Penangkap Cepat Escherichia coli pada Konsentrasi Sangat Rendah Menggunakan Nanopartikel Magnetik Bermuatan Listrik Positif

Abstrak

Deteksi bakteri yang cepat dan bebas kultur esensial untuk pengendalian wabah tepat waktu. Nanopartikel magnetik bermuatan positif (NP⁺) mengeksploitasi muatan permukaan negatif alami sel bakteri, memungkinkan penangkapan Escherichia coli yang efisien pada konsentrasi seendah 10 dan 100 CFU/mL dalam satu jam. Efisiensi penangkapan melebihi 90% sesuai dengan perhitungan pembentukan koloni (CFU). Mikroskopi elektron transmisi (TEM) dan pencitraan optik mengonfirmasi ikatan yang kuat NP⁺ pada permukaan bakteri, sedangkan partikel bermuatan negatif (NP⁻) menunjukkan afinitas yang tidak signifikan. Hasil ini menunjukkan bahwa tarik tolak elektrostatis dapat memberikan platform penangkapan bakteri luas spektrum yang bebas ligand.

Latar Belakang

Penyakit menular tetap menjadi prioritas kesehatan global teratas, dan kontaminasi bakteri air yang berasal dari air merupakan risiko signifikan. E. coli, patogen gram-negatif umum, sering muncul pada tingkat rendah dalam air dan makanan yang terkontaminasi, sehingga deteksi sulit. Metode berbasis kultur tradisional memakan waktu, dapat melewatkan sel viable‑but‑non‑culturable (VBNC), dan menunda intervensi kritis. Teknik pemisahan magnetik yang cepat menawarkan solusi yang cepat, dapat diskalakan, dan dapat diotomatisasi untuk pengangkatan dan deteksi bakteri. Namun, sebagian besar sistem magnetik bergantung pada ligand spesifik, yang dapat membatasi cakupan penangkapan dan memerlukan optimisasi yang luas.

Muatan permukaan negatif intrinsik sel bakteri, pertama kali didokumentasikan oleh Bechhold pada 1904, mendasari interaksi elektrostatis dengan nanomaterial bermuatan positif. Pekerjaan terbaru (Cohen et al., 2011) telah menunjukkan bahwa sel E. coli individu menunjukkan spike listrik, yang memperkuat peran potensi membran dalam interaksi permukaan sel. Memanfaatkan properti ini, kami merakit nanopartikel magnetik yang difungsionalkan poli(etilenimina) (PEI) untuk menangkap bakteri di seluruh rentang konsentrasi yang luas tanpa ketergantungan pada ligand.

Bahan dan Metode

Nanomaterial

Reagen diperoleh dari Shanghai Reagent Company dan Sigma‑Aldrich (AS). Semua larutan disiapkan dalam air deionisasi Milli‑Q (18,2 MΩ cm). PEI bercabang (Mw = 10.000, 99%) dibeli dari Alfa Aesar.

Sintesis NP

Inti Fe₃O₄ disintesis dengan reaksi solvothermal pada 200 °C selama 12 jam. Lapisan silika dibentuk melalui hidrolisis TEOS, diikuti dengan penggrafan kompleks APTES–TRITC untuk memberikan fluoresensi. NP bermuatan negatif (NP⁻) dihasilkan dengan mempertahankan permukaan APTES; partikel bermuatan positif (NP⁺) dihasilkan dengan melapisi NP⁻ dengan PEI, menghasilkan amina permukaan yang melimpah.

Karakterisasi NP

TEM (300 kV) mengonfirmasi morfologi inti–lapis dan diameter ~450 nm. Pencaharan cahaya dinamis (DLS) mengukur diameter hidrodinamis 620 nm (NP⁺) dan 700 nm (NP⁻). Analisis potensial zeta mengungkapkan −26,6 mV untuk NP⁻ dan +28,1 mV untuk NP⁺ dalam buffer netral, yang menunjukkan dispersi yang stabil yang cocok untuk penangkapan bakteri.

Persiapan Bakteri

Strain BL21 E. coli dikultur dalam medium LB pada 37 °C, 200 rpm selama 16 jam. Setelah deret pelarutan dan penanaman, perhitungan CFU diperoleh. Sel dipanen dengan sentrifugasi, dicuci dalam PBS, dan disuspendasi kembali pada ~1 × 10³ CFU/mL. Semua penanganan mematuhi protokol biosafety level 2.

Eksperimen Penangkapan Bakteri

Dalam suspensi PBS 1 mL, 40 µg NP⁺ atau NP⁻ dicampur dengan bakteri dan diinkubasi selama 10 min pada suhu ruang. Magnet permanen menarik sel yang terikat NP ke dinding tabung, setelahnya sel yang tidak terikat dicuci. Bakteri yang tertangkap dilepaskan dengan menghapus magnet dan disuspendasi kembali untuk analisis selanjutnya.

