Pengosongan Nanopartikel Logam oleh Sel Kalis: Jalur In Vivo yang Dipercepat oleh Diare Induksi Ekstrak Obat Tradisional Cina

Abstrak

Meskipun nanopartikel logam banyak digunakan dalam medis, pengosongan in vivo-nya masih kurang dipahami. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa sel kalis usus (GC) dan sel dinding perut (PC) secara aktif mengangkut berbagai nanopartikel logam—nanoplit segitiga perak, nanopartikel magnetis, nanoroda emas, dan kluster emas—ke dalam lumen usus, di mana mereka dikeluarkan melalui feses. Menggunakan model tikus dengan ligasi saluran empedu umum (CBD) untuk memblokir rute hepato-biliar, kami menunjukkan bahwa nanopartikel ini menumpuk di dalam GC di seluruh saluran usus dan, untuk nanoplit perak dan nanoroda emas, di dalam PC. Tidak terdapat perubahan patologis pada jaringan usus. Selain itu, laju pengosongan nanopartikel dari GC dan PC meningkat secara signifikan dalam model diare yang diinduksi oleh ekstrak obat tradisional Cina, yang menunjukkan efek modulasi gerakus gastrointestinal terhadap pengosongan nanopartikel. Temuan ini mengungkapkan rute pengosongan yang sebelumnya tidak dikenal dan dapat menginformasikan desain yang lebih aman terapeutik dan diagnostik berbasis nanopartikel.

Pendahuluan

Nanoteknologi telah berkembang pesat ke dalam farmasi, diagnostik, dan aplikasi industri, namun risiko kesehatan dan lingkungan dari struktur nanostruktur yang dirancang belum sepenuhnya ditetapkan. Nanotoksikologi, bidang multidisipiliner, bertujuat untuk memetakan interaksi antara nanopartikel dan sistem biologis, menilai potensi bahaya, dan menetapkan pedoman keamanan [1–3]. Nanopartikel logam—seperti emas, perak, magnetis, dan varian titik kuantum—menarik minat khusus karena properti optik, magnetik, dan katalitiknya, yang memungkinkan imaging terpadu, terapi fototermal, dan pengiriman obat [4–10]. Namun, sifat fisikokimia yang sama yang memberikan fungsionalitas pada bahan ini juga menghambat biodegradasi dan pengosongan; sebagian besar partikel lebih besar dari ~5 nm menghindari filtrasi ginjal, sementara perakitan yang lebih besar terperangkap dalam jaringan hati, tihi, atau paru-paru [11–12]. Akibatnya, memahami bagaimana tubuh mengeluarkan partikel ini sangat penting untuk keamanan terapeutik dan penilaian risiko.

Pengetahuan saat ini tentang jalur pengosongan in vivo masih terpencar. Sistem hepato-biliar (HBS) mengirimkan partikel yang tidak dapat diurai oleh ginjal ke feses, sementara rute ginjal-urine menangani spesies di bawah 5 nm [16,21,22]. Namun, kedua rute ini menunjukkan efisiensi terbatas untuk banyak nanopartikel logam, yang mendorong investigasi mekanisme alternatif. Studi terbaru menunjukkan bahwa dinding usus dapat berfungsi sebagai rute pengosongan: nanopartikel silika ditunjukkan menumpuk dalam mukosa usus dan feses dalam model tikus, sedangkan partikel yang lebih besar (hingga 500 nm) terosong lebih cepat daripada partikel yang lebih kecil pada ikan, yang menunjukkan bahwa HBS bukanlah jalur tunggal [20,23].

Sel kalis usus (GC) adalah sel epitel berpolisasi yang mengeluarkan lendir yang menaburi seluruh saluran usus dan melindungi dari cedera mekanis dan kimia [24–26]. Kerja sebelumnya telah menunjukkan bahwa GC dapat internalisasi nanopartikel dan partikel yang diinjeksikan secara intravenus dapat ditemukan di dalam GC, namun dinamika dan tingkat proses ini belum terjelajahi [27–28]. Penelitian ini bertujuan untuk menguraikan peran GC—dan dalamukuran yang lebih kecil, sel dinding perut (PC)—dalam pengosongan sekelompok representatif nanopartikel logam, dan untuk menilai bagaimana gerakus gastrointestinal, yang dimodulasi oleh model diare yang diinduksi oleh obat tradisional Cina, mempengaruhi jalur ini.

Bahan dan Metode

Sintesis dan Karakterisasi Nanoplit Segitiga Perak

Nanoplit segitiga perak disintesis mengikuti protokol Mirkin et al. dengan penyesuaian kecil [29,30]. Singkatnya, AgNO₃ (0,1 mM, 100 mL), sitrat natrium (30 mM, 6 mL), PVP (30 kDa, 0,7 mM, 6 mL), dan 240 µL H₂O₂ (30 wt %) dicampur pada suhu ruang. Setelah diaduk dengan kuat, 0,8 mL NaBH₄ 0,1 M yang baru disiapkan ditambahkan dengan cepat, menghasilkan larutan kuning yang berubah menjadi biru dalam 5 jam di bawah paparan cahaya. Suspensi akhir disimpan pada 4 °C.

Spektra UV-vis direkam (200–950 nm, slit 2 nm) menggunakan Shimadzu UV-3600. Citra TEM (JEOL JEM-200CX) mengonfirmasi partikel segitiga monodisperse dengan panjang tepi rata-rata 44,3 nm (Fig. 1b). Puncak plasmon karakteristik pada 648,5 nm menunjukkan sintesis morfologi segitiga yang berhasil [36].

Persiapan Model Hewan dengan Ligasi Saluran Empedu Umum

Tikus Wistar betina (180–220 g) dan tikus Kunming (20–22 g) diperoleh dari Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. Semua prosedur disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium Universitas Jiao Tong Shanghai (No.SYXK2007‑0025). Saluran empedu umum (CBD) diligasi mengikuti metode Lee dengan modifikasi kecil [34]. Tikus dianestesi dengan pentobarbital (25 mg kg⁻¹), insisi perut pertengahan dibuat, dan CBD diekspos. Dua sutur nylon 0,2 mm ditempatkan di bawah saluran, menciptakan segmen yang terkemas yang kemudian ditranseksi. Pada hari 14 setelah ligasi, bilirubin serum dan AST diukur untuk mengonfirmasi kolestasis (Fig. 2e).

Injeksi Nanopartikel

Setelah konfirmasi ligasi yang berhasil, 12 tikus dibagi secara acak ke dalam empat grup uji (nanoplit segitiga perak, nanopartikel magnetis, nanoroda emas, kluster emas) dan kontrol salin. Nanopartikel disuspendi pada 550 µg mL⁻¹ dan di sonikasi selama 1 menit sebelum injeksi intravenus (150 µL, vena ekor). Lima tikus tambahan tanpa ligasi berfungsi sebagai kontrol kedua.

Pengolahan Jaringan dan Citra

Tujuh hari setelah injeksi, tikus diutanasi, dan jaringan usus serta perut dipanen. Selang (5 µm) diperbaiki dalam formaldehida 10 %, diembed dalam parafin, dan diwarnai dengan hematoksin-eosin untuk histologi. Untuk analisis ultrastruktur, jaringan diperbaiki dalam gluteraldehida 2,5 %, disusutkan, diembed dalam hars epoksi, dan diperiksa dengan TEM resolusi tinggi (FEI Tecnai G2 Spirit Biotwin). Pengambilan dua foton (780 nm) digunakan untuk memvisualisasikan nanoroda emas dalam selang jaringan melalui sistem Caliper IVIS-100.

Pengukuran Logam

Feses dikumpulkan setiap hari selama 7 hari, ditimbang, dan dicerna dalam aqua regia. Konten logam diukur dengan ICP-MS (Agilent 7500a). Demikian pula, jaringan usus dicerna dan dianalisis untuk konten emas untuk menilai retensi.

Model Diare yang Diinduksi oleh Obat Tradisional Cina

Campuran daun sen (10 g), ruibar (2 g), dan biji ganja (1 g) direbus dalam 100 mL air, difilter, dan dikonsentrasi menjadi 0,3 g mL⁻¹. Tikus menerima 0,1 mL ekstrak ini atau salin setiap hari selama 7 hari melalui sonde oral untuk menginduksi diare.

Analisis Sel Kalis

Segmen usus diembed dalam OCT, diiris (8 µm), dan diwarnai dengan Alcian Blue/Schiff's reagent untuk mengukur kepadatan sel kalis dan kavitasi. Citra ditangkap dengan mikroskop terbalik.

Hasil dan Pembahasan

Sintesis dan Karakterisasi Nanopartikel

Nanoplit segitiga perak menampilkan puncak SPR yang kuat pada 648,5 nm dan distribusi ukuran yang sempit (panjang tepi rata-rata 44,3 nm), mengonfirmasi sintesis yang berhasil (Fig. 1a–c). Nanopartikel magnetis (20 nm) dan kluster emas (5 nm) disiapkan mengikuti protokol yang telah ditetapkan [31–33]. Nanoroda emas menunjukkan resonansi plasmon longitudinal yang diharapkan di daerah inframerah dekat.

Validasi Model Ligasi CBD

Ligasi CBD menghasilkan perlebaran saluran yang mencolok dan peningkatan level TBIL dan AST serum dibandingkan kontrol sham (Fig. 2d–e), mengonfirmasi isolasi yang efektif dari rute hepato-biliar dan induksi kolestasis.

Dampak Histologis Nanopartikel

Pewarnaan hematoksin-eosin tidak mengungkapkan inflamasi atau kerusakan epitel yang signifikan dalam grup uji apa pun dibandingkan kontrol (Fig. 3). Ini menunjukkan bahwa nanopartikel yang diberikan tidak mengkompromikan integritas rintangan usus.

Lokasi Nanopartikel dalam Sel Kalis

Citra TEM menunjukkan bahwa nanoplit segitiga perak ada di dalam GC di seluruh usus tenue, ileum, dan usus besar, sering dalam keadaan agregat dan terdispersi (Fig. 4). Distribusi yang serupa diamati untuk nanopartikel magnetis, kluster emas, dan nanoroda emas (File Tambahan S4–S6). Agregasi kemungkinan mencerminkan konsentrasi lokal yang tinggi, sedangkan dispersi sesuai dengan pemuatan yang lebih rendah.

Pengukuran ICP-MS kuantitatif dari jaringan usus mengonfirmasi bahwa level logam lebih tinggi pada tikus yang dikaitkan CBD dibandingkan kontrol, sedangkan konten logam dalam feses secara signifikan berkurang dalam grup yang dikaitkan, menekankan kontribusi GC terhadap pengosongan (Fig. 8).

Mekanisme Transportasi ke dalam Sel Kalis

Nanopartikel terdeteksi dalam eritrosit yang beredar dan diamati melintasi dinding vaskular ke dalam lamina propria, di mana mereka memasuki GC (Fig. 5). Ini menunjukkan bahwa ukuran partikel dan kimia permukaan memungkinkan difusi pasif melalui membran endotel ke dalam lapisan mukosa.

Efek Diare terhadap Pengosongan Nanopartikel

Model diare meningkatkan kepadatan sel kalis dan proporsi sel yang berkavasi (Fig. 6), berkorelasi dengan pengosongan yang dipercepat nanopartikel dari GC. Pengambilan dua foton nanoroda emas mengungkapkan retensi jaringan yang lebih rendah dan konten emas feses yang lebih tinggi pada tikus diare dibandingkan kontrol yang dikaitkan (Fig. 7). Temuan ini menunjukkan bahwa gerakus gastrointestinal dapat memodulasi jalur pengosongan yang diatur oleh GC.

Pengosongan yang Ditindas oleh Sel Dinding Perut

Kluster emas dan nanoplit perak juga terdeteksi di dalam sel dinding perut (PC) (Fig. 9). Meskipun tingkat keterlibatan PC tampak lebih kecil daripada GC, data ini menunjukkan bahwa PC dapat memberikan rute pengosongan tambahan untuk beberapa tipe nanopartikel.

Kesimpulan

Penelitian kami mendirikan jalur pengosongan yang sebelumnya tidak dikenal, yang diatur oleh GC dan PC, untuk pengosongan berbagai macam nanopartikel logam in vivo. Dengan meligasi CBD, kami mengisolasi jalur ini dari HBS dan menunjukkan bahwa nanopartikel secara aktif diangkut dari sirkulasi ke dalam lumen usus melalui GC, dengan PC berkontribusi pada pengosongan perut. Pentingnya, diare yang diinduksi oleh ekstrak obat tradisional Cina secara substansial mempercepat proses ini, menyoroti potensi untuk memanipulasi gerakus gastrointestinal untuk meningkatkan pengosongan nanopartikel. Wawasan ini membuka jalan untuk desain yang lebih aman terapeutik berbasis nanopartikel, pelacakan in vivo yang ditingkatkan, dan penilaian biosafety yang lebih akurat.

Singkatan

CBD

Saluran empedu umum

GCs

Sel kalis

GNRs

Nanoroda emas

HBS

Sistem hepato-biliar

PCs

Sel dinding perut

TEM

Mikroskopi transmisi elektron

ICP-MS

Spektrometri massa plasma terhubung secara induktif