukan oleh perilaku elektrostatik BSA sebagai lapisan luar mikrokapsul [26].
QD PEGylated yang larut dalam air dicirikan oleh distribusi ukuran yang sempit, tidak adanya agregasi dalam dispersi, dan stabilitas koloid yang tinggi. Ini kemungkinan untuk memastikan adsorpsi QD yang homogen pada permukaan microbead dan memfasilitasi pengkodean yang efektif dan, karenanya, memperoleh mikrokapsul fluoresen terang (Gbr. 1c).
Penggunaan protein, seperti BSA, untuk modifikasi permukaan membuat mikrokapsul polimer lebih biokompatibel dan lebih tahan terhadap adhesi satu sama lain. Ini juga memastikan pasivasi sementara permukaan mikrokapsul, yang penting untuk studi selanjutnya dari mikrokapsul yang dibentuk oleh kompleks interpolimer PAH-PSS atau PAH-PAA dalam hal interaksi in vitro dengan sel dan perilaku in vivo [27,28,29] .
Mikrokapsul berkode QD yang diperoleh berbentuk bulat (Gbr. 1c) dan dicirikan oleh distribusi ukuran yang sempit (Gbr. 2) dengan ukuran rata-rata 4,45 ± 0,65 μm. Ukuran ini sebanding dengan sel darah merah, bahkan lebih kecil dari itu [30]. Selain itu, seperti yang ditunjukkan sebelumnya, membran polimer mikrokapsul adalah struktur fleksibel yang rentan terhadap deformasi. Disuntikkan secara intravena, mikrokapsul dengan ukuran ini tidak dapat menembus penghalang darah-jaringan, yang memungkinkan pengangkutan dan distribusi mikrokapsul yang dikodekan secara optik dalam tubuh untuk dilacak [31, 32]. Namun, di lokalisasi dengan peningkatan permeabilitas dinding pembuluh darah, misalnya di daerah peradangan dan pertumbuhan tumor, mikrokapsul dapat menembus ke dalam ruang ekstravaskular, yang diharapkan untuk memastikan pencitraan dan pemantauan pengiriman yang ditargetkan [33,34,35 ,36].
Distribusi ukuran mikrokapsul polielektrolit yang dikodekan secara optik dengan titik kuantum, di mana jumlah mikrokapsul yang dianalisis adalah 600
Karakteristik Fluoresensi dan Struktur Mikrokapsul Polielektrolit Berkode QD
Mikrokapsul yang dibuat dicirikan oleh puncak fluoresensi pada panjang gelombang 590 nm, yang sesuai dengan QD asli yang larut dalam air yang digunakan untuk pengkodean optik mikrokapsul. Hal ini menunjukkan bahwa polielektrolit polimer yang membentuk membran mikrokapsul tidak mempengaruhi sifat fluoresen, khususnya maksimum fluoresen, dari QD dalam manik-manik mikro dan mikrokapsul yang dibuat darinya (Gbr. 3).
Pengaruh penggabungan titik kuantum (QD) ke dalam membran polimer manik-manik mikro (MCB) dan mikrokapsul (MCC) pada karakteristik fluoresensinya:Spektrum fluoresensi larutan QD yang mengandung 2,241 mg QD ditampilkan; ini sesuai dengan jumlah QD yang digunakan untuk pengkodean optik MCB
Gambar 4 menunjukkan histogram distribusi untuk intensitas sinyal dari populasi mikrokapsul yang disandikan QD, serta mikrokapsul plasebo, di saluran fluoresensi PE (575/25 nm) dan FSC-A dan SSC-A (488/10 nm ) saluran dari flow cytometer. Data menunjukkan diferensiasi efektif antara plasebo dan mikrokapsul yang dikodekan secara optik di saluran PE (575/25 nm) (Gbr. 4a, b). Intensitas sinyal fluoresensi dari mikrokapsul di saluran PE (575/25 nm) adalah ~ 10
4
, yang menunjukkan kapasitas fluoresensi tinggi dari mikrokapsul yang disandikan QD. Dalam saluran FSC-A dan SSC-A (488/10 nm), distribusi untuk dua populasi mikrokapsul tumpang tindih, yang menunjukkan ukuran relatif dan parameter granularitas dari plasebo dan mikrokapsul yang disandikan (Gbr. 4c, d) dan, karenanya , homogenitas populasi. Rupanya, ini disebabkan oleh fakta bahwa membran mikrokapsul terdiri dari jumlah lapisan polimer yang sama, membran mikrokapsul yang dikodekan hanya mengandung satu lapisan QD. Dengan demikian, mikrokapsul yang diperoleh dicirikan oleh distribusi ukuran yang homogen dan karakteristik fluoresensi optimal yang memastikan deteksinya di saluran yang sesuai dari flow cytometer.
Deteksi mikrokapsul polielektrolit yang disandikan QD dengan flow cytometry:a profil dot-plot mikrokapsul di saluran SSC-PE; b histogram distribusi mikrokapsul pada saluran PE; c profil dot-plot mikrokapsul di saluran SSC-FSC; d histogram distribusi mikrokapsul pada saluran FSC. Mikrokapsul bebas QD (plasebo) digunakan sebagai kontrol dan ditampilkan dalam warna abu-abu, sedangkan yang dikodekan dengan titik kuantum CdSe/ZnS (emisi fluoresensi maksimum pada 590 nm) ditampilkan dalam warna oranye. Jumlah peristiwa yang dianalisis sama dengan 2500. Plot titik dan sumbu histogram ditampilkan sebagai SSC-A, FSC-A, PE-A, di mana A berarti data diwakili oleh area sinyal
Mikrofotograf dari bagian mikrokapsul polielektrolit yang disandikan QD yang ditunjukkan pada Gambar 5 menunjukkan bahwa mikrokapsul berongga, sinyal fluoresen terang yang terdeteksi dipancarkan oleh membran polimer yang mengandung QD. Data ini mengkonfirmasi efisiensi prosedur yang digunakan untuk melarutkan inti dan menunjukkan sinyal fluoresensi cerah dari mikrokapsul yang dibuat, yang dapat dideteksi menggunakan filter yang sesuai, Texas Red dan PE dalam kasus mikroskop fluoresensi dan sitometri aliran, masing-masing. Mikrokapsul polielektrolit yang mengandung QDs dalam cangkang polimernya memiliki sifat fluoresen yang lebih tinggi dibandingkan dengan mikrokapsul polielektrolit yang diberi label dengan pewarna konvensional seperti fluorescein isothiocyanate (FITC) atau aminofluorescein [14, 37]. Jika tidak, mikrokapsul yang dikodekan dengan QD menggunakan pendekatan lapis demi lapis memiliki kecerahan yang sebanding atau bahkan lebih rendah daripada mikrokapsul yang dikodekan dengan pewarna organik menggunakan teknik pembengkakan. Kecerahan ditentukan oleh produk koefisien kepunahan dan hasil kuantum. Hasil kuantum QD yang larut dalam air pada suhu kamar adalah sekitar 40%, yang sebanding dengan pewarna organik [22, 38, 39], sedangkan kepunahan QD hampir 100 kali lebih besar daripada untuk pewarna organik. Jika tidak, karena ukuran QD yang besar, kuantitasnya di dalam cangkang mikrokapsul mungkin tidak dapat dibandingkan dengan molekul pewarna organik. Jadi, jumlah pengkodean molekul pewarna organik dapat dibuat jauh lebih unggul daripada untuk QD sehingga memastikan kecerahan yang sebanding. Dari sisi lain, pengkodean mikrokapsul dengan QD memberikan keuntungan komparatif yang penting seperti tidak adanya photobleaching. Selain itu, QD dengan warna (ukuran) yang berbeda dapat dieksitasi dengan eksitasi panjang gelombang yang sama. Jadi, penggunaan QD warna yang berbeda untuk pengkodean mikrokapsul dapat memberikan jumlah kode optik yang diselesaikan secara spektral secara praktis tidak terbatas [21].
Microphotographs bagian dari mikrokapsul polielektrolit dikodekan dengan titik-titik kuantum. Panah di (a ) menunjukkan area yang ditunjukkan dalam (b , c ) pada perbesaran yang lebih tinggi
Kesimpulan
Teknik yang dikembangkan untuk mendapatkan mikrokapsul polielektrolit yang disandikan QD memastikan pengkodean optik yang efektif. Mikrokapsul polimer yang dibuat dicirikan oleh distribusi ukuran yang optimal dan intensitas fluoresensi yang tinggi untuk digunakan untuk deteksi yang efisien oleh sitometer aliran komersial dan mikroskop confocal. Oleh karena itu, mikrokapsul yang dirancang adalah agen fluoresen potensial untuk bioimaging in vitro dan in vivo. Pengembangan lebih lanjut dari platform berbasis mikrokapsul serbaguna akan ditujukan untuk proposisi alat bioimaging dan theranostic baru berdasarkan mikropartikel berkode QD fluoresen yang responsif terhadap rangsangan fisik atau kimia eksternal yang berbeda bersama dengan fotoeksitasi.