Efisiensi Penangkapan Bakteri NP pada Konsentrasi Berbeda

Efisiensi penangkapan dikuantifikasi dengan menanam total solusi dan menghitung CFU. Eksperimen berkisar dari 5 hingga 100 µg/mL NP⁺ atau NP⁻ dengan beban bakteri 2 × 10² CFU/mL.

Kemampuan NP untuk Menangkap Bakteri pada Konsentrasi Rendah

Untuk menilai kinerja level ultra‑rendah, 40 µg NP⁺ atau NP⁻ diinkubasi dengan 1 mL PBS yang mengandung 10 atau 100 CFU/mL E. coli. Efisiensi penangkapan kembali ditentukan dengan perhitungan CFU.

Analisis Statistik

Data dinyatakan sebagai mean ± SD. ANOVA dua arah dengan uji pasca‑hoc (GraphPad Prism) menentukan signifikansi pada p < 0,05.

Hasil

Karakterisasi NP Magnetik

Skema dalam Gambar 1 menggambarkan pembuatan bertahap NP⁻ dan NP⁺. Citra TEM mengonfirmasi lapisan SiO₂ seragam (~60 nm) di sekitar inti Fe₃O₄ ~450 nm. DLS menunjukkan distribusi ukuran yang sempit; data potensial zeta mengonfirmasi fungsionalisasi permukaan yang berhasil (Gambar 2).

Kemampuan NP Magnetik untuk Menangkap E. coli

Gambar 3 menggambarkan alur kerja penangkapan: inkubasi NP–bakteri, tarikan magnetik, pencucian, dan peluasan. NP⁺ dengan cepat mengkaya E. coli, sedangkan NP⁻ menunjukkan ikatan yang tidak signifikan (Gambar 3).

Pencitraan optik (Gambar 4) menunjukkan NP⁻ sebagai monodisperse, sedangkan NP⁺ mengagregasi, yang mencerminkan mode interaksi yang berbeda. Mikroskopi fluoresensi mengonfirmasi kolokalisasi NP⁺ berlabel TRITC dengan E. coli yang diwarnai DAPI (Gambar 5a). TEM mengungkapkan agregasi NP⁺ yang luas pada dinding sel bakteri (Gambar 5b), yang menggarisbawahi afinitas elektrostatis yang kuat.

Deteksi Konsentrasi Rendah E. coli

Peningkatan dosis NP⁺ dari 5 hingga 100 µg/mL menghasilkan efisiensi penangkapan yang bergantung pada dosis (Gambar 6). Pada 40 µg/mL, NP⁺ mencapai efisiensi 81% (p < 0,001), sedangkan NP⁻ hanya menangkap 12% bahkan pada 100 µg/mL.

Pada beban ultra‑rendah (10 dan 100 CFU/mL), NP⁺ secara konsisten memulihkan >90% sel (Gambar 7), sedangkan NP⁻ memulihkan <4%. Hasil ini memvalidasi kemampuan penangkapan elektrostatis yang unggul NP⁺.

Pembahasan

Bakteri gram-negatif dan gram-positif menunjukkan tarik tolak elektrostatis yang kuat terhadap permukaan bermuatan positif. NP⁺ yang difungsionalkan PEI menawarkan grup amina yang melimpah, menghasilkan muatan permukaan +28,1 mV yang memfasilitasi ikatan cepat bahkan pada <10² CFU/mL. Studi ini menunjukkan protokol sederhana satu jam yang menangkap E. coli pada 10 CFU/mL—di bawah batas deteksi metode pengayaan konvensional.

Efisiensi penangkapan yang bergantung pada muatan jelas terlihat: NP⁺ mencapai efisiensi hingga 81% pada 40 µg/mL, sedangkan NP⁻ tetap tidak efektif. Citra TEM mengonfirmasi agregasi NP⁺ yang besar pada permukaan bakteri, yang menunjukkan bahwa ukuran dan muatan permukaan secara sinergis meningkatkan penangkapan.

Meskipun sel gram‑positif dan gram‑negatif berbeda secara struktural, keduanya mempertahankan muatan permukaan bersih negatif pada pH fisiologis karena lipopolisakarida atau teikoat asam. NP⁺ yang lebih besar (>600 nm) menyediakan efek “sponge”—luas permukaan yang lebih besar memfasilitasi interaksi elektrostatis yang lebih luas, sedangkan partikel yang lebih kecil mungkin terbatas oleh cakupan permukaan yang berkurang. Jadi, desain kami memprioritaskan efisiensi penangkapan daripada aktivitas antimikroba.

Kesimpulan

NP magnetik yang dilapisi PEI menawarkan metode yang cepat dan bebas ligand untuk menangkap dan menganalisis E. coli pada konsentrasi ultra‑rendah. Pendekatan ini menghasilkan pemulihan tinggi (>90%) dalam satu jam, dan bakteri yang tertangkap dapat dengan mudah dicitrakan dengan pencitraan optik dan TEM. Platform ini dapat disesuaikan dengan berbagai patogen bakteri, yang memungkinkan diagnostik cepat dan dekontaminasi dalam lingkungan klinis dan lingkungan.